呼吸道合胞病毒单克隆抗体用于纸上桥联酶标诊断的初步探讨

为了呼吸道合胞病毒(RSV)能够在基层及时帮助诊断和控制其流行,作者旨在更加简化RSV的快速诊断,将RSV-McAb移在微孔滤膜上以搭桥法和RSV抗原结合,由碱性磷酸酶催化底物,在膜上显色。作者将RSV-McAb用于RSV培养物的检测,并作了异种动物血清封闭试验以及vero细胞等阴性对照,证实RSV-Mc-Ab用于纸上桥联是特异性显色,对23例患儿鼻咽部脱落细胞同时作纸上桥联,免疫荧光及APAAP 3种RSV的快速诊断的比较,获得初步满意结果。     

呼吸道合胞病毒单克隆抗体用于纸上桥联酶标诊断的初步探讨

为了呼吸道合胞病毒(RSV)能够在基层及时诊治和控制其流行,作者旨在更加简化RSV的快速诊断,将RSV-McAb移在微孔滤膜上,以搭桥法和RSV抗原结合,由碱性磷酸酶催化底物,在膜上显色。将RSV-McAb用于RSV培养物检测,并作了     

RSV-McAb用于APAAP桥联酶标快速诊断

作者将抗合胞病毒单克隆抗体用于APAAP(硷性磷酸酶抗硷性磷酸酶)桥联酶标诊断109例,同时全部以IFA(免疫荧光)技术作对照,获得满意效果(其阳性符合率达97.2％)。用APAAP技术来诊断RSV-Ag主要优点是:它不需要特殊设备,在普通光学镜下(10×40),结果清晰易辨,整个操作只需1 1/2小时,适于在基层医院进行呼吸道合胞病毒抗原的快速诊断。 由于呼吸道细胞内几乎不含有硷性磷酸酶,所以勿需担心内源酶对诊断的干扰,作者认为这是APAAP技术来诊断患儿鼻咽部脱落细胞内的RSV-Ag获得满意效果的主要原因之一。     

用APAAP桥联酶标技术快速诊断合胞病毒

应用碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶（ＡＰＡＡＰ）桥联酶标技术，对１１６例急性下呼吸道感染的患儿，进行合胞病毒抗原快速诊断研究，并与免疫荧光（ＩＦＡ）技术对照。二者阳性符合率９８．００％，阴性符合率９５．３８％，准确性为９６．５５％，进一步证明，ＡＰＡＡＰ桥联酶标技术特异性好，灵敏性高，用于呼吸道细胞检测，无内源性酶的干扰，并且操作简便，无需荧光显微镜，优于ＩＦＡ技术，可用于合胞病毒感染的快速诊断；与ＩＦＡ技术联用，可提高阳性检出率。     

呼吸道合胞病毒单克隆抗体的制备及鉴定

目的：建立能稳定分泌抗呼吸道合胞病毒（RSV-long株,国际标准株）单克隆抗体的杂交瘤细胞株。方法：杂交瘤技术制备单抗,鉴定各项特性。结果：培育出稳定分泌抗RSV蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞5株。杂交瘤细胞株染色体数目在89～104条之间,其分泌的抗体分别属于鼠IgG1、IgG2a、IgG2b亚类,各种腹水单抗的荧光效价在1∶4000～1∶16000之间。一种单抗识别RSV基质蛋白（M）,两种单抗识别RSV融合蛋白（F）,另两种单抗识别RSV核衣壳蛋白（N）。单抗中和效价最高达1∶64。相加指数证实5种单抗识别不相关的抗原表位。用硫氰酸铵洗脱法比较了五种单抗相对亲和力的大小,依次为：1#〉2#〉4#〉3#〉5#。所有杂交瘤细胞株,经连续3个月培养及冻存半年后复苏,细胞生长良好,检测上清,其分泌抗体效价稳定。结论：已获得抗呼吸道合胞病毒的单克隆抗体,为RSV感染的早期诊断及进一步研究奠定了基础。     

呼吸道合胞病毒 L 蛋白单克隆抗体的制备

目的：制备人呼吸道合胞病毒L蛋白单克隆抗体,并对其进行性质鉴定。方法：选取RSV-A2 L蛋白上具有亲水性可能的loop区段,将这些目的片段展示在HBc149上进行原核表达并纯化。重组蛋白免疫6~8周BALB/c雌性小鼠,根据免疫后血清的ELISA和WB分析结果选择L3935和L4099组小鼠进行脾脏免疫。融合后,用间接ELISA法筛选和多次克隆化,获得稳定分泌抗L蛋白单克隆抗体细胞株,并结合ELISA、免疫荧光和免疫印迹对所获得的单抗进行鉴定。结果：获得11株L蛋白特异性单克隆抗体,亚类鉴定结果IgG1、IgG2a和IgG3单抗各3株,IgG2b单抗2株。结论：成功制备了L蛋白特异性单克隆抗体,也为RSV感染的免疫和发病机制研究奠定基础。     

呼吸道合胞病毒逃逸株对单克隆抗体预防的抗性比较

目的 Palivizumab（PZ）是目前临床使用的惟一一个预防人类感染性疾病的单克隆抗体，本研究评估不同逃逸株在棉鼠体内对PZ预防的抗件。方法在细胞培养系统中筛选获得PZ逃逸株，测定其全长F基因序列，用微量中和法评估逃逸株对PZ的抗性，在棉鼠模型体内观察逃逸株对PZ预防的抗性差异。结果筛选获得的PZ逃逸株于F蛋白内第268位氨基酸（F212）和272位氨基酸（MP4、MS312、MS412和MS512）发生替换。用Western blot检测发现所有逃逸株PZ识别位点抗原性改变。F212复制能力受损，而其他逃逸株复制能力与A2母株接近。与A2原型株比较，MP4和MS412在体内外对PZ的中和活性具完全抗性。F212体外对PZ中和活性显示不完全抗性，但大剂量PZ在棉鼠体内仍能有效预防F212感染。结论不同PZ逃逸株体内对PZ的预防效应可能具有不同程度的抗性，某些逃逸株即使在PZ筛选压力下产生，亦不一定导致临床后果。     

呼吸道合胞病毒抗原酶联免疫吸附测定检测方法的建立及应用

目的建它呼吸道合胞病毒抗原酶联免疫吸附测定(ELISA)检测方法,应用其对来源于本院的临床样本进行检测.方法建立ELISA方法,检测标本中的呼吸道合胞病毒,与呼吸道合胞病毒细胞培养检测方法进行对照,并利用该方法进行该病毒2007年在广州市的流行性分析.结果本方法的灵敏度略高于呼吸道合胞病毒的细胞培养检测方法,对甲型流感病毒(H3N2亚型、H1N1亚型)、乙型流感病毒、副流感病毒(Ⅰ型、Ⅲ型)、呼吸道腺病毒(Ⅲ型、Ⅶ型)无特异性反应.结论本呼吸道合胞病毒抗原ELISA检测方法可用于呼吸道合胞病毒感染的临床诊断和鉴别诊断.     

人源抗呼吸道合胞病毒基因工程单克隆抗体Fab段基因的筛选和表达

目的采用噬菌体表面呈现和重组抗体技术构建人噬菌体抗体基因库，筛选获得人源抗呼吸道合胞病毒（RSV）Fab段基因并在原核细胞中表达。为研制安全、有效的预防和治疗RSV感染的制剂奠定基础。方法从RSV感染患儿恢复期外周血淋巴细胞中提取细胞总RNA，用一组人IgGF出特异性引物，通过RT—PCR扩增得到一组轻链（κ和λ）和重链Fab段基因，并将此轻链和重链基因片段克隆于pComb3噬菌体载体，电转化XL1-Blu菌构建成抗RSV噬菌体抗体基因库。用纯化病毒颗粒作抗原对此抗体库进行了富集筛选，得到了特异性针对RSV的人源单克隆抗体Fab段基因，并在大肠杆菌中获得有效表达。用ELISA方法检测了此Fab抗体的抗原特异性，并对阳性克隆进行了基因序列分析。结果所构建的抗体库库容为108，从此抗体库中筛选得到的阳性克隆所表达的Fab抗体能与RSV纯化抗原特异性结合，保留了对RSV的抗原特异性。核苷酸序列分析证实，所获得的阳性克隆基因为人源IgG基因。结论本实验获得了特异性抗RSVFab抗体基因并在大肠杆菌中获得表达，表达产物能与RSV抗原特异性结合。     

甲型和乙型流感单克隆抗体用于碱性磷酸酶桥联酶标快速诊断

作者将甲型和乙型流感单克隆抗体(McAb)用于桥联酶标技术快速诊断流感抗原125例,以IFA技术作对照,获得满意效果。其阳性符合率是87.5％;阴性符合率是96.1％。由于碱性磷酸酶主要存在于肠道,而呼吸道细胞几乎不含此酶,因此没有内源酶的干扰,结果在一般光学镜下格外清晰易辨。此技术诊断流感快速,2h内可得到准确结果。染色封片后半年内细胞着色不变。有利于实验室之间的质量控制和作回顾性研究。     

婴幼儿呼吸道合胞病毒肺炎的心酶谱变化及临床意义

１９９７年１月至１９９８年１月，作者等观察８４例呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）阳性的喘息性支肺炎血清ＣＰＫ，ＬＤＨ，ＧＯＴ并与正常小儿３２例相对照，结果显示喘肺病儿的心酶的变化均高于正常组（Ｐ〈０．０１），恢复时间也较长，尤经ＬＤＨ变化最明显，作者提出小儿呼吸道合胞病毒肺炎时心酶谱改变可有非心脏因素，可作为该病的诊断及观察病情的参考指标。     

呼吸道合胞病毒逃逸株对单克隆抗体预防的抵抗

目的探讨体外筛选的呼吸道合胞病毒抗体逃逸株生长特性、F蛋白免疫反应性及在棉鼠体内对抗体免疫预防的抵抗，旨在证实用单克隆抗体免疫预防的负面效应，为今后临床可能出现的抗体逃逸株提供线索。方法呼吸道合胞病毒(RSV)A2株在逐渐升高的Pahvizumab(PZ)浓度环境中连续传代5次并经单噬斑纯化后获得PZ逃逸株MP4。用RT-PCR法扩增A2及MP4全长F基因并自动测序；用微量中和试验鉴定MP4在体外对PZ中和反应的抗性；用Western blot鉴定其F蛋白免疫反应性的变化；最后在棉鼠模型内观察PZ预防A2和MP4感染的效果。结果与A2母株比较，MP4于F基因828位核苷酸发生突变(A→T)，导致272位推导氨基酸由赖氨酸变为甲硫氨酸。MP4在体外及在棉鼠肺内的生长能力无明显改变。MP4F蛋白虽仍可表达于受感染细胞膜上，但不再被PZ识别。动物实验证实，即使大剂量PZ亦不能预防MP4感染。结论体外筛选的PZ逃逸株在棉鼠模型体内对同一抗体的免疫预防具有极强的抗性，类似情况是否会在人体内发生及是否会导致严重后果尚有待进一步研究。     

单克隆抗体酶联免疫吸附试验在结核性脑膜炎诊断中的初步应用

应用单克隆抗体酶联免疫吸附试验检测38例结核性脑膜炎，33例其它脑膜炎在112例非脑膜炎患者脑脊液中的结核杆菌抗原和抗体。结果脑脊液结核抗原阳性率为81．6％，假阳性率为2．8％；结核抗体阳性率为86．6%，假阳性率为3．4％．提示本法可作为结核性脑膜炎有效的辅助诊断方法。动态观察尚可为疗效判断提供依据。     

APAAP桥联酶标技术的建立及初步应用

本文运用淋巴细胞杂交瘤技术获得5个产生抗碱性磷酸酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株,同时设计一种改良ELISA方法用于筛选抗碱性磷酸酶单克隆抗体。筛选出的单克隆抗体能与碱性磷酸酶结合形成可溶性的复合物,即碱性磷酸酶一抗碱性磷酸酶抗体(APAAP)复合物。这些APAAP复合物仍保留有较高的酶活性,并可改良ELISA方法确定其酶一抗酶抗体的配制比例。在免疫组化染色中,APAAP复合物通过桥联二抗及显色系统能在组织原位较好地显示与一抗相对应的抗原物质。这种APAAP桥联酶标记技术显色鲜明,染色背景清晰,染色后的组织形态仍保存完好。APAAP桥联酶标记技术结合免疫金银染色进行免疫组化双重标记也取得了满意的标记效果。初步应用结果表明APAAP桥联酶标记技术是一种简便、灵敏、易于推广的实用免疫组织化学方法。     

呼吸道合胞病毒的分型研究

目的 了解北京地区１９９０￣１９９１年和１９９７￣１９９８年两个非连续的流行年中呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）Ａ、Ｂ亚型和基因型的流行情况。方法 用间接免疫荧光法（ＩＩＦ）检测ＲＳＶ阳性鼻咽分泌物（ＮＰＳ）标本或ＲＳＶ分离株,划分Ａ、Ｂ亚型。根据Ｎ基因片段的限制性酶切图型将ＲＳＶ分离株分成至少６个基因型ＮＰＩ－６ＮＰＩ,３和６属于Ｂ亚型,ＮＰ２４和５属于Ａ亚型。根据ＳＨ基因片段的核苷酸序列将Ａ亚型分离株     

呼吸道合胞病毒单克隆抗体逃逸株体外适合度变化

目的 Palivizumab(PZ)是针对呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)F蛋白的人源化单克隆抗体(ScAb).本研究观察PZ逃逸株体外适合度变化规律.方法 采用竞争复制法测定两株Pz抵抗株(F212和MP4)的体外适合度.将等量F212和母株A2混合后在HEp-2细胞中连续转代,在不同时间点采用差异噬斑法、核酸序列图谱分析法和限制性片段多态性法分析混合病毒群体中F212和A2的比例.由于MP4在细胞培养和棉鼠肺内复制水平与A2相似,故将A2和MP4按照1:1、10:1、100:1和1000:1的比例混合并在HEp-2细胞中竞争复制,不同时点采用差异噬斑法和核酸序列图谱分析法分析混合病毒群体中MP4和A2比例.结果 等比例混合的F212/A2混合群体在传代至10代时,F212已基本消失,传至35代时仍无F212信号,提示其适合度低于A2.A2/MP4混合病毒群体中,除按1000:1比例预混外,其余所有比例预混的病毒中MP4均成为优势株,因而提示MP4的适合度高于A2.结论 首次发现RSV PZ逃逸株适合度可超过原型株A2,了解适合度增加或降低的机制对减毒活疫苗的研究有理论指导意义.