用单克隆抗体对我国登革2型04株病毒蛋白及其抗原表位的分析

从众多株抗登革2型单克隆抗体中挑选出登革2型病毒型特异、登革病毒亚群特异,黄病毒科特异3种代表类型的6株单抗,这6株单抗均无补结活性。放射免疫沉淀实验结果表明,这6株单抗均识别登革2型04株病毒的42K非结构性多肽。固相放射免疫竞争试验结果表明,3个型特异及1个亚群特异的抗原表位相互邻近,同在一个独立区内。这些抗原表位均不具有中和及血凝活性。而2个具有中和及血凝活性的黄病毒科特异性抗原表位,则位于另一个独立区内。上述2独立区拓扑距离较远。     

我国登革2型病毒43株基因组全长cDNA的构建

目的 构建我国登革2型病毒43株基因组全长cDNA,为进一步研究其体外RNA转录产物的感染性,阐明致病机理及探索新型疫苗奠定基础。方法 根据登革2型病毒参考株NGC株的核苷酸序列,利用DNASTAR软件设计覆盖登革2型病毒43株基因组的6对重叠引物。从感染登革2型病毒43株的乳鼠脑中提限病毒基因组RNA,采用RT－PCR分别扩增6条基因片段,并将其分别与pGEM－T载体进行连接。重组质粒用PCR进行快速鉴定,并在377A型自动测序仪进行序列分析。然后利用单一酶切位点,分别自阳性重组子上切下各基因片段,在体外分别进行5′半分子和3′半分子的连接,最后将5′和3′半分子连接成基因全长的cDNA。扩增各接头两侧长约457－691bp的基因片段,连接至T载体后测序,从而对全长cDNA进行鉴定。结果 共扩增出6条约1．5－2．5kb的基因自然,并在体外进行连接,获得了全长cDNA。结论 通过测序证实成功地构建了我国登革2型病毒43株基因组全长cDNA分子。本研究结果将为阐明我国登革病毒株的毒力及致病机理奠定基础。     

我国登革2型病毒43株非结构蛋白NS1基因的特征

对我国１９８７年从广西分离的登革２型病毒４３株非结构蛋白ＮＳ１基因的核苷酸序列进行了分析，结果表明登革２型病毒４３株非结构蛋白ＮＳ１基因含有１０５６核苷酸编码３５２个氨基酸，并就其核苷酸序列及其相应的氨基酸序列与我国１９８５年海南流行高峰期分离的Ｄ２－０４株、国际参考株新几内亚Ｃ株（ＮＧＣ）、牙买加株（ＪＡＭ）、候选疫苗株（Ｓ１）和马来西亚流行株Ｍ１（登革出血热）、Ｍ２（登革休克综合征）、Ｍ３（登革热）进行比较，发现核苷酸序列的同源性分别为９２．２％，９３．７％，９３．３％，９０．７％，８９．９％，８９．５％，８９．３％，氨基酸的类似性分别为８９．８％，９２．６％，９３．３％，９１．２％，９０．６％，９０．１％，８９；９％，推断的氨基酸序列含有两个糖基化位点，分别位于氨基酸残基的１３０和２０７位，一个可能的蛋白裂解位点３５０～３５２和１０个保守的半胱氨酸残基。     

我国登革2型病毒43株包膜E蛋白MBP-B165抗原性的研究

目的 通过对我国登革2型病毒株包膜E蛋白包括B区在内的第267－432氨基酸编码基因片段的表达,研究MBP－B165蛋白的抗原性。方法 首先采用PCR方法扩增了编码B165蛋白的基因片段,并将其插入到pMal－C2核载体进行融合表达。采用蛋白印迹和ELISA法对表达产物进行特异性鉴定。用表达的融合蛋白MBP－B165免疫大白兔,产通过ELISA法检测兔免疫血清中登革2型病毒特异的抗体。结果 表达的融合蛋白MBP－B165可与我国登革2型病毒株抗体特异结合,而且与登革1、3和4型病毒参考株的多克隆抗体均具有较高的反应性。用表达蛋白免疫大白兔可产生针对我国登革2型病毒株E蛋白的特异抗体,并且该抗体与基他3个型病毒参考株有交叉反应。结论 我国登革2型病毒43株E蛋白包括B区在内的第267－432氨基酸序列具有一定的抗原性,而且具有黄病毒亚组特异的反应性表位,即4个型登革病毒的结构保守性表位。     

用标记分析法检测我国登革3型病毒株抗原表位的变化

自从1978年以来,我国广东,广西和海南等地区连续发生了登革热大流行,成千上万的人被登革病毒感染,给人民的生命财产带来了极大的危害,为了阐明我国登革病毒流行来源和传播途径等问题,为登革热的预防控制提供依据,我们在对登革2型病毒株抗原分析的基础上,又对登革3(DEN-3)型病毒株的抗原性变化进行了分析。由于登革病毒培养滴度低,周期比较长,制备一定量的抗原进行抗原分析比较困难,用一般的血清学方法又不能说明病毒抗原表位的变化。因此我们采用了标记分析(Signature     

登革病毒E蛋白抗原表位研究进展

登革病毒是虫媒病毒的Ｂ组的一个成员，其ＲＮＡ编码３种结构蛋白和７种非结构蛋白。研究发现，病毒抗原中既存在有中和性抗原表位，又有免疫增强抗原表位，本文就登革病毒主要抗原Ｅ蛋白的表位研究进展作了综述。     

我国登革2型病毒43株PrM-E基因的DNA免疫原性研究

目的 观察我国登革２型病毒４３株ＰｒＭ－Ｅ基因的ＤＮＡ免疫原性及非甲基化细菌性ＣｐＧ对ＤＮＡ免疫效果的影响。方法 采用ＲＴ－ＰＣＲ和分子克隆技术构建ＰｒＭ－Ｅ基因片段，并将其插入真核表达载体ｐＢＫ－ＣＭＶ中。在证明其可在哺乳动物细胞中高效表达的基础上，进一步用重组质粒ＤＮＡ免疫小鼠。通过间接免疫荧光法对采集的鼠血清中的病毒特异抗体进行检测。结果 用含ＰｒＭ－Ｅ基因的重组质粒ＤＮＡ免疫小鼠可诱导产生     

登革2型病毒NGC株E基因扩增和部分序列分析

目的 体外扩增、克隆登革2型病毒（NGC株）包膜糖蛋白E基因约1．5kb的基因片段,并对目的基因片段进行部分碱基序列测定和分析。方法 采用逆转录聚合酶链反应扩增出E目的基因片段,经限制性内切酶Kpn1/Xbal酶切后用低熔点琼脂糖挖块回收法回收纯化,插入真核表达载体pcDNA3的多克隆位点,构建重组体pcDNA3-E,转化大肠杆菌DH5a,通过对目的基因片段的部分碱基序列测定鉴定克隆的正确性,并分析其氨基酸变异。结果 从登革2型病毒（NGC株）中扩增出约1．5kb的DNA片段,目的基因片段的部分测序与参考序列的同源性为96．53％,7个氨基酸发生变异,4个变异氨基酸与登革2型病毒Jamaica株相应位置的氨基酸相同。结论 体外成功扩增并克隆DV2（NGC株）全长E基因片段,其序列变异及与其他毒株的同源性研究为登革病毒致病机理和疫苗的研究提供材料。     

抗2型登革病毒M蛋白单克隆抗体的制备和生物学特性的鉴定

目的 克隆表达2型登革病毒M蛋白,用纯化的重组蛋白免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术制备可用于胶体金快速检测试条的抗2型登革病毒M蛋白的单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性.方法 利用登革热2型病毒全长基因重组质粒,经PCR方法扩增出prm/m基因片段,在pET-32a(+)表达系统中表达,表达产物用Ni柱亲和层析纯化后,用于免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗M蛋白的mAb,采用间接ELISA方法和Western blot进行mAb特异性鉴定;同时采用间接ELISA方法鉴定mAb相对亲和力.结果 获得2株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞Ⅲ1A6和Ⅲ3D2;相对亲和力均在105 以上.Westernblot显示2株mAb能特异识别重组M蛋白.结论成功地制备出抗登革病毒2型病毒M蛋白的2株mAb,为建立快速特异检测登革病毒的实验方法提供了有力的工具.     

登革病毒血清型2 E蛋白Ⅲ区单克隆抗体的制备及其诊断特异性研究

本研究旨在制备抗登革病毒(dengue virus,DENV)血清型2 (DENV2)E蛋白Ⅲ区(envelope protein domainⅢ,EDⅢ)单克隆抗体(简称单抗)并研究其诊断特异性。合成编码DENV2-EDⅢ的基因并将其克隆入原核表达质粒pET21a;将重组质粒转入大肠埃希菌菌株BL21;用重组表达的EDⅢ免疫小鼠;将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0融合;将可产生识别抗EDⅢ单抗的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔;采用蛋白G亲和层析法从腹水中纯化单抗;采用间接ELISA和间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay, IFA)评估所制备的单抗识别DENV血清型1～4 (DENV1～4)的能力。本研究成功表达了DENV2-EDⅢ,并制备出3株杂交瘤细胞,杂交瘤细胞所分泌的小鼠源性单抗既可识别DENV2,又可交叉识别DENV1、DENV3和DENV4。     

由构建的基因组全长cDNA所回收的我国登革2型病毒株的鉴定

目的 由构建的病毒基因组全长cDNA回收具有感染性的我国登革2型病毒株,为进一步阐明登革2型病毒的致病机制及其新型疫苗的研制奠定基础。方法 用SP6 RNA聚合酶系统制备我国登革2型病毒（D2－43）株基因组全长cDNA的体外RNA转录物,纯化后经电穿孔法转染C6／36细胞,观察致细胞病变作用以判断其感染性。从病变的细胞和培养上清中提取总RNA,通过RT－PCR扩增及克隆测序的方法证实细胞病变确为RNA转录物感染所致。同时收集可产生细胞病变的培养上清,再感染C6／36细胞以进一步证实所回收的登革2型病毒感染的稳定性。结果 以我国D2－43病毒株基因组全长cDNA为模板制备的体外RNA转录物可使C6／36细胞产生病变,从病变细胞和培养上清中可扩增获得病毒特异的基因片段。在培养细胞中进行连续传代仍可产生细胞病变作用。结论 构建的我国D2－43株基因全长cDNA的体外RNA转录物对传代蚊细胞具有感染性,表明可产生完整的病毒颗粒。本研究可为阐明登革2型病毒的致病机理及探索新的预防和治疗措施奠定基础。     

我国登革2型／4型病毒株嵌合E基因免疫原性的研究

目的 构建含有我国登革2型／4型病毒株嵌合E基因片段的真核表达质粒,观察重组质粒DNA的免疫原性,为登革多价疫苗的研究提供依据。方法 首先将包含我国登革2型病毒43株E蛋白Ⅰ/Ⅱ抗原区和4型病毒B5株E蛋白Ⅲ抗原区的嵌合E基因片段克隆至真核表达载体pcDNA3.1中,通过测定确定嵌合基因序列的正确性。然后将重组质粒以肌肉注射途径,免疫Balb/C小鼠。通过间接免疫荧光法对采集的鼠血清中的病毒特异抗体进行检测。结果 构建的含有我国登革2型／4型病毒株嵌合E基因的真核表达质粒pcDNA-D2/4,经序列测定表明,导入的嵌合E基因片段的序列是正确的。将重组质粒DNA免疫小鼠,在初次免疫后的第3周,可同时检测到针对登革2型和4型病毒的特异荧光。结论 所构建的含有不同血清型的我国登革病毒株嵌合E基因片段的真核重组质粒,可诱导小鼠同时产生针对两个血清型病毒的特异抗体,该研究为新型登革多价疫苗的研制提供了依据。     

广东登革Ⅰ型病毒株变异性的初步研究

Objective　To study the variation of Guangdong dengue-1 virus strains. Methods　Partial nucleotide fragments in E/NS1 gene junction of 2 degue-1 isolates(LD-25, LD-26) and 1 positive sera sample (95-142) of Guangdong province collected in different years, were amplified by RT-PCR and sequenced. The 240bp sequences of the above-mentioned fragments were compared with those of other well-characterized dengue-1 strains. A divergence of 6% between the nucleotide sequences was taken as an indication for dengue virus subtype classification. Results　LD-25 and LD-36 or 95-142 may belong to two different subtypes. Dengue strains of LD-25 (1985), Thai(1980) and Taiwan of China(1987,1988) could fall into the same subtype in the light of their sequence homology ranging from 97.1% to 98.8%. The sequence homology among LD-36(1991), 95-142(1995), Philippine(1988) and three other dengue-1 virus strains ranged from 97.5% to 100%, indicating that they belonged to another subtype of dengue virus. Possible source of infection of these dengue virus strains is discussed. Conclusion　Guangdong dengue viruses may have not only one source.     

新分离登革2型病毒福建株基因组全序列的测定

目的 对新近分离的导致1999年福建省登热流行的登革2型病毒FJ－10株进行基因组全序列测定及系统发生树分析。方法 利用RT－PCR和5′、3′RACE法扩增FJ－10株cDNA,并进行克隆测序,利用DNASTAR折Clustal方法绘制系统发生树。结果 JF－10株基因组全长10723个核苷酸,有1个单一开放读码框架（ORF,第97－10269nt）,编码3391个氨基酸,5′和3′非编码区长度分别为96和454个核苷酸,通过与标准株NGC株和我国其他地区分离株DEN2－04、43、44株比较,核苷酸同源性分别为94.0%、92.8%、93.9%和93.9%,氨基酸同源性分别为97.9%、97.2%、97.7%和97.9%。以47株登革2型病毒E／NS1连接区240个核苷酸序列进行发生树分析,福建株与印度尼西亚和斯里兰卡分离株亲缘关系较近,同属第Ⅳ基因型。结论 FJ－10株基因组全序列一级结构与其他登革2型病毒类似,其基因型不同于我国其他地区分离株DEN2－04、43和44株。     

登革2型病毒NS3蛋白NTPase/RNA解旋酶结构域的原核表达及活性研究

目的 表达登革病毒非结构蛋白NS3 NTPase／RNA解旋酶结构域（dNS3），纯化表达产物并对其活性作初步研究。方法提取感染登革2型病毒的BHK-21细胞总RNA，RT-PCR扩增目的基因，经NcoⅠ、HindⅢ双酶切后连入表达载体pET28a，转化宿主菌BL21（DE3），优化诱导表达条件，SDS-PAGE和免疫印迹鉴定表达蛋白。表达产物经亲和层析纯化，超滤浓缩脱盐，孔雀绿钼酸铵法检测NTPase活性。结果成功构建重组表达载体pET28a-dNS3并在大肠杆菌中获得可溶性表达，纯化产物经测定具有良好的NTease活性及抗原性。体外条件下证实登革2型病毒非结构蛋白NS5（RDRP）对dNS3的ATPase活性有促进作用，提示在病毒复制时NS3与NS5间的相互作用对NS3的生物活性及对病毒复制过程可能具有调控作用。结论本研究为基于抑制NS3 NTPase／RNA解旋酶活性的抗病毒药物的筛选提供了实验依据。     

登革2型病毒E蛋白免疫优势表位的筛选鉴定

目的 用噬菌体展示肽库筛选登革2型病毒(DEN2)E蛋白的抗原表位，并确定该抗原表位性质。方法 以DEN2型特异的E单克隆抗体作为筛选分子，生物淘洗噬菌体随机12肽库，将筛选的噬菌体阳性克隆进行ELISA检测、DNA序列测定及展示肽的氨基酸序列推导，通过噬菌体展示肽序列与DEN2E蛋白的氨基酸一级结构的对比，初步确定E蛋白的抗原表位；用模拟该表位线性序列的合成十肽进行抗体结合试验、噬菌体竞争抑制试验及与DEN感染患者的血清学试验，确定其为免疫优势线性表位。结果 肽库淘洗获得的11个ELISA阳性的噬菌体克隆有相似的结构基序WFKKGSS，其展示肽与DEN2E蛋白390～398 AA序列有3～5个氨基酸相同。对应于DEN2E蛋白390～399AA的合成十肽能与淘洗单抗特异反应，并可抑制噬菌体阳性克隆与该单抗结合。该合成肽与DEN2感染患者血清有较高的免疫反应性。结论 本实验通过噬菌体随机肽库的生物淘洗确定的DEN2E蛋白(E390～398AA)线性序列为免疫优势表位，其对应的合成肽E10可望用于DEN2感染的快速诊断。     

登革2型病毒广东流行株结构蛋白基因序列测定及分析

目的 对广东省90年代以来流行的3株登革2型病毒(DEN2)的结构蛋白基因序列测定及分析，了解流行株之间的相互关系、变异及基因型：方法 应用RT-PCR技术扩增广东省不同年份流行的3株DEN2型病毒的结构蛋白基因(C、PrM、E基因)。分别克隆到pMD18T载体，转化JM109宿主菌，挑取阳性克隆进行鉴定及序列测定。结果 3株DEN2病毒结构蛋白基因序列长度均为2325bv，编码775个氨基酸。三者核苷酸(氨基酸)的同源性分别是：GD06／93与GD19／2001为96％(97％)、GD06／93与GD08／98为94％(97％)、GD08／98与GD19／2001为92％(94％)。其在相关毒力位点E383～385处均为GLU—PRO-GLY、E126处均为GLU。3株DEN2与国际参考株比较表明：GD06／93与GD19／2001和澳大利亚TSV01株共享序列非常接近，核苷酸(氨基酸)的同源性为98％(98％)；GD08／98与泰国株ThNH-P28／93核苷酸(氨基酸)同源性为98％(98％)。此3株DEN2二级结构与对乳鼠不致病的04株比较，主要差别位于其393～400氨基酸处，本室分离的3株对乳鼠致病毒株为EEEEHHHH，而04株为EEEE----；337～343处本室分离的3株对乳鼠致病毒株为HH-------HHHHH，而04株为--------HHHHE-，恰好位于Dengue病毒E基因的Ⅲ区：结论 GD06／93、GD19／2001与TSV01亲缘关系较近，属同一基因型。GD08／98与ThNH—P28／93共享序列非常接近，属同一基因型。3株DEN2病毒在E蛋白Ⅲ区结构有一定变异，可能与毒力有关。