人CD123稳定表达细胞株的建立与鉴定

目的探索建立人CD123稳定表达细胞株的方法,为进一步实现人CD123的抗体规模化生产提供材料。方法构建人CD123 CDS区真核表达载体（hCD123 CDS-pEGFP-N1）;经脂质体包裹转染中国仓鼠卵巢细胞CHO-S;经流式分选结合G418筛选,并用流式细胞术和Western印迹法检测人CD123蛋白的表达情况,初步筛选出人CD123高表达的CHO-S细胞株;并进一步用经人CD123 Fc重组融合蛋白免疫的小鼠血清检测该细胞株hCD123表达情况。结果测序及GenBank中序列比较结果显示扩增到的人CD123基因序列是正确的,酶切结果表明表达质粒构建正确;流式分选结合G418筛选得到1个人CD123高表达的细胞株——克隆8G9 CHO-S,其CD123-APC阳性细胞百分数为92.07%,用融合蛋白免疫的血清检测各细胞株人CD123表达情况,结果显示克隆8G9 CHO-S细胞和对照CHO-S细胞的CD123阳性率分别为（97.94±1.93）%和（2.84±1.35）%,差异具有统计学意义（P〈0.01）。结论建立了人CD123抗原稳定高表达的细胞株克隆8G9 CHO-S,为进一步实现人CD123的抗体规模化生产及其导向治疗奠定了坚实的基础。     

CD3AK细胞对人肺癌细胞株的细胞毒作用

目的研究ＣＤ３ＡＫ细胞对人肺癌细胞株的细胞毒作用。方法应用抗ＣＤ３单克隆抗体及重组白细胞介素２（ｒＩＬ－２）刺激培养ＣＤ３ＡＫ细胞,体外实验研究ＣＤ３ＡＫ细胞的增殖及对人肺癌细胞株Ａ５４９、ＳＰＣ－Ａ１细胞的杀伤能力。结果刺激培养４ｄ,ＣＤ３ＡＫ细胞增殖及杀伤能力与ＬＡＫ细胞无差异;培养８ｄ,ＣＤ３ＡＫ细胞的增殖及杀伤能力明显优于ＬＡＫ细胞（Ｐ＜０．０１）;培养１６ｄＣＤ３ＡＫ细胞仍见增殖,且杀伤作用保持在５０％以上。结论ＣＤ３ＡＫ中细胞作为一种新的肿瘤过继性免疫治疗效应细胞具有潜在的临床应用价值。     

人CD40L真核表达体系的建立

目的 构建人CD40L真核表达体系并鉴定其在转染细胞中的表达.方法 以DNA重组技术构建CD40L的真核表达载体pcDNA3.1( )-CD40L,脂质体法转染于人小细胞肺癌细胞株h446,流式细胞技术鉴定其在转染细胞中的表达.结果 双酶切及DNA测序证明,CD40L DNA插入表达载体pcDNA3.1( ) 序列及方向正确,转染肺小细胞肺癌细胞株h446后,经流式细胞仪鉴定转染细胞中存在CD40L表达.结论 成功地建立人CD40L表达体系,为构建以人CD40L为组件的抗肿瘤疫苗的临床研究奠定基础.     

人CD48基因转染细胞株的构建

目的克隆人CD48基因,构建稳定表达CD48分子的基因转染细胞株。方法提取人外周血单个核细胞总RNA,通过RT-PCR克隆获得人CD48基因,将人CD48基因重组入逆转录病毒载体pEGZ-term,通过293T细胞的包装获得具有感染力的完整重组病毒载体,进而感染L929细胞,构建稳定表达人CD48分子的基因转染细胞株。结果成功克隆人CD48基因和构建PGEZ/CD48逆转录病毒表达载体,进而成功获得稳定表达人CD48的基因转染细胞株L/CD48。结论成功克隆了人CD48基因及其逆转录表达载体,并构建了稳定表达CD48分子的基因转染细胞株,为探讨CD48生物学功能的研究奠定了物质基础。     

rhIFN-γ对白血病K562细胞CD123表达的影响

［摘要］目的　检测重组人γ-干扰素（recombination human interferon gamma,rhIFN-γ）对白血病K562细胞生长的抑制作用及其对CD123表达的影响. 方法　应用MTT法检测白血病K562细胞在不同浓度rhIFN-γ作用72 h的增殖活力以及用流式检测其CD123的表达．结果　5×104～108 U/L rhIFN-γ作用K562细胞72 h,细胞生长抑制率随剂量增大而增高,而2×105 U/L rhIFN-γ使其抑制率降低．rhIFN-γ 2×105 U/L、107 U/L孵育K562细胞72 h, 流式检测到CD123在K562细胞的表达量分别为（7.2±2.50）%和（21.6±1.17）%;107 U/L rhIFN-γ组与对照组（4.10±1.46）%比较,其差异有统计学意义（P＜0.05）. 结论　rhIFN-γ对白血病K562细胞生长有双向作用（抑制或促增殖）,诱导CD123表达增加.     

人乙酰肝素酶稳定表达CHO细胞株的建立

目的 在CHO细胞中表达人乙酰肝素酶(HPA)并建立该酶的稳定表达细胞株.方法 在脂质体的介导下,用本实验室构建的pEGFP-N1-HPA重组质粒转染CHO细胞,经G418筛选稳定表达的细胞.通过荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白的表达情况,同时通过RT-PCR检测HPA基因转录水平、免疫细胞化学法检测HPA蛋白表达、MTT方法测定外源基因对CHO细胞增殖的影响.结果 荧光显微镜下可见转染的CHO细胞有绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR证实转染细胞中存在HPA基因mRNA的表达,成功获得HPA的稳定表达细胞株.结论 成功建立人HPA稳定表达CHO细胞株,为该酶的功能研究奠定了基础.     

人重组CD137-Fc分子的构建与真核表达

目的构建人CD137-Fc基因的真核表达质粒，并表达有生物学活性的纯化人CD137-Fc融合蛋白。方法从cDNA文库中用PCR扩增cD137全长编码基因，并导入真核表达载体pcDNA3中。测序证实后，继续用PCR扩增其膜外区cDNA，酶切后与hIgGIFc基因一起装入真核表达载体pcDNA3中，转染293T细胞瞬时表达，用夹心ELISA检测其表达情况，经蛋白A亲和纯化，用SDS-PAGE与免疫印迹进行鉴定。结果测序证实构建的CD137与CD137-Fc cDNA阅读框完整，连接部位序列正确；ELISA证实cD137-Fc蛋白的表达；SDS-PAGE与免疫印迹证实其为人cD137-Fc蛋白。结论获得了纯化的hCD137-Fc融合蛋白，为探讨CD137在免疫自稳调节中的地位，以及探索CD137的其它生物学功能奠定了坚实的实验基础     

人突变CD59的表达、纯化及抗原性鉴定

目的获得纯化人突变CD59（hmCD59）蛋白,制备其特异性抗体,对纯化产物进行鉴定。方法将含有hmCD59全长序列的重组pALTER质粒,运用脂质体介导法转染CHO细胞,采用SDS-PAGE检测hmCD59的表达情况,表达产物经ANTI-FLAG M2 Affinity Gel纯化后制备抗血清,以此抗血清鉴定纯化产物。结果hmCD59在CHO细胞获得表达,ANTI-FLAG M2 Affinity Gel纯化后可获得电泳纯的hmCD59蛋白,hmCD59与小鼠抗hmCD59抗血清具有特异性反应。结论从真核细胞获得了电泳纯并具有抗原性的hmCD59蛋白,为进一步对其进行抗体制备、功能研究及临床应用奠定了基础。     

人胎儿胸腺细胞株8810的建立及其生物学特性研究

采用剖腹取胎的５月龄胎儿，分离其胸腺细胞，经过筛选培养，获得能传代培养的细胞株，在体外连续培养已２年多，共传２００余代，命名为人胎儿胸腺细胞株８８１０（简称ＨＦＴ８８１０）。该细胞生长繁殖旺盛、迅速，经多次液氮冻存复苏后，细胞仍生长良好。经长期传代培养，该细胞仍保持分泌胸腺素的功能。     

构建稳定表达PDL1的B16F10细胞株

目的通过转染及流式细胞仪(flow cytometry,FCM)筛选出稳定表达小鼠细胞程式死亡配体1(Programmed cell death ligand 1,PDL1)的B16F10细胞株。方法将携带PDL1的真核表达质粒通过脂质体法转染到B16F10细胞株中,经FCM进行多次分选,筛选出稳定表达PDL1的B16F10细胞株,将其与抗CD3/抗CD28抗体活化的CD4⁺ T细胞共培养48 h后,FCM检测CD4⁺ T细胞表面CD69以及CD25的表达。结果建立了稳定表达PDL1的B16F10细胞株,该细胞株表面的PDL1可诱导CD4⁺ T细胞高表达CD25。结论成功地得到了稳定表达PDL1的B16F10细胞株,为后续研究奠定了物质基础。     

稳定表达核仁素的H9C2细胞株的建立和鉴定

目的:建立稳定表达核仁素的H9C2大鼠心肌细胞株,为进一步研究核仁素在心肌细胞凋亡中的作用提供细胞模型.方法:将含有核仁素全长的质粒pCMV-Tag2B-Nuc用脂质体转染技术导入H9C2细胞,使核仁素在细胞内表达,用G418筛选出稳定表达核仁素的细胞株;用双酶切、DNA测序鉴定质粒,用RT-PCR及Western blot检测核仁素基因在靶细胞中的整合与表达.结果:经G418反复筛选的H9C2细胞株中,核仁素基因在mRNA及蛋白质水平表达均较野生型细胞及转空载体细胞升高.结论:用含核仁素全长的质粒转染H9C2大鼠心肌细胞,经筛选后可稳定表达核仁素.     

M-CSF胞质内稳定表达细胞系的构建和鉴定

目的构建真核细胞pCMV/cyto/myc-M-CSF载体,建立M-CSF胞质内稳定表达细胞系,为进一步研究M-CSF的胞内作用奠定基础。方法构建靶向定位载体pCMV/cyto/myc-M-CSF,PCR及双酶切鉴定后转染HeLa细胞,G418筛选阳性克隆,RT-PCR和免疫细胞化学鉴定M-CSF的表达及M-CSF的蛋白定位。结果重组质粒pCMV/cyto/myc-M-CSF用M-CSF特异性的引物进行PCR扩增,结果显示插入片段约为1 400 bp,双酶切后分别得到约5.0 kb和1 400 bp的两条带,M-CSF分子大小与预期一致。RT-PCR、免疫细胞化学结果表明转染M-CSF的HeLa细胞高表达M-CSF（P〈0.05）,并且转染M-CSF的HeLa细胞表达的M-CSF蛋白定位于细胞质。结论成功构建了稳定高表达胞质M-CSF的HeLa细胞系。     

稳定高效表达BRP 44的PC-3细胞系的建立

目的 建立稳定高效表达BRP 44的PC-3细胞系.方法 下载BRP 44的全长mRNA序列,用Oligo 6进行引物设计,在上下游引物的5'引入相应的Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ限制性内切酶识别序列及保护碱基.提取LNCaP细胞的总RNA反转录成cDNA进行PCR扩增,产物连接到真核表达载体pcDNA 3.1/myc-His A中构建成重组体.重组载体经酶切和测序鉴定后,阳离子脂质体转染法转染PC-3细胞、G 418筛选、Northern杂交检测并挑选出表达最强的亚克隆.结果 成功构建BRP 44的真核表达载体并获得高效稳定表达的BRP 44基因的PC-3细胞亚克隆.结论 高效稳定表达BRP44的PC-3细胞亚克隆可用于下一步研究.     

表达bcr-abl基因片段的可移植小鼠细胞系的生物学特性

目的建立稳定表达bcr-abl融合基因的、可移植的小鼠肿瘤细胞系,解决慢性粒细胞白血病疫苗研究的瓶颈问题。方法从重组克隆载体pGEMbcr-abl中酶切出bcr-abl融合基因片段,并将其亚克隆进反转录病毒载体pLXSN中。脂质体介导重组反转录病毒载体pLXSNbcr-abl转染包装细胞PT67,G418筛选后获得稳定产病毒的包装细胞。收集病毒感染NIH/3T3细胞,加G418筛选后进行反转录病毒滴度测定,计算病毒效价为2×107CFU/mL。收集病毒上清感染SP2/0细胞(H-2d),经G418筛选获得稳定表达bcr-abl融合基因片段的SP2/0细胞株。然后用SP2/0/bcr-abl细胞攻击同品系BALB/c小鼠,观察SP2/0/bcr-abl移植瘤生长的情况。结果经特异性PCR扩增和RT-PCR反应扩增,从基因组整合和基因表达水平证实获得了能稳定表达bcr-abl融合基因片段的鼠SP2/0细胞系。SP2/0/bcr-abl细胞能够在同品系小鼠体内形成移植肿瘤。结论该表达bcr-abl融合基因片段的小鼠肿瘤细胞系将作为研究bcr-abl基因疫苗的有效实验工具,为检验bcr-abl基因疫苗激发的小鼠CTL应答研究奠定物质基础。     

人胰岛素样生长因子-1稳定表达细胞株的构建及鉴定

目的 :建立稳定表达人胰岛素样生长因子 - 1 ( h IGF- 1 )的细胞株。方法 :用脂质体转染法将含有 h IGF- 1 c DNA的真核表达载体转染 BHK细胞 ,经 G41 8筛选 ,形成阳性细胞克隆。继续培养4周 ,进行原位杂交和免疫细胞化学检测。结果 :原位杂交检测在转染细胞的胞浆中有棕黄色颗粒样阳性杂交信号 ;免疫细胞化学检测在转染细胞的胞浆中有氯化镍蓝色阳性信号。结论 :G41 8筛选后所获得的阳性细胞克隆 ,继续培养 4周 ,原位杂交和免疫细胞化学检测表明 h IGF- 1基因得到稳定表达     

痘苗病毒D13L基因在BHK21细胞系中的稳定表达

目的 建立稳定表达痘苗病毒D13L基因的细胞系。方法 克隆D13L基因并将其插入真核表达质粒pEGFP-C2中构建重组质粒pEGFP-D13L，利用脂质体法转染BHK21细胞，G-418进行筛选，有限稀释法获取亚克隆细胞株。荧光显微镜观察和RT-PCR分析表达效果。结果 D13L基因在细胞中稳定表达，连续传代10次后仍然能检测到其表达，荧光显微镜下能看到绿色荧光，RT-PCR可以得到1650bp大小的目的条带。结论 筛选到了稳定表达D13L基因的细胞株，为下一步构建缺陷型痘苗病毒以及研究D13L基因的功能奠定基础。     

截断型突变体HBx-Mut120稳定表达真核细胞系的建立

目的 成功构建HBx及其截断型突变体HBx-Mut120的真核载体,建立了两者稳定表达的HepG2细胞系,并研究了目的基因对细胞生长的影响。方法 采用PCR扩增HBx及其截断型突变体HBx-Mut120基因,然后分别克隆到PCMV-Tag2B载体中,并构建成重组质粒HBx-PCMV-Tag2B和HBx-Mut120-PCMV-Tag2B,经过PCR、酶切、测序鉴定重组质粒后,将其转染人肝癌细胞HepG2,经Game 418筛选后得到稳定表达目的基因的HepG2细胞,最后通过RT-PCR和Western blot鉴定HBx、HBx-Mut120的mRNA和蛋白在HepG2细胞中的表达情况,并用流式细胞仪检测了各组细胞的周期。结果 （1）成功构建目的基因表达载体PCMV-Tag2B-HBx、PCMV-Tag2B-HBx-Mut120。（2）成功建立稳定表达HBx及其缺失片段的HBx蛋白的HepG2细胞系。（3）通过流式细胞仪检测各组细胞周期及对比,发现HepG2-HBx细胞和HepG2-HBx-Mut120细胞的生长分数（G₂+S）明显高于HepG2细胞及空载体转染的HepG2细胞。结论 本实验成功构建携带HBx及其截断型突变体HBx-Mut120基因的重组表达质粒,转染人肝癌细胞HepG2细胞后分别能够稳定表达HBx蛋白和截断型HBx蛋白,HBx及其突变体稳转细胞后更能促进HepG2细胞的增殖,且突变型目的基因稳转细胞系转移能力较前明显增强。为进一步研究截断型HBx突变体在肝癌的发生、发展中的作用奠定了实验基础。     

稳定表达EGFR-GFP融合蛋白细胞系的建立

目的:建立稳定表达EGFR-GFP融合蛋白的细胞系。方法:CaC l2法将pEGFR-EGFP质粒转化DH5α,酶切鉴定后提取质粒经电穿孔转染CHO-K1细胞;以EGFP作为荧光报告分子,克隆化培养以获取单克隆阳性细胞;流式细胞术、荧光显微镜术、W estern B lot检测转染细胞EGFR-GFP融合蛋白的表达;比较稳定转染细胞及未转染细胞的生长曲线;反复冻存、复苏、传代鉴定细胞表达EGFR-GFP融合蛋白的稳定性。结果:获得1株稳定表达EGFR-GFP融合蛋白的细胞系,命名为CHO-EGFR-GFP1,融合蛋白主要表达于细胞膜。稳定转染细胞和未转染细胞生长特性无显著差异。结论:成功获得膜表面稳定表达EGFR-GFP融合蛋白的细胞系,为研制以EGFR为靶点的抗肿瘤药物以及研究EGFR与其配体间相互作用奠定了基础。     

稳定表达绿色荧光蛋白的COS7细胞系的筛选和鉴定

目的 构建稳定表达绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)的COS-7细胞系,为相关实验对照提供方便. 方法 常规方法培养COS-7细胞,将含pEGFP-N3基因的质粒转染COS-7细胞,G418抗性筛选,并用荧光显微镜进行跟踪检测,挑选耐药单细胞克隆并扩大培养至稳定细胞株. 结果 G418筛选的最适浓度为500 μg/mL.筛选到的COS7 -GFP克隆荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光,细胞的生物学性状保持稳定,通过Western blot能检测到GFP蛋白. 结论 成功筛选并建立了稳定表达的COS7 -GFP细胞系.