骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的体外诱导实验

目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)经5-氮杂胞苷诱导在体外分化为心肌样细胞的情况,为心衰的干细胞移植治疗提供实验依据。方法:分离培养大鼠MSCs,用不同浓度5-氮杂胞苷诱导不同时间,用形态学、PAS反应、免疫细胞化学等鉴定。结果:诱导细胞以梭形、柱状为主,部分细胞有分支,单核,核卵圆形、居中,类似心肌细胞形态;PAS反应阳性;诱导培养2周,Sarcomeric actin和Connexin-43表达较弱,以后逐渐增强。以10-5mol/L5-氮杂胞苷诱导24h效果最佳。结论:MSCs在5-氮杂胞苷诱导下可定向分化为心肌样细胞,可望成为自体心肌细胞的一种良好供体来源。     

骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的研究

目的目的研究大鼠骨髓间充质干细胞经5-氮杂胞苷诱导在体外转化为心肌样细胞的情况,为心衰的干细胞移植治疗提供基础。方法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,用不同浓度5-氮杂胞苷诱导不同时间,通过形态学、PAS反应、免疫细胞化学等鉴定。结果诱导细胞以梭形、柱状为主,部分细胞有分支,核一个、卵圆形、居中,类似心肌细胞形态;PAS反应阳性;诱导后培养2周,Sarcomeric Actin和Connexin-43表达较弱,以后逐渐增强。以10×10-6mol/L5-氮杂胞苷诱导24h效果最佳。结论骨髓间充质干细胞在5-氮杂胞苷诱导下可定向分化为心肌样细胞,是自体心肌细胞的一种良好供体来源。     

体外不同诱导条件对大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的影响

目的 研究不同方法诱导骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为心肌细胞（CM）的能力及表达心肌细胞特异性标记物的差别。方法 分离培养MSCs及CM,第三代MSCs经DAPI标记后分别进行5－aza诱导,与CM共培养和单独培养。1、2、3和4周观察细胞形态变化及免疫细胞化学鉴定cTnT和Cx43。结果 单独培养未见有细胞收缩,cTnT和Cx43表达阴性;诱导组和共培养组,培养至4周时细胞排列方向一致,成肌性排列,诱导1周时cTnT和Cx43表达阴性,而共培养组第5天cTnT和Cx43即开始表达,随着时间延长,两组cTnT和Cx43表达逐渐增加;相同周数内,共培养组的表达阳性率均高于诱导组（P＜0.01)。结论 MSCs经5－aza诱导和与CM共培养,可转化为心肌样细胞并表达cTnT和Cx43,且共培养MSCs分化为心肌细胞的能力比5－aza诱导强。     

骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的实验研究

目的通过体外诱导研究大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化,为心衰的干细胞移植治疗提供实验依据。方法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,采用5-氮杂胞苷定向诱导,通过形态学、免疫细胞化学及磷钨酸苏木素染色(PTAH)鉴定。结果诱导后细胞以梭形、柱状为主;部分细胞有分支,核一个、卵圆形、居中,类似心肌细胞形态;诱导24h后培养2周,Sarcomeric Actin和Connexin-43表达较弱,以后表达逐渐增强;诱导细胞PTAH阳性。结论骨髓间充质干细胞能在体外被诱导分化为心肌样细胞,有望成为心衰时干细胞移植治疗的理想细胞材料。     

人骨髓间充质干细胞体外诱导分化成心肌细胞及其在心肌细胞移植术中的潜能性研究

目的培养人骨髓间充质干细胞（human marrow mesenchymal stem cell，hMMSCs），体外诱导分化成心肌细胞（cardiomyocytes，CM），将细胞移植入裸鼠皮下，观察其在细胞移植中有无成瘤改变，是否具有细胞移植的潜能性。方法体外培养扩增hMMSCs，流式细胞仪鉴定其纯度；用5-氮杂胞苷（5-Aza，10μmol／L）体外诱导成CM，并进行鉴定；将诱导成CM的hMMSCs接种于裸鼠皮下，移植后18d分别取接种局部皮下及心肌组织，进行组织化学染色。结果体外培养扩增出hMMSCs，流式细胞检查CD44阳性，表达Vimentin；hMMSCs经5-Aza诱导可分化成CM，表达心肌特异性标记TroponinⅠ及Desmin，透镜观察可见肌丝样结构；进行细胞移植的裸鼠注射局部皮下组织没有形成结节样结构，但发现有表达TroponinⅠ、Desmin及Vimentin的细胞；此外，在心肌组织中也发现有表达这三种抗体的hMMSCs。结论hMMSCs可体外分离培养扩增，具有向CM分化的潜能，体外诱导分化成CM的hMMSCs在细胞移植中并没有成瘤性，且经皮下细胞移植诱导分化成CM的hMMSCs具有向心脏归巢的现象，可用于心肌损伤的细胞移植。     

人骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

目的讨论小型猪心肌细胞(CMs)裂解液对人骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外诱导分化作用。方法用5-aza、小型猪CMs裂解液二种方法体外诱导人MSCs的分化,单纯培养基(DMEM)培养为对照组,观察细胞形态改变。用细胞免疫化学、免疫荧光法检测MSCs的α-actin、cTnT、Cx43和CD31的表达,MTT法测定细胞增殖。结果小型猪CMs裂解液诱导人MSCs所得心肌样细胞(CLCs)表达cTnT、Cx43和CD31;5-aza诱导组MSCs表达cTnT和Cx43,不表达CD31;5-aza培养初期对MSCs的增殖具有明显的抑制作用,CMs裂解液促进MSCs的增殖。结论小型猪CMs裂解液培养基可以诱导人MSCs分化为心肌样细胞及内皮样细胞,并且具有很强的促细胞增殖作用,优于目前广泛研究的肌细胞诱导分化剂5-aza。本研究为大规模诱导人MSCs向CMs分化创造了条件。     

体外心肌细胞共培养诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

目的 探讨体外心肌细胞间接接触共培养诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)向心肌样细胞分化的效果,以寻找最佳的诱导条件。 方法 2~3周龄SD大鼠24只和新生1~3d SD大鼠96只。分别通过全骨髓贴壁筛选法和差速贴壁法获取BMSCs和心肌细胞（CMs）。根据诱导条件不同分成3组：A组：5-氮杂胞苷（5-Aza-CR）诱导组,取采用10μmol/L 5-Aza-CR避光诱导24h;B组：共培养CMs诱导组,实验开始时,CMs和BMSCs分开培养,待各自贴壁后进行共培养;C组：5-Aza-CR+共培养CMs诱导组,CMs接种于Transwell小室上层,下层接种5-Aza-CR诱导的BMSCs。在相差显微镜下连续观察各组BMSCs的形态变化,诱导至第2、4周时收集细胞。应用免疫组织化学法和免疫荧光方法检测诱导后的BMSCs α-横纹肌肌动蛋白（α-actin）和心肌肌钙蛋白T（cTnT）的表达情况。 结果 1.细胞形态的变化： B组细胞有聚集生长趋势,C组脱落或降解的细胞明显少于A组,但部分细胞内有脂肪空泡形成。2.免疫组织化学和免疫荧光检测结果均显示,诱导2周时,A、B、C组cTnT均呈阴性或低表达,α-actin均呈弱表达;诱导4周时各组cTnT和α-actin均呈阳性表达。A组cTnT阳性表达率和α-actin阳性表达率分别为（20.22±2.30）%和（28.05±2.45）%、B组为（21.18±1.30）%和（29.06±1.86）%、C组为（26.28±2.89）%和（33.91±2.18）%,且C组与A、B组比较差异均有统计学意义（P<0.05）,但A组与B组组间差异无统计学意义（P＞0.05）。 结论 体外心肌细胞间接接触共培养可以诱导BMSCs向心肌样细胞分化,和5-Aza-CR共同诱导可提高诱导率。     

定向诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化

目的:采用骨髓间充质干细胞体外转化为心肌样细胞,为心衰的干细胞移植治疗提供基础。方法:分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,5-氮杂胞苷诱导24h后正常培养,通过形态学、PAS反应、磷钨酸苏木素染色(PTAH)、免疫细胞化学染色作鉴定。结果:诱导细胞以梭形、柱状为主,部分细胞有分支,单个核、卵圆形、居中,似心肌细胞,PAS及PTAH染色均为阳性。诱导后培养2周的细胞表达Sarcomeric Actin和Connexin-43较弱,以后表达逐渐增强,而且1、3、5代细胞均稳定表达。结论:骨髓MSCs可在体外被诱导分化为心肌样细胞,有望成为心衰干细胞移植治疗的理想细胞材料。     

体外诱导兔骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的研究

目的 :探讨体外培养骨髓间充质干细胞的方法以及定向诱导分化成心肌样细胞的条件。方法 :常规骨髓穿刺获取细胞悬液 ,应用Percoll液密度梯度离心以及贴壁培养技术分离间充质干细胞。使用不同浓度的 5 -氮胞苷定向诱导分化 ,应用透射电镜观察细胞超微结构和免疫细胞化学技术检测细胞特异性心肌收缩蛋白、舒张蛋白以及连接蛋白的表达。结果 :在 5 aza诱导后第 2 0天 ,约 3 0 %的细胞表达肌钙蛋白T、α 横纹肌肌动蛋白、肌浆网磷酸受钙蛋白和连接蛋白 43。透射电镜观察 ,胞浆内粗面内质网丰富 ,部分内质网正在合成肌丝。结论 :骨髓间充质干细胞具有分化为心肌样细胞的潜能。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞

目的 采用骨髓间充质干细胞(MSCs)体外诱导为心肌样细胞,为干细胞移植治疗心衰提供一种新的细胞材料.方法 取SD大鼠四肢骨骨髓,分离培养MSCs,分别用终浓度为5、10、15、20 μmol/L的5-氮胞苷(5-aza)定向诱导,相差显微镜观察细胞形态学变化,应用免疫细胞化学、激光扫描共焦显微镜技术检测结蛋白(desmin),α-横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin)、心肌特异性肌钙蛋白(C-TnT)的表达,透射电镜鉴定.在诱导后7d、21 d和28 d,3个时间点以半定量RT-PCR方法检测细胞心肌早期转录因子GATA4和心肌特异性肌凝蛋白重链αMHC的表达.结果 MSCs体外经5-aza诱导后分化的细胞desmin、α-sarcomericactin、C-TnT均表达阳性,5 μmol/L组阳性表达较高,透射电镜下可见到平行排列的肌丝.RT-PCR结果显示,GATA4于诱导后7 d弱表达,21 d表达增强,28 d表达减弱.αMHC在诱导后7 d不表达,21 d弱表达,28 d表达明显.结论 骨髓间充质干细胞能够在体外被诱导分化为心肌样细胞,是自体心肌细胞一种良好的供体来源.     

体外冲击波通过三磷酸腺苷诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

目的 研究体外冲击波是否通过三磷酸腺苷（ATP）激活P2X7受体,诱导人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)向成骨细胞分化。方法 培养hMSCs细胞,检测冲击波是否引起其向外释放ATP;通过检测碱性磷酸酶(ALP)活性、骨钙素表达和钙结节形成,判断骨化形成和钙质沉积;用实时定量PCR检测P2X7受体的mRNA表达;用ATP水解酶、P2X7受体的siRNA以及 P2受体的抑制剂评估ATP释放和P2X7受体在冲击波诱导hMSCs成骨分化中的作用。结果 冲击波可引起细胞内ATP向外释放,冲击波和细胞外ATP能够诱导hMSCs向成骨分化,采用ATP水解酶、P2X7受体的siRNA和抑制剂能够抑制冲击波引起的hMSCs成骨化作用。结论 冲击波通过引起细胞内ATP向外释放,激活P2X7受体传导信号通路,促进hMSCs向成骨细胞分化。本研究结果为冲击波促进骨折愈合和治疗骨不连疗法提供了理论依据。     

骨髓间质干细胞体外转分化为肌细胞的实验研究

研究骨髓间充质干细胞在体外诱导分化为肌源性细胞的可行性。由新西兰大白兔胸骨获取骨髓间充质干细胞，纯化培养后用不同浓度的5氮杂胞苷(5-azacytidine)诱导，用透射电镜、免疫组化、动作电位、cTnI(肌钙蛋白)检测、Ach(乙酰胆碱)刺激后的反应等鉴定诱导后细胞。结果显示经5-氮杂胞苷诱导后的骨髓间充质干细胞在透射电镜下可以观察到细胞内有明显的肌丝，免疫组化可见细胞被抗肌红蛋白抗体着染显色，电生理检查表明诱导后细胞是可兴奋细胞，可检测到cTnI，Ach刺激后细胞表现为舒张反应。我们认为骨髓间充质干细胞可在体外经5-氮杂胞苷诱导后转分化为肌源性细胞。     

灌注型生物反应器中流速对人骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响

目的探讨在灌注型生物反应器中,大段磷酸三钙(β-TCP)载体内不同流速对人骨髓间充质干细胞(humanmesenchymal stem cells,hMSCs)增殖及成骨分化的影响。方法利用灌注型生物反应器对复合了hMSCs的大段β-TCP载体分别以3、6、9 mL/min的流速培养15 d,通过葡萄糖消耗量、细胞活力(MTT比色法)以及扫描电镜(SEM)观测细胞在载体内的增殖情况;以Real-time PCR检测成骨分化相关基因的表达。结果各组葡萄糖的日消耗量随培养时间的延长而增加,初期9 mL/min组细胞增殖明显快于3、6 mL/min组(P<0.001),但是灌注培养后期6 mL/min组的细胞增殖快于9、3 mL/min组(P<0.05)。灌注培养15 d后,6 mL/min组细胞活力显著高于3、9 mL/min组(P<0.001)。SEM观察发现3组β-TCP载体内均形成复合细胞层,3 mL/min组细胞层呈疏松的簇状,6 mL/min组复合细胞层部分呈膜片状,9 mL/min组复合细胞层多数呈膜片状。在进行成骨诱导灌注培养15 d后,6、9 mL/min组碱性磷酸酶(ALP)及骨桥蛋白(OP)的表达均显著高于3 mL/min组(P<0.01);3、6 mL/min组骨钙素(OC)的表达基本相同(P>0.05),而9 mL/min组OC的表达量则显著高于另外两组(P<0.001)。结论在利用灌注型生物反应器对hMSCs进行灌注培养的早期,9 mL/min的流速最有利于hMSCs的增殖,而晚期6 mL/min的流速最有利于hMSCs的增殖。β-TCP载体内流体剪切应力(flow shear stress,FSS)随灌注流速的增加而增加,适当的FSS可促进细胞外基质的合成和分布,并增加成骨相关基因的表达。     

细胞接触诱导骨髓间充质干细胞获得心肌分化表型的研究

目的观察不同浓度条件下，细胞接触对骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化为心肌细胞（CM）的诱导作用。方法利用表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因大鼠的BMSCs与CM以不同比例（1：1、1：10、1：20、1：40）共培养1周，分别采用免疫荧光染色及流式细胞计数分析检测肌钙蛋白I（cTnI）、α—sarcomeric actinin和MEF-2C等心肌特异性蛋白，采用膜片钳技术检测分化细胞的电生理功能。结果在共培养条件下，部分GFP—BMSCs可表达一系列心肌表面标记物，如心肌特异性cTnI蛋白等，且获得心肌分化表型的数量随着CM数量的增加而增加。部分GFP—BMSCs与CM一起同步搏动，并可获得与CM相似的膜电位。结论细胞接触可诱导BMSCs获得有功能的心肌分化表型，其数量与心肌的数量不同浓度有相对的依赖性，随着心肌数量的增加而增加。     

人骨髓间质干细胞向造血细胞分化潜能的实验研究

目的:在体研究人骨髓间质干细胞(hBMMSCs)向造血细胞分化的潜能。方法:将hBMMSCs经尾静脉注射给环磷酰胺处理的严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠,利用流式激活细胞分析系统(FACS)检测hBMMSCs输注后存活35d的SCID小鼠外周血、骨髓和脾脏中人源性造血细胞的表型和水平。结果:hBMMSCs输注组外周血(PB)、骨髓(BM)和脾脏(spleen)中可检测到人CD45⁺/H-2D^d-、CD34⁺/H-2D^d-细胞,而对照组PB、BM和脾脏均未检测到上述表型的人造血细胞。结论:hBMMSCs具有向造血细胞分化的潜能。     

骨髓间质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞的实验研究

目的：体外培养并诱导大鼠骨髓间质干细胞（MSCs）分化为心肌细胞。 方法： 采用密度梯度离心法和贴壁培养法分离、纯化大鼠骨髓MSCs，在第3代细胞以5-氮杂胞苷进行诱导，用免疫细胞化学和RT-PCR方法对诱导细胞进行鉴定。 结果： 诱导后细胞体积较诱导前增大，而且更加细长，呈长梭形。14 d后细胞之间出现连接，排列方向渐趋一致。免疫细胞化学染色显示诱导后部分细胞结蛋白(desmin)、横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin)和心肌特异性肌钙蛋白(troponin I)呈阳性反应。RT-PCR结果表明诱导细胞有心肌β肌球蛋白重链表达。 结论： 5-氮杂胞苷能在体外诱导MSCs向心肌细胞分化。     

骨髓间充质干细胞与纳米羟基磷灰石支架材料的体外相容性研究

目的　探讨兔骨髓间充质干细胞(rBMSCs)与纳米羟基磷灰石(nano-HA)支架材料的相容性,进一步验证nano-HA材料作为骨组织工程支架材料的可行性。 方法　将rBMSCs与nano-HA支架材料在体外复合培养,通过倒置显微镜、扫描电镜观察细胞与材料的复合情况,用MTT法、碱性磷酸酶活性检测法检测材料对细胞增殖、分化的影响。 结果　rBMSCs可以在nano-HA支架材料表面及孔隙中良好的黏附、迁移、增殖和分化,复合培养5 d后nano-HA支架材料对rBMSCs的增殖分化表现出一定的促进作用。 结论　rBMSCs与nano-HA支架材料具有良好的生物相容性, nano-HA支架材料可以作为rBMSCs良好的载体。