结核分枝杆菌Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6融合基因DNA疫苗株的构建及免疫原性研究

目的构建结核分枝杆菌Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA候选疫苗株并鉴定,初步评价其免疫原性。方法从GenBank中获取M. tuberculosis H37Rv的Ag85B、ESAT6和Hsp65基因序列优化后合成,经PCR、酶切、连接与真核表达载体PVAX1重组,构建重组质粒PVAX1-Hsp65-Ag85B和PVAX1-Hsp65-ESAT6。重组质粒体外转染验证其表达后,免疫C57BL/6小鼠,检测特异性细胞免疫应答反应。结果 Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA疫苗株在体内外均能表达,Western blot结果显示,DNA疫苗株体外转染293T细胞,24 h可检测到特异性蛋白条带,48 h蛋白表达量达最高。小鼠体内实验表明,Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA疫苗株均可激发较强的免疫反应,可诱导机体产生分泌高水平TNF-α的Th型免疫应答,且Hsp65-Ag85B优于Hsp65-ESAT6。结论 Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA疫苗株均具有较强的免疫原性,呈Th型细胞介导的免疫应答,推测Hsp65-Ag85B DNA疫苗的保护效力优于Hsp65-ESAT6,为新型结核DNA疫苗研制提供了实验依据。     

结核杆菌热休克蛋白—65重组质粒的构建及其在真核细胞中的初步表达

目的：构建结核杆菌热休克蛋白－65（HSP65）真核表达质粒,并探讨其在人肺癌细胞系A549中的表达,方法：用PCR的方法从结核杆菌H37Rv基因组中扩增出HSP65基因,并定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1( ）,构建成重组质粒pcDNA3.1-HSP65;然后用电穿孔的方法将质粒pcDNA3.1－65转染到A549细胞,经G418筛选后获得抗性细胞克隆;用RT－PCR的方法检抗性细胞中HSP65mRNA的表达,结果：经酶切鉴定和DNA序列测定证实重组质粒pcDNA3.1－HSP65构建正确;RT－PCR检测结果发现,重组质粒pcDNA3.1－HSP65转染的A549细胞总RNA中结核杆菌HSP65mRNA为阳性,结论：真核表达质粒pcDNA3.1－HSP65构建成功,并可在真核细胞A549细胞中稳定表达。     

结核杆菌热休克蛋白-65重组质粒的构建及其在真核细胞中的初步表达

目的构建结核杆菌热休克蛋白-65(HSP65)真核表达质粒,并探讨其在人肺癌细胞系A549中的表达. 方法用PCR的方法从结核杆菌H37Rv基因组中扩增出HSP65基因,并定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建成重组质粒pcDNA3.1-HSP65;然后用电穿孔的方法将质粒pcDNA3.1-HSP65转染到A549 细胞,经G418筛选后获得抗性细胞克隆;用RT-PCR的方法检抗性细胞中HSP65 mRNA的表达 . 结果经酶切鉴定和DNA序列测定证实重组质粒pcDNA3.1-HSP65构建正确;RT-PCR检测结果发现,重组质粒pcDNA3.1-HSP65转染的A549细胞总RNA中结核杆菌HSP65 mRNA为阳性. 结论真核表达质粒pcDNA3.1-HSP65构建成功 , 并可在真核细胞A549细胞中稳定表达.     

结核杆菌Ag85A/GM-CSF嵌合表达质粒的构建及表达

目的：探讨对结核病DNA疫苗进行基因修饰的新方法。方法：以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得结核杆菌Ag85A抗原蛋白基因的成熟肽编码区，以经PHA诱导后的小鼠脾组织总RNA为模板，通过RT－PCR获得小鼠粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子的cDNA，将二者定向克隆入质粒pBK-CMV中构建含嵌合目的基因的重组质粒，转染培养的COS7细胞后检测嵌合目的基因的表达。结果：成功构建了小鼠粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子cDNA与结核杆菌Ag85A抗原基因的真核嵌合表达质粒，重组质粒能在COS7细胞中进行稳定表达。结论：本研究首次将细胞因子基因与结核杆菌免疫保护性抗原基因嵌合构建嵌合DNA疫苗，为进一步研究其在动物体内的免疫原性和免疫保护性奠定了基础。     

截短型人bid基因的克隆、表达和促凋亡作用的研究

目的 :探讨截短型bid(truncatedbid ,tbid)基因的表达对Hela细胞的促进凋亡活性。方法 :用RT PCR法克隆人全长bid基因 ,测序正确后 ,通过PCR截去编码N末端 6 0个氨基酸残基的基因 ,而获得tbid基因。将其克隆入含绿色荧光蛋白(GFP)基因的真核表达载体pIRES2 EGFP中 ,用脂质体法转染Hela细胞。通过荧光显微镜、电子显微镜观察和TUNEL检测法 ,检测目的基因的表达对转染细胞的形态及生长状况的影响。结果 :成功地构建了tbid基因的真核表达载体。以其转染Hela细胞后 ,tbid基因在细胞中得到表达 ,随后引起细胞荧光强度下降 ,生长状况不良甚至死亡。电镜观察及TUNEL检测的结果显示 ,许多细胞呈典型的凋亡特征。结论 :tbid基因的表达可促进Hela细胞的凋亡     

靶向沉默Mcl-1基因对感染不同毒力结核杆菌小鼠腹腔巨噬细胞凋亡的影响

 目的: 通过RNA干扰技术特异性沉默 Mcl-1 基因,探讨下调 Mcl-1 基因对感染不同毒力结核杆菌小鼠腹腔巨噬细胞凋亡的影响。方法: 分别用制备好的新疆地区流行的优势强毒结核分枝杆菌临床分离株(简称强毒株)、结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv(简称H37Rv)、结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra(简称H37Ra)和卡介苗(BCG)菌悬液感染BALB/c小鼠,再以筛选并构建好的Mcl-1-shRNA作用于感染的小鼠模型,同时设立相应对照组,于作用后1 d、3 d、5 d和7 d提取小鼠腹腔巨噬细胞,应用实时荧光定量PCR和Western blot检测各组小鼠腹腔巨噬细胞中Mcl-1 mRNA和蛋白的表达;应用流式细胞术检测各组巨噬细胞的凋亡水平。结果: 小鼠被不同毒力的结核杆菌感染后其腹腔巨噬细胞中Mcl-1 mRNA和蛋白的表达水平均有不同程度的升高,其中以感染了强毒株和H37Rv的腹腔巨噬细胞升高最为明显(P<0.05);应用RNA干扰技术沉默 Mcl-1 基因后,Mcl-1 mRNA和蛋白的表达水平明显低于对照组(P<0.05);流式细胞术分析显示,下调 Mcl-1 基因的表达可诱导小鼠腹腔巨噬细胞凋亡。结论: 应用Mcl-1-shRNA可有效沉默 Mcl-1 在感染了不同毒力结核杆菌小鼠腹腔巨噬细胞中的表达,并能上调巨噬细胞的凋亡水平。     

P3启动子调控融合基因质粒构建及在肝癌细胞中表达(英文)

目的：构建人胰岛素样生长因子Ⅱ基因（IGF-Ⅱ）P3启动子驱动单纯疱疹病毒胸苷激酶（tk）与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合基因穿梭质粒，观察其在肝癌细胞系HepG2及宫颈癌细胞系HeLa细胞中的表达及其作用。方法：应用基因重组技术，构建IGF-Ⅱ P3启动子驱动EGFP与tk融合表达穿梭质粒载体，脂质体转染技术将其转入HepG2及HeLa中，48 h后荧光显微镜下观察荧光表达,RT-PCR法检测tk和EGFP mRNA表达，四甲基偶氮唑蓝（MTT）实验检测转染融合蛋白载体后给予不同浓度的GCV对HepG2及HeLa细胞毒作用。结果:酶切鉴定和测序分析证实重组质粒构建成功；转染此穿梭质粒的细胞中仅有HepG2细胞检测到绿色荧光；RT-PCR检测到tk和EGFP的mRNA仅在HepG2细胞中表达；GCV对转染了携此质粒载体的HepG2细胞有选择性细胞毒作用。结论:成功构建IGF-Ⅱ P3启动子驱动携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体，转染后对人肝癌细胞系HepG2有选择性杀伤作用，为进一步靶向性肝癌腺病毒基因治疗奠定了基础。     

结核杆菌免疫保护性抗原Ag85A的基因克隆与表达研究

目的结核病疫情再度增高给结核病的防治提出了新的挑战,由于卡介苗对结核病的预防效果极不稳定,发展新型结核病疫苗势在必行,本研究通过对结核杆菌免疫保护性抗原Ag85A进行克隆与表达研究,旨在为结核病新型疫苗研制提供新的靶点.方法根据结核杆菌H37Rv株免疫保护性抗原Ag85A的基因序列自行设计一对寡核苷酸引物,以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板通过PCR扩增获得具有完整开架读码框(ORF)的Ag85A抗原基因,并将其正向插入真核和原核穿梭表达型载体pBKCMV构建重组质粒,重组质粒转入大肠杆菌后IPTG诱导表达,并对其表达产物进行Western-blotting分析.结果①PCR扩增获得了具有完整开架读码框的Ag85A抗原基因;②构建了Ag85A抗原基因真核和原核穿梭表达型载体;③Ag85A抗原基因在大肠杆菌中实现了稳定表达.结论本研究成功地对结核杆菌免疫保护性抗原Ag85A进行了基因克隆与表达,为进一步研究其在结核病新型疫苗研制中的应用奠定了基础.     

MAGE-3基因真核表达载体构建及在小鼠黑色素瘤细胞中的表达

目的　扩增人黑色素瘤抗原 3(Melanomaantigen 3,MAGE 3)基因 ,构建真核表达载体 ,并在小鼠黑色素细胞瘤B16中进行表达。方法　采用PCR扩增MAGE 3基因 ,连接到真核表达载体pIRES2 EGFP中 ,构建真核表达载体pIRES2 EGFP MAGE 3,脂质体法转染小鼠黑色素瘤B16细胞。G4 18筛选阳性克隆 ,荧光显微镜和RT PCR分别检测阳性克隆中增强型绿色荧光蛋白 (Enhancedgreenfluorescentprotein ,EGFP)的表达和MAGE 3mRNA的表达。结果　从pUC19 MAGE 3重组质粒中扩增获得一条约 95 0bp的片段 ,成功构建了真核表达载体pIRES2 EGFP MAGE 3,转染B16细胞后筛选得到阳性克隆 ,可见融合蛋白表达产生明亮的绿色荧光 ,RT PCR检测到MAGE 3mRNA的表达。结论　成功构建了真核表达载体pIRES2 EGFP MAGE 3,获得了稳定表达该载体的小鼠黑色素瘤B16细胞系 ,为研究MAGE 3在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了基础。     

杆菌-结核杆菌穿梭质粒pMV261/rpsL的构建及其功能鉴定

目的：构建多耐药临床分离株结核杆菌rpsL基因重组大肠杆菌-结核杆菌穿梭质粒pMV261/rpsL及其功能鉴定。 方法： 制备临床分离株多耐药结核杆菌基因组DNA，PCR扩增该株结核杆菌rpsL基因，构建及鉴定该株结核杆菌rpsL基因重组穿梭质粒PMV261/rpsL，重组穿梭质粒PMV261/rpsL电转化结核杆菌H37Rv株及其鉴定。 结果： 成功地构建了重组大肠杆菌-结核杆菌穿梭质粒PMV261/rpsL；重组大肠杆菌－结核杆菌穿梭质粒PMV261/rpsL电转化结核杆菌H37Rv株获得成功，并且重组质粒PMV261/rpsL电转化后的结核杆菌H37Rv株对链霉素耐药。 结论： 该临床分离株多耐药结核分支杆菌对链霉素耐药的机制仅仅是由于rpsL基因的93 bp、94 bp处碱基突变所致，耐药性是一个基因突变的结果，是单基因型。     

Ⅰ型人免疫缺陷病毒gag-gp120嵌合基因核酸疫苗的构建与鉴定

目的：构建含Ⅰ型人免疫缺陷病毒(HIV-1)gag—gp120嵌合基因核酸疫苗的表达质粒。方法：将gag和gp120连接后的嵌合基因插入到真核表达载体pVAX1中，构建真核表达质粒pVAXGE。用脂质体法将构建的重组质粒转染Hela细胞72h后，取转染的Hela细胞进行RT—PCR检测和和Dot—ELISA分析。结果：重组质粒转染细胞的总RNA中，可扩增出目的基因的转录产物。Dot-ELISA的结果显示，目的基因在Hela细胞内得到表达。结论：成功地构建了表达gag—gp120嵌合基因的核酸疫苗质粒，为HIV—1核酸疫苗的制备奠定基础。     

中国株HIV-1核心蛋白Gag核酸疫苗的构建与表达

目的 构建含HIV－1中国流行株B亚型核心蛋白Gag基因的真核表达质粒，并在体外进行表达和鉴定。方法 将Gag基因插入到核酸疫苗载体质粒pVAX1中，构建真核表达质粒pVAXGAG。用脂质体法。将重组质粒转染人Hela细胞后进行表达产物的检测。结果 间接免疫荧光检测显示，转染重组质粒的细胞表面有绿色荧光。Western blot和Dot ELISA分析显示，重组质粒转染细胞的裂解物中存在表达的Gag蛋白。结论 构建的核酸苗可在体外进行表达，且表达的蛋白具有特异性。     

Salusin-a基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的:研究增强型绿色荧光蛋白真核表达载体Salusin-a(pEG-FP-Salusin-a)的构建及在人胚胎肾细胞系293细胞(HEK293)中的表达。方法:提取人单核细胞系THP-1细胞Salusin-a的mRNA,逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)扩增Salusin-a基因,克隆入pEGFP-N3载体,双酶切、菌落PCR及测序鉴定pEGFP-Salusin-a质粒。用脂质体转染pEGFP-Salusin-a入HEK293细胞,分为转染细胞组、质粒对照组和空白对照组,检测分析各组荧光蛋白和Salusin-a基因的表达。结果:成功构建pEGFP-Salusin-a质粒,并转染HEK293,细胞转染效率86%,转染细胞组和质粒对照组绿色荧光蛋白的表达明显高于空白对照组(P0.05);转染细胞组Salusin-amRNA的表达明显高于质粒对照组和空白对照组(P0.05)。结论:重组pEGFP-Salusin-a质粒能转染HEK293细胞并表达Salusin-a,为Salusin-a基因功能的进一步研究提供了实验基础。     

结核分枝杆菌Ag85B与IL-12基因真核共表达质粒的构建及表达

目的 :构建结核分枝杆菌Ag85B和鼠IL 12基因的共表达载体pBud85B IL12。方法 :将结核分枝杆菌Ag85B基因和鼠IL 12基因同时克隆入含多启动子的共表达载体pBudCE4 .1中 ,构建真核共表达质粒pBud85B IL12。以pBud85B IL12转染COS 7细胞 ,通过RT PCR及ELISA方法检测目的基因的表达。结果 :在COS 7细胞中同时可检测到Ag85B和IL12的表达。结论 :pBud85B IL12共表达质粒的成功构建 ,为对其免疫原性、免疫反应性及免疫保护作用的进一步研究奠定了基础     

FLK1265-2493与C3d3融合基因真核表达质粒的构建及表达

目的 构建FLK1265-2493与C3d3融合基因真核表达质粒,并在体外进行表达和鉴定。方法采用PCR技术扩增FLK1265—2493片段,将该片段插入到pMDT-18载体中后,亚克隆至真核表达载体pSG．SS．C3d3．YL,构建FLD1265-2493与C3d3融合基因表达质粒。经限制性酶切鉴定和DNA序列测定结果证实后,将重组质粒pSG．SS．FLK1265—2493．C3d3．YL转染Hela细胞,检测其体外表达。结果免疫印迹和免疫细胞化学分析结果分别表明转染细胞上清液和胞浆内均有目的分子的存在。结论构建的DNA疫苗可在真核细胞内正确表达,这为进一步的动物实验打下了基础。     

结核杆菌HSP65 DNA疫苗的初步研究

目的 构建以结核分枝杆菌热休克蛋白65000u基因为基础的核酸疫苗。方法 采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Rv株基因中，扩增出HSP65的编码基因，经限制性核酸内切酶消化后，插入真核表达载体pcDNA3.1(－）的相应酶切位点，并将此重组质粒免疫动物。结果 重组质粒的插入基因经序列测定证实为结核分枝杆菌HSP65。DNA免疫小鼠体内产生特异性抗体。结论 以HSP65编码基因为基础的真核表达载体构建成功，并能引起特异性动物免疫反应，为进一步研究其在结核病防治中的作用奠定了基础。     

真核表达载体pEGFP-GPC3的构建及表达

目的:构建磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)真核表达载体pEGFP-GPC3,并在小鼠树突状细胞(DC)表达.方法:将质粒pCMV-SPORT6-GPC3和载体pEGFP-N1分别进行双酶切获得目的基因GPC3片段和空载体,回收纯化后用T4连接酶将两者连接并转化E.coli DH5α菌株,用EcoR I、BamH I双酶切鉴定后通过脂质体法转染到DC中,然后进行荧光检测和Western blot分析.结果:构建的真核表达载体pEGFP-GPC3,转染DC后,荧光显微镜下可见转染的DC中有EGFP-GPC3融合蛋白的表达,Western blot分析发现有相对分子质量(M,)大小约为67 000的蛋白条带.结论:成功地构建了真核表达载体pEGFP-GPC3并在转染DC后能在其中表达,为进一步研究GPC3基因的功能提供实验基础.     

pEGFP-C3 -insig2融合基因真核表达质粒的构建、表达及其对下游基因的影响

目的：构建insig 2基因的真核表达质粒, 转染3T3-L1细胞并观察对下游脂肪酸结合蛋白（AP2）mRNA、脂联素mRNA表达的影响.方法：采用RT-PCR法获取小鼠全长insig 2基因, 并克隆入真核表达载体pEGFP-C3中.酶切、测序鉴定后, 经脂质体转染入3T3-L1细胞, 通过荧光显微镜观察及RT-PCR检测其在3T3-L1细胞中的表达及下游基因的变化.结果：成功地构建了pEGFP-C3-insig 2融合基因的真核表达载体, 荧光显微镜观察到pEGFP-C3-insig 2融合蛋白在转染的3T3-L1细胞胞质中的表达, insig 2基因的转录明显上调.转染后24 h、 72 h较0 h AP 2 mRNA和脂联素mRNA的转录水平明显下调.结论：构建了insig 2基因的真核表达质粒, 在转染的3T3-L1细胞中insig 2的过表达可能影响该细胞的脂肪代谢.     

带有IL-24的腺病毒扩增及其在小鼠树突状细胞中的表达

目的：在293细胞中扩增带有IL-24的腺病毒,感染小鼠树突状细胞,观察IL-24在树突状细胞中的表达。方法：将构建的重组腺病毒表达载体IL-24转染到293细胞中包装、扩增,感染分离培养的小鼠树突状细胞,RT-PCR、Westernblot、荧光显微镜检测IL-24的表达。结果：获得了大量的带有IL-24的腺病毒,成功的感染小鼠树突状细胞,RT-PCR和Westernblot检测结果显示,IL-24在树突状细胞中高表达。结论：带有IL-24的腺病毒可以高效的感染小鼠树突状细胞。