凋亡相关基因Bcl-2和Bax在糖尿病大鼠视网膜中的表达

目的 研究凋亡相关基因Bcl-2,Bax在早期糖尿病大鼠视网膜的表达，探讨其在糖尿病视网膜病变细胞凋亡中的作用。方法 选择健康成年Wistar大鼠40只，随机分成正常对照（CON），糖尿病1个月（DM1），3个月（DM3）及6个月（DM6）组，腹腔内注射链脲佐菌素（STZ）诱发大鼠糖尿病，制备大鼠视网膜石蜡切片行免疫组化ABC法染色，并对染色结果进行计算机图像分析。结果 于CON及DM各组，Bax和Bcl-2二基因的蛋白均在视网膜血管表达，且随病程进展，其阳性反应强度逐渐增加，此外，Bcl-2阳性反应在DM3组于色素上皮细胞出现，在DM6组，再进一步扩大到视杆内节和节细胞，而Bax在DM6亦出现于节细胞。结论 凋亡相关基因Bcl-2和Bax在早期糖尿病大鼠视网膜血管和神经细胞的表达随病程的进展逐渐增强，二者在糖尿病视网膜细胞凋亡中起重要作用。     

五花血藤提取物对大鼠视网膜缺血再灌注损伤中凋亡相关因子表达的影响

目的　探讨五花血藤提取物（sargentodoxa cuneata extracts,SCE）对大鼠视网膜缺血-再灌注损伤（RIRI）中凋亡相关因子Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表达的影响。方法　选取健康清洁级成年SD大鼠90只,随机分成对照组、RIRI组与SCE组,每组30只。于RIRI后6 h、12 h、24 h、48 h与72 h时,每组分别随机处死6只大鼠进行相关实验。通过Nissl染色观察各组大鼠视网膜神经细胞形态学的变化,免疫组织化学法检测各组大鼠视网膜内各细胞层凋亡相关因子Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达。结果　对照组视网膜神经节细胞内Nissl小体丰富,染色较深,呈块状分布;RIRI组Nissl小体较对照组少,染色浅且分布不均;SCE组染色情况均较RIRI组有所改善。Bcl-2蛋白在对照组中几乎不表达,在24 h RIRI组中其阳性表达开始增强,48 h时达到高峰,在SCE组各个时间点上Bcl-2蛋白阳性表达均多于RIRI组,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。Bax蛋白在对照组中略有表达,在12 h RIRI组中其阳性表达持续增多,24 h时达到高峰,在SCE组各个时间点上Bax蛋白阳性表达均低于RIRI组,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。Caspase-3蛋白在对照组中几乎不表达,在6 h RIRI组中表达开始升高,12 h时达到高峰,在SCE组各个时间点上Caspase-3蛋白阳性表达均低于RIRI组,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　SCE可能通过上调Bcl-2蛋白表达的同时下调Bax、Caspase-3蛋白的表达来发挥抗凋亡作用,从而对大鼠RIRI起到保护作用。     

外源性H2S预处理对大鼠RIRI细胞凋亡的影响

目的:探讨气体信号分子硫化氢(H2S)对大鼠视网膜缺血再灌注损伤(retinal ischemia-reperfusion injury,RIRI)过程中细胞凋亡及Bcl-2和Bax蛋白表达的影响。方法:以硫氢化钠(NaHS)作为H2S的供体。将54只SD大鼠随机分成正常组、视网膜缺血再灌注损伤组(RIRI组)及硫氢化钠(NaHS)干预组,后两组进一步分为再灌注后6,24,48,72h组。采用前房灌注加压的方法建立RIRI模型,TUNEL法检测视网膜神经细胞凋亡,免疫组织化学法检测视网膜组织中Bcl-2和Bax蛋白的表达。结果:细胞凋亡出现于缺血灌注后6h,并逐渐递增,24h达到高峰,48h开始下降。与RIRI组比,NaHS组Bcl-2蛋白表达增多,Bax蛋白表达减少(均P<0.05)。结论:H2S预处理可通过上调Bcl-2蛋白表达、下调Bax蛋白表达、升高Bcl-2/Bax比值从而调控细胞凋亡,对大鼠RIRI进行保护作用。     

锌抗糖尿病大鼠视网膜神经细胞凋亡的实验研究

目的探讨锌对糖尿病大鼠视网膜神经细胞凋亡的作用及对凋亡相关基因表达的影响。方法链尿佐菌素诱导糖尿病大鼠模型,随机分成3组,即正常对照组、糖尿病模型组和硫酸锌治疗组,7周后处死实验大鼠,HE染色光镜观察视网膜组织结构和细胞形态,TUNEL技术检测细胞凋亡情况,免疫组化SP法测定Bcl-2、Bax以及Caspase-3蛋白表达水平。结果糖尿病模型组与正常对照组相比,大鼠视网膜神经细胞凋亡数分别为17.12±0.38和4.16±0.63(P<0.001);Bcl-2阳性细胞数分别为15.01±0.35和23.78±1.13(P<0.001);Bax和Caspase-3蛋白表达水平在糖尿病组为15.41±0.36和22.12±1.18,在正常组2者表达水平分别为6.48±0.82和4.92±0.59,2者差异均具有显著性(P<0.001);锌治疗组与模型组比较,TUNEL阳性表达减少(13.09±0.54),Bcl-2阳性细胞数增多(19.82±0.39),Bax和Caspase-3蛋白表达水平下降(11.20±1.25,18.36±0.43),2者各实验指标差异有统计学意义(P<0.01)。结论硫酸锌能减少糖尿病大鼠视网膜神经细胞的凋亡,其抗凋亡作用可能与上调凋亡抑制基因Bcl-2的表达及下调凋亡促进基因Bax以及Caspase-3蛋白酶的表达有关。     

重组人促红细胞生成素对眼挫伤后大鼠视网膜的保护机制

目的：探讨重组人促红细胞生成素（recombinant human erthropoietin, rhEPO）对挫伤视网膜Bcl-2和Bax的调节作用,明确重组rhEPO对挫伤视网膜的保护机制。 方法：两月龄雄性大鼠45只,5只用于正常对照组,余下40只仿Allen重击法制作视网膜挫伤模型致左眼挫伤。将模型制备成功大鼠随机分为两组：模型组和rhEPO治疗组,每组各20只大鼠,每组又分12和24h;3和7d共四个时间点,每个时间点大鼠5只。rhEPO组大鼠ip rhEPO,1次/d;模型组用同体积的生理盐水ip。各组各时段于给药给水停止后第2d取材,石蜡切片。应用免疫组织化学方法检测视网膜组织中Bcl-2和Bax蛋白的表达变化。 结果：正常对照组视网膜内均有适量Bcl-2和Bax蛋白表达;模型组Bcl-2蛋白表达随时间推移逐渐下降,至3d时表达最低。除12h外,其余各组Bcl-2蛋白表达均比正常对照组低。而Bax蛋白表达逐渐上升,至3d达峰值。除12h外,其余各组Bax蛋白表达均比正常对照组高;rhEPO组Bcl-2蛋白表达均比模型组高,而Bax蛋白表达均比模型组低。 结论：Bcl-2和Bax参与了眼挫伤视网膜病变过程;rhEPO能够上调挫伤后大鼠视网膜细胞Bcl-2蛋白表达和下调Bax蛋白的表达,以抑制损伤视网膜细胞的凋亡。     

N-乙酰半胱胺酸对大鼠挫伤性视网膜病变的保护作用

目的:研究凋亡相关基因Bcl-2/Bax在大鼠挫伤性视网膜病变中的表达,以及N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-cysteine,NAC)对其表达的影响。方法:自由落体法制作视网膜挫伤模型。将SD大鼠随机分为正常组6只、模型组24只及治疗组24只。每组按挫伤后不同时间段分为1,3,7,14d,每个观察时段6只大鼠。HE染色光镜观察视网膜组织学变化,应用SABC免疫组织化学法检测大鼠视网膜挫伤后视网膜组织Bcl-2/Bax蛋白表达的变化。结果:挫伤性视网膜病变的损害主要集中在神经纤维层。挫伤后视网膜组织水肿,细胞紊乱,胞浆空泡样变,视网膜组织变薄,细胞丢失。NAC治疗组视网膜水肿程度有所改善,细胞紊乱,胞浆空泡样变,细胞丢失有所恢复。正常组及NAC治疗组视网膜组织Bax均未见表达,Bcl-2低表达。视网膜挫伤后1d时Bax表达开始增多,3d强阳性表达,7d表达有所减少,14d时表达进一步减少。Bcl-2低表达,未见明显变化。NAC治疗组各观察指标变化趋势基本与视网膜挫伤组相似,但表达明显减弱,两组相比较,于挫伤后1,3d和7d时差异有统计学意义(P<0.05)。Bcl-2在各时段的表达均较模型组有所增强,两组相比较,于挫伤后1,3d和7d时差异有统计学意义(P<0.01)。结论:在大鼠挫伤性视网膜病变中,NAC能够改善视网膜组织病理学损害并通过调节Bcl-2/Bax蛋白表达而抑制细胞凋亡,对视网膜挫伤具有保护作用。     

挫伤性视网膜病变中光感受器细胞凋亡与相关基因表达的研究

目的探讨挫伤性视网膜病变中Bax、Bcl-2表达与光感受器细胞凋亡的关系。方法自由落体法制作视网膜挫伤模型,行HE染色观察大鼠视网膜组织的病变情况;末端脱氧核酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记(TUNEL)法检测感光细胞凋亡情况;PV免疫组织化学法检测视网膜组织中Bax、Bcl-2的表达。结果TUNEL染色显示挫伤后3d组视网膜内可见较多阳性表达的细胞,分布在外核层。余实验组未测到阳性着色细胞。Bax在挫伤后4h即有表达,随时间延长表达逐渐增加,至挫伤后3d达高峰,至7d、14d组表达阴性。Bcl-2的表达在各组均为阴性。结论细胞凋亡是挫伤性视网膜病变的重要机制之一,Bcl-2/Bax相对比值改变可能对细胞凋亡的发生起一定的诱导作用。     

视神经钳夹伤后凋亡相关基因Bcl-2和Bax在大鼠视网膜上的表达

目的研究视神经钳夹伤后凋亡相关基因Bcl-2和Bax在大鼠视网膜上的表达,探讨Bcl-2和Bax在视神经钳夹伤后视网膜神经元凋亡中的作用。方法将雄性LongEvans大鼠50只,随机分成实验组和对照组,每组25只大鼠。建立大鼠视神经钳夹伤模型,实验组和对照组按视神经夹伤后不同时间分为伤后1 d、3 d、5 d7、d1、4 d 5个时间点,每个时间点5只动物。处死动物后取材,制备大鼠视网膜石蜡切片,进行免疫组化SABC染色,以检测视网膜Bcl-2和Bax的表达。结果视神经钳夹伤后视网膜Bcl-2的表达下降,而Bax表达仍为不变的水平。结论视神经钳夹伤后视网膜Bcl-2表达的下降,导致了视网膜神经元的凋亡。     

银杏内酯B联合视网膜干细胞移植对青光眼大鼠的影响及机制研究

目的：研究银杏内酯B联合干细胞移植对青光眼大鼠的影响及相关机制。

方法：实验共分为五组：正常对照组(Control)、青光眼模型组(GLA)、干细胞组(RSCs)、银杏内酯B组(GKB)与混合组(RSCs+ GKB)。眼球组织进行HE染色,TUNEL染色检测视网膜神经节细胞的凋亡,免疫印迹法(Western blot)检测Bcl-2、Bax以及Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9的蛋白表达水平,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分别检测各组组织中Bcl-2、Bax mRNA表达水平。

结果：HE染色结果显示,给予干细胞或银杏内酯B处理,减少纤维间质水肿与空泡的出现,混合组纤维间质少见水肿与空泡; 银杏内酯B联合干细胞处理后显著减少视网膜神经节细胞的凋亡,上调Bcl-2的蛋白与mRNA表达水平,并下调Bax的蛋白与mRNA表达水平、Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9的蛋白表达水平。

结论：银杏内酯B联合干细胞能够抑制青光眼大鼠视网膜神经节细胞的凋亡,改善青光眼,其作用机制可能与调控Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9因子的表达有关。     

PEDF对大鼠视神经急性损伤后神经节细胞的保护作用

目的:观察色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor,PEDF)对大鼠视神经急性损伤后视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)的保护作用.方法:选取健康雌性SD大鼠60只随机分为:空白组、模型组和实验组,每组各20只.采用视神经夹伤方法,建立大鼠视神经急性损伤模型.模型组制作视神经损伤模型成功后即刻向玻璃体腔注射平衡盐溶液5μL,之后的1、2wk分别向玻璃体腔注射平衡盐溶液5μL;而实验组在视神经损伤模型制作成功后即刻向玻璃体腔注射PEDF 5μL,同样在1、2wk时分别向玻璃体腔注射PEDF 5μL.通过HE 染色,光镜下观察视网膜形态学变化并且对视网膜神经节细胞进行计数.通过免疫组织化学半定量的方法对Bcl-2和Bax的表达进行检测,观察PEDF对受损视神经的影响.结果:HE染色观察,实验组神经节细胞从细胞形态上要好于模型组,且RGCs数量较模型组多.实验组的Bcl-2和Bax的蛋白表达与空白组、模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05),实验组较模型组Bcl-2蛋白表达增加,Bax蛋白表达下降.结论:PEDF可通过上调视网膜Bcl-2蛋白的表达、减弱Bax蛋白表达,以减弱或抑制视神经损伤后RGCs的细胞凋亡,减轻视神经损伤.     

手机光照刺激对视网膜色素上皮细胞的影响

目的：观察手机光照刺激体外培养人视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium; RPE)后形态及B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl2-Associated X(Bax)、半胱天冬酶-3(Caspase-3)的mRNA表达变化。

方法：将体外培养的人RPE细胞随机分成4组,根据RPE细胞光照时间长短分为照射3h光照组、6h光照组、12h光照组和0h光照组。在特制的培养箱内,将智能手机屏幕开到最大亮度(200±20Lx)做为光源,持续静音情况下循环播放彩色图片。然后应用苏木精-伊红(HE)染色法,末端脱氧核糖核酸转移酶介导的原位缺口末端标记(TUNEL)染色,四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色(MTT)法观察各实验组RPE细胞形态学改变,并运用聚合酶链反应(PCR)技术检测各组细胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3的mRNA表达变化。

结果：用HE染色、TUNEL染色、MTT法观察发现各光照组RPE细胞形态学无明显改变,差异均无统计学意义(P>0.05)。应用PCR技术检测发现RPE细胞在光照刺激3h光照组和6h光照组,细胞内的Bcl-2、Bax、Caspase-3的mRNA表达与0h光照组的差异均无统计学意义(P>0.05)。但随着光照时间持续延长(12h),细胞内的Bcl-2表达下调,Bax、Caspase-3表达水平均上升,差异均有统计学意义(P<0.05)。

结论：手机屏幕等作为人造光源在长期持续高亮度照射下会引起体外培养人视网膜色素上皮细胞的损伤。     

早期衰老大鼠视网膜色素上皮-光感受器细胞复合体超微结构的变化

目的：观察早期衰老大鼠视网膜色素上皮-光感受器细胞复合体超微结构的变化。

方法：取3月龄及12月龄大鼠视网膜,制成半薄切片,透射电镜下观察视网膜色素上皮-光感受器细胞复合体超微结构的变化。

结果：12月龄大鼠视网膜中出现视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium, RPE)凋亡和RPE-光感受器细胞复合体的退行性改变。

结论：视网膜色素上皮-光感受器细胞复合体的退行性改变是视网膜衰老的早期表现。     

糖尿病大鼠早期视网膜形态观察和Bcl-2、Bax及VEGF表达的意义

目的：探讨B-细胞淋巴瘤因子(B-cell lymphoma factor,Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bcl2-Associated X protein,Bax)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在早期糖尿病大鼠视网膜上的表达及意义。

方法：用链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)腹腔注射(60mg/kg)制作大鼠早期糖尿病模型。于造模后4、8、12wk颈椎脱臼法处死大鼠,取双眼全眼球组织做石蜡切片并做视网膜铺片,通过HE染色观察视网膜各层的形态学和血管分布变化; 取双眼视网膜组织石蜡切片,通过免疫组化法检测Bcl-2、Bax和VEGF在视网膜组织中的表达。行ADP酶视网膜血管染色,观察视网膜血管形态变化。应用激光共聚焦显微镜检测视网膜细胞的形态、细胞中Ca²⁺的荧光强度和分布变化。

结果：糖尿病组造模12wk突破内界膜的内皮细胞核个数呈递增趋势。糖尿病组视网膜中周部和周边部可见无血管区,无血管区面积也明显大于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。糖尿病组大鼠VEGF、Bcl-2和Bax光密度值与空白对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。糖尿病组大鼠造模4、8、12wk比较,RGCs内钙离子荧光浓度逐渐升高,荧光染色强度比值升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。

结论：早期糖尿病大鼠视网膜的Bcl-2和Bax表达非常明显,从而上调 VEGF的表达。Bcl-2、Bax和VEGF是糖尿病视网膜病变中新生血管形成的重要影响因素。     

褪黑素对大鼠糖尿病视网膜病变的影响

目的： 探讨褪黑素对大鼠糖尿病视网膜病变的影响及其机制。

方法： 选用健康雄性SD大鼠40只,随机分为4组,正常对照组、糖尿病组、低剂量褪黑素组和高剂量褪黑素组,HE染色观察视网膜结构改变,电镜观察视网膜神经节细胞超微结构变化,黄嘌呤氧化酶法检测视网膜组织中超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)水平,Western Blot检测B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax)及P53的蛋白表达水平。

结果： HE染色结果显示,正常对照组大鼠视网膜组织结构清晰,糖尿病组大鼠视网膜组织层次欠清晰,神经纤维层水肿,低剂量褪黑素组视网膜细胞分层基本分明,层间细胞排列较整齐,内外核层排列稍紊乱,高剂量褪黑素组大鼠视网膜组织结构较低剂量褪黑素组进一步改善; 电镜观察结果显示,与糖尿病组比较,褪黑素组大鼠视网膜神经节细胞形态均不同程度改善; 黄嘌呤氧化酶法检测结果显示,褪黑素组大鼠视网膜组织中SOD水平高于糖尿病组,MDA水平低于糖尿病组(均P<0.05); Western Blot结果显示,低、高剂量褪黑素组与糖尿病组比较,Bcl-2蛋白表达逐渐升高,Bax、P53蛋白表达明显降低(均P<0.05)。

结论：褪黑素可改善糖尿病大鼠视网膜形态变化,对糖尿病视网膜病变有一定抑制作用。     

Simvastatin upregulates Bcl-2 expression and protects retinal neurons from early ischemia/reperfusion injury in the rat retina

Simvastatin has been shown to enhance the survival of retinal ganglion cells (RGCs) following ischemia-reperfusion (IR) injury by mediating the expression of stress proteins. The purpose of this study was to investigate the effect of simvastatin on retinal neurons and the expression of apoptotic proteins in a rat IR model. Wistar rats received intravitreal injection of simvastatin immediately after retinal reperfusion. Retinal ischemia was induced by increasing intraocular pressure to 150 mmHg for 60 min. The number of viable RGCs was measured after retrograde labeling with Fluoro-Gold. Ischemia-induced apoptotic cell death was studied using terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL). We found that simvastatin treatment enhanced RGC survival after retinal ischemia by approximately 40% and decreased retinal neuronal apoptosis. Using western blot analysis, we found that simvastatin upregulated the expression of Bcl-2 in the retina. In contrast, the level of the protein Bax was unaffected by simvastatin treatment. Our results suggest that RGC loss induced by retinal IR may be prevented by simvastatin and that the mechanism underlying this process possibly involves an alteration in the apoptotic pathway.     

玻璃体腔内注射康柏西普联合532激光治疗视网膜静脉阻塞

目的：评价0.5mg的康柏西普注射联合532激光对视网膜静脉阻塞(RVO)的效果及安全性。

方法：2015-05/2016-03住院治疗的RVO病例122例122眼,按照随机数字表法随机分为研究组58例58眼(其中中央静脉阻塞患者24例24眼,分支静脉阻塞患者34例34眼)和对照组64例64眼(其中中央静脉阻塞患者26例26眼,分支静脉阻塞患者38例38眼)。两组患者行康柏西普玻璃体腔内注射术。研究组注射药物前行532激光治疗。治疗前及治疗后1、3、6mo复查行光学相干断层扫描(optical coherence tomography,OCT)检查,比较两组最佳矫正视力(best corrected visual acuity,BCVA),黄斑中心凹厚度及视网膜色素上皮(RPE)隆起的面积。

结果：治疗后1、3、6mo两组的BCVA均较术前提高,具有统计学意义(P<0.05); 治疗后3、6mo研究组BCVA提高均大于对照组,具有统计学意义(P<0.05),1mo两组间差别无统计学意义。黄斑中心凹厚度及直径3mm²圆内RPE隆起的厚度均较术前减小,具有统计学意义(P<0.05)。对于黄斑中心凹厚度及直径3mm²圆内RPE隆起的厚度,研究组下降水平均大于对照组,治疗后3、6mo均具有统计学意义(P<0.05),但治疗后1mo两组间的差别无统计学意义。所有患者均未出现不良反应。

结论：康柏西普注射可提高患者视力,降低黄斑中心凹厚度及RPE隆起的面积,与532激光合用对RVO效果较单纯药物注射更好。     

p75 NTR受体在视网膜色素上皮细胞氧化损伤中的作用及机制

目的：研究p75 NTR受体在视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cells,RPE)氧化损伤过程中的作用及机制。

方法：将转染p75 NTR受体的RPE细胞作为实验组,未转染的RPE细胞作为对照组。BrdU检测法检测细胞增殖活性; PI/Annexin V-FITC双染法检测细胞凋亡率; 激光显微镜观察细胞内ROS的表达情况; 流式细胞仪检测细胞内ROS、线粒体标志物、细胞色素C表达水平; Western blot法检测细胞中Fas蛋白、裂解Caspase-3、VEGF165蛋白的表达水平。

结果：随着p75 NTR受体转染时间的延长,实验组RPE细胞的增殖活性呈逐渐降低趋势,各转染时间点的RPE细胞增殖活性比较,差异有统计学意义(P<0.05); 实验组各转染时间点的RPE细胞增殖活性均明显低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。随着转染时间的延长,实验组RPE细胞凋亡率呈逐渐增加趋势,各转染时间点的RPE细胞凋亡率比较,差异有统计学意义(P<0.01); 实验组各转染时间点的RPE细胞凋亡率均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.01)。实验组ROS荧光信号明显强于对照组。流式细胞仪检测结果显示,实验组RPE细胞中ROS、细胞色素C水平均明显高于对照组,线粒体标志物水平明显低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.01)。Western blot 法检测结果表明,实验组细胞内Fas蛋白、Caspase-3、VEGF₁₆₅蛋白的表达水平均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.01)。

结论：p75 NTR受体高表达可导致RPE细胞线粒体发生损伤,同时促进细胞凋亡,最终导致脉络膜新生血管的形成,表明p75 NTR受体可能是导致RPE细胞发生损伤的因素之一。