PCR制备地高辛配基标记的探针检测登革病毒核酸

用聚合酶链反应(PCR)技术，以重组质粒PDEⅡ305 DNA为模板．在底物中补充标记的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(DIG-dUTP)，经扩增反应制备了地高辛配基标记的登革病毒2型(DEN2)cDNA探针。DNA-RNA斑点杂交表明该探针有DEN2型特异性，可检出0．1pgDEN2-RNA。PCR扩增标记只用10ng模板DNA，数小时内可制备约1ug标记的cDNA探针，而用六聚棱苷酸随机引物(RHP)标记，从质粒DNA酶切、片段回收到标记获得探针，至少需数10h。可见PCR技术直接制各地高辛配基标记的cDNA探针较方便，快速、标记率高、特异性强，具有一定的应用前景。     

简便,敏感的地高辛标记DNA探针原位分子杂交技术

本文应用人乳头瘤病毒6B和11型基因探针原位分子杂交技术检测了57例尖锐湿疣和假性湿疣。同时用免疫组化ABC法做对照检测。探针标记选择地高辛随机引物延伸法。原位分子杂交的主要步骤包括:石蜡切片的预处理;杂交;免疫检测及显色。结果显示:在尖锐湿疣中,人乳头瘤病毒的阳性率为94.4％;免疫组化核壳抗原检测阳性率为47.2％;假性湿疣杂交结果均为阴性。结果表明:原位分子杂交方法比免疫组化方法敏感,提高了阳性率。本实验过程中遇到并试图解决的主要技术问题有:(1)防止脱片;(2)蛋白酶K的浓度;(3)显色时间的掌握;(4)左旋脒唑的剂量。     

地高辛标记探针与生物素标记探针用于斑点杂交检测HBV DNA的初步研究

为研究地高辛标记和生物素标记核酸探针斑点杂交检测ＨＢＶ ＤＮＡ的敏感性、特异性和稳定性，用两种探针和＾３２Ｐ标记探针进行平行检测对照。结果表明，地高辛探针检测灵敏度为０．１Ｐｇ，已达到＾３２Ｐ标记探针水平。生物素探针为１￣１０Ｐｇ。两种探针与＾３２Ｐ标记探针相比。符合率分别９６．６５％和８９．１３％；敏感性分别为９４．４４％和８３．３３％；特异性分别为９６．４３％和９２．８６％。两种探针在－２０℃     

地高辛标记核酸探针的应用

本工作中以肿瘤多药耐受基因ＭＤＲ－１的ｃＤＮＡ的限制片段（５Ａ）为模板ＤＮＡ，把模板ＤＮＡ用随机引物法标记上地高辛标记的脱氧尿苷三磷酸ＤＩＧ－ｄＵＴＰ。将此地高辛标记的核酸探针与变性的同源质粒及部分头颈肿瘤组织ＲＮＡ进行点杂交后，用抗地高辛－碱性磷酸酶及其底物进行酶联免疫分析，探讨了应用这种非放射性地高辛标记的ＤＮＡ探针及其检测系统的敏感性以及应用价值。     

地高辛标记探针检测rhIL－2制品中微量DNA

地高辛标记探针检测ｒｈＩＬ－２制品中微量ＤＮＡ宋静，孙汶生，张利宁，曹英林，厉保秋，刘振生，高丰光（微生物学教研室毒理学研究室济南泉城生物工程研究所）ＤＮＡ是生物遗传的物质基础，作为注射用的基因工程制品，其中的微量ＤＮＡ可能对人体产生较大的危害。因此...     

地高辛素标记HBV—DNA探针的临床应用

应用地高辛素标记HBV－DNA探针进行斑点杂交，检测130例慢性乙型肝炎患者血清HBV－DNA结果表明，HBsAg、HBeAg、抗HBc同时阳性者，HBV－DNA检出率为96％；HBsAg、抗He同时阳性者HBV－DNA检出率为505；HBsAg、抗HBc同时阳性者HBV－DNA检出率为60％；在6例抗HBs、抗HBC同时阳性血清中，发现1例为HBV－DNA阳性，认为，随着HBV－DNA检测方法学的改进，敏感性的提高，对原有HBV血清免疫学标志应有新的认识。     

PCR法快速制作地高辛配基标记的人型结核杆菌DNA探针

该文探索了用PCR法快速制作地高辛配基标记的DNA探针的方法．证明可靠、安全、快速。对结核病防治而言，找到了一种优于结核培养的查菌方法；对其他需DNA探针的情况而言，该文探索到一种快速制作法。     

随机扩增多态DNA技术在地高辛标记HCMV DNA探针中的应用研究

应用ＲＡＰＤ－ＰＣＲ技术结合地高辛非放射性标记系统制备了人巨细胞病毒ＤＮＡ探针，并与常规随机引物法进行对照。ＲＡＰＤ－ＰＣＲ制备的ＨＣＭＶＤＮＡ探针长度呈多态性，扩增过程中不需合成特异引物，探针特异性强，产量高，用５０ｎｇＨＣＭＶＤＮＡ模板即可制备８．０μｇ探针；标记体系中ＲＡＰＤ－ＰＣＲ方法Ｄｉｇ－ｄＵＴＰ浓度为５．２％。表明ＲＡＰＤ－ΡＣＲ技术可用于少量ＤＮＡ模板制备大量ＤＮＡ探针，适用于原位杂交等需高浓度探针的核酸杂交及临床大量标本的测试，是一种经济方便的探针制备技术     

Detection of somatostatin mRNA in rat gastroentero－pancreatic system with digoxigenin－labeled cRNA probe in situ hybridizatio

ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎｍＲＮＡｉｎｒａｔｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏ－ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｓｙｓｔｅｍｗｉｔｈｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－ｌａｂｅｌｅｄｃＲＮＡｐｒｏｂｅｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＷａｎｇＲｕｉ＇ａｎ（王瑞...     

DNA疫苗佐剂

DNA疫苗出现于20世纪90年代,Wolff首先发现携带外源基因的质粒DNA通过肌内注射可以使外源基因在体内表达,这激起了科学家们对DNA疫苗最初的探索,随后Tang等进行了人类历史上首次DNA疫苗实验,由此一个新型疫苗形式诞生了[1-2]。     

Comparative study on the immunogenicity between Hsp70 DNA vaccine and Hsp65 DNA vaccine in humanMycobacterium tuberculosis

Summary The BALB/c mice were immunized with Hsp70 DNA and Hsp65 DNA vaccines in humanMycobacterium tuberculosis. Eight weeks after immunization, the eyeballs were removed, blood and spleen taken, and intraperitoneal macrophages were harvested. The lymphocytic stimulating index (SI) was used to measure the cellular proliferating ability and NO release to measure the phagocytic activity of the macrophages. With ELISA kit, the levels of interleukin-2 (IL-2) and interferon-γ (IFN-γ) in serum and the splenic lymphocytic cultured supernatant were detected. The results showed that after the mice were immunized with 100 μg/mouse of Hsp70 DNA vaccine intramuscularly, the splenic lymphocytic proliferating ability in the mice was significantly increased as compared with that in the control group, vector group and Hsp65 DNA vaccine group (P<0.01); The contents of NO in the intraperitoneal macrophages of the mice were significantly lower than in the control group and Hsp65 DNA vaccine group (P<0.01); The levels of serum IL-2 in the mice were significantly higher than in the control group, but there was no statistical difference between Hsp65 DNA group and vector group (P>0.05); The contents of serum IFN-γ in the mice were significantly higher than in the control group, but significantly lower than in the Hsp65 DNA vaccine group (P< 0.05). It was indicated that immunization with Hsp70 DNA vaccine could obviously enhance the immune response, but its intensity seemed inferior to Hsp65 DNA vaccine. The anti-infection mechanisms and clinical use in the future of the vaccines of Hsp70 DNA and Hsp65 DNA are worth further studying. This project was supported by a grant from National Natural Sciences Foundation of China (No. 39870663).     

地高辛标记反义RNA探针对大鼠不同组织生长抑素mRNA原位杂交的实验研究

应用地高辛（ＤＩＧ）标记的生长抑素（ＳＯＭ）反义ＲＮＡ探针，与Ｗｉｓｔａｒ大鼠胃、十二指肠和甲状腺组织进行原位分子杂交，以显示不同组织中ＳＯＭｍＲＮＡ对ＳＯＭ细胞进行分子水平的细胞定位和形态学观察。结果显示：杂交阳性信号呈蓝色位于胞质内，背景清晰，细胞轮廓清楚，主要分布于胃粘膜底部，十二指肠阳性细胞较少，在甲状腺滤泡旁和滤泡上皮细胞之间均可见到形态不一的杂交阳性细胞。用ＲＮａｓｅＡ预处理标本和免去探针均无杂交信号出现。表明ＤＩＧ标记的反义ＲＮＡ探针具有高度的敏感性和特异性。     

乙肝表面抗原核酸疫苗的构建及其与宿主染色体整合的可能性分析

目的：构建乙肝表面抗原DNA疫苗，并探讨其在实验动物体内整合到宿主细胞基因组上的可能性。方法：采用PCR法扩增乙肝病毒的S基因片段后装入pVAX载体，并以此为修选疫苗免疫（BALB/c）小鼠，在不同时间、不同部位取其组织抽提基因组DNA，用PCR检测DNA整合情况。结果：构建了乙肝核酸疫苗pVAX-HBsAg。免疫接种该疫苗第3周时在小鼠肌肉、肝脏、脾脏、胸腺均有不同量的游离质粒存在；第6周除在股四头肌可检测到外，其余组织中均为阴性；第12、18周时检测所有组织中均为阴性。结论：构建的pVAX-HBsAg DNA疫苗在小鼠体内无染色体整合。     

霍乱肠毒素基因DNA疫苗的构建和体外表达

目的构建霍乱弧菌ctxAB融合基因分子佐剂DNA疫苗,并在NIH3T3细胞中进行表达。方法用限制性核酸内切酶从原核表达重组质粒pET32a-ctxAB上切下ctxAB基因,导入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,重组子经限制性酶切分析、PCR鉴定正确后,命名为pcDNA3.1-ctxAB。用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-ctxAB转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western blot对pcDNA3.1-ctxAB的瞬时表达产物和稳定表达产物进行鉴定。结果真核表达重组质粒pcDNA3.1-ctxAB成功转入NIH3T3细胞,利用免疫荧光技术检测到其在细胞膜和细胞浆中获得瞬时表达,对稳定转染细胞用Western blot分析,发现在约40.5kDa处有阳性杂交信号。结论成功构建霍乱弧菌ctxAB基因分子佐剂DNA疫苗,并在NIH3T3细胞中获得表达。     

猪囊尾蚴DNA疫苗在猪组织中的分布

目的：分析猪囊尾蚴DNA疫苗pcDNA3-cC1肌肉接种后在猪体内的组织分布。方法：分别于疫苗接种后1d、7d、4周、8周，提取猪骨髓、肾、肝、脑、性腺、肠系膜淋巴结、脾、胸`腺外周血及肌注部位的肌肉和皮肤的总DNA，通过PCR的方法检测疫苗质粒在各组织中的分布及随时间变化的情况。结果：疫苗接种后的第1天几乎所有组织中都检测到质粒；但随着时间的延续；仅在注射部位的肌肉和皮肤中检测到质粒的存在，并保持到8周以上。结论：肌注疫苗质粒后，实验猪组织中的游离质粒在短时期内就被清除。     

Influenza DNA vaccine: an update

A series of global studies on the influenza DNA vaccine have revealed that it is capable of eliciting persistent humoral and cell mediated immune responses to influenza following delivery by various routes. DNA vaccines may not only serve as potentially safer alternatives to immunization with certain live virus vaccines, but may     

猪囊尾蚴抗原cC1 DNA疫苗和蛋白质疫苗联合诱导小鼠免疫应答

目的:观察cC1 DNA疫苗和蛋白质疫苗联合免疫对诱导BALB/c小鼠免疫应答的影响.方法:雌性BALB/c小鼠随机分为4组:A组(DNA疫苗组), 质粒DNA以10 d间隔免疫3次;B组(联合免疫组),质粒DNA以10 d间隔免疫 2次后以GST-cC1融合蛋白加强免疫1次;C组(蛋白质疫苗组),分别在第0、3 周免疫接种融合蛋白;D组(pcDNA3对照组),以10 d间隔,3次免疫接种质粒pcDNA3.ELISA法检测血清样品中的特异性抗体水平以及实验小鼠脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-4水平,以MTT法行脾脏淋巴细胞增殖实验.结果:C组可诱导相对较强的小鼠免疫应答,其特异性IgG和IgG1以及脾脏淋巴细胞分泌IL-4水平均高于其他各组(P<0.05),免疫的类型以Th2应答为主.B组诱导的特异性抗体水平和淋巴细胞分泌细胞因子水平均明显高于A组(P<0.05),B组和A组诱导的免疫应答类型均以Th1应答为主.结论:以 DNA priming-protein boost的策略可有效诱导较DNA疫苗单独使用更高的特异性抗体应答,且以Th1型免疫应答为主.     

高密度培养大肠杆菌生产重组钩端螺旋体DNA疫苗

目的：高密度、高质粒拷贝数培养大肠杆菌生产重组DNA疫苗pcD-flaB。方法：应用FUS－5L自控发酵罐，采用补料分批培养技术，补料的补加使溶氧控制在30％－605，pH控制在7左右，培养中后期采用42℃培养以提高质粒拷贝数。结果；重组菌E.coli DH5α/pcDNA3-flaB发酵液光密度（D600）达到45。经纯化后最终质粒DNA得率为50mg/L。质粒没有发生丢失现象。结论：本实验为钩端螺旋体DNA疫苗的大规模生产奠定了基础。