大鼠脂肪源性干细胞分离培养的实验研究

目的研究分离、培养、鉴定大鼠脂肪源性干细胞的实验方法。方法提取大鼠双侧腹股沟处脂肪组织,进行原代培养及流式细胞检测仪的鉴定。用MTT法检测不同原代细胞接种密度的细胞分裂增殖率的变化,并观察第1^第13代细胞分裂增殖的特点。结果大鼠脂肪源性干细胞的生长呈大量细胞集落,表面标记物CD44、CD105、CD49d表达阳性,CD106表达阴性。不同的原代细胞接种密度会影响细胞分裂增殖,以1×106/ml细胞密度接种时细胞的增殖速率高于其它对照组。该细胞株经多次传代后仍能保持较强的分裂增殖能力。结论大鼠脂肪源性干细胞分离培养方法简便,不同的原代细胞接种密度会影响细胞分裂增殖,细胞经多次传代后仍能保持较强的分裂增殖能力。     

兔BBMSCs体外培养及其与水凝胶复合体的制备

目的探讨贴壁筛选法分离培养兔骨髓基质干细胞(BMSCs)的条件,制备了可注射的PLGA-PEG水凝胶并检测其生物相溶性,为组织工程选择合适的基质干细胞奠定基础。方法采用贴壁筛选法将兔BMSCs自少量骨髓中分离、纯化并培养,观察其增殖和生长特性,绘制生长曲线。制备凝胶,倒置显微镜下观察细胞的生长形态,并MTT法检测其生物相溶性。结果兔BMSCs性状稳定,生长曲线相似,一周时细胞数目最多;传代后3~4h即可贴壁。水凝胶30℃的成胶时间为10min,培养7d后水凝胶表面的BMSCs贴壁生长并显示出良好的细胞活性。结论水凝胶具有良好的细胞相容性,可作为BMSCs生长增殖的良好载体,为组织工程提供支架材料。     

大鼠内皮祖细胞的培养及鉴定

目的 探索大鼠内皮祖细胞的分离培养,为缺血性疾病细胞移植治疗提供实验方法.方法 采集大鼠骨髓,梯度密度离心法分离单核细胞,内皮细胞培养液M199培养基培养(含20%FCS+15 ng/ml VEGF),种植于提前包埋了纤维连接蛋白的六孔板培养,应用免疫荧光和流式细胞技术鉴定内皮细胞系列标志:CD34、CD31、Flk-1和祖细胞标志CD133.并通过检测其对FITC标记的UED-1的吸附和内吞DiI-acLDL来进行细胞功能学的鉴定.结果 经过梯度密度离心和贴壁法选择的细胞表达内皮细胞特异性抗原CD34、CD31、Flk-1,部分表达CD133.大鼠骨髓单个核细胞经体外诱导分化,培养第5～14天的贴壁细胞不同程度的表达CD34、CD133、Flk-1和CD31.培养第9天流式细胞仪检测其阳性率分别为(40.12±6.28)%、(15.62±4.31)%、(44.05±8.20)%和(76.1±7.20)%,细胞能特异性吸附FITC标记的荆豆凝集素并内吞DiI-acLDL,并且在Matrigel上可以形成毛细血管样.结论 大鼠骨髓可以分离培养内皮祖细胞并能体外扩增,为内皮祖细胞的移植研究奠定了基础.     

SD大鼠骨髓基质细胞的分离培养和鉴定

目的观察SD大鼠骨髓基质细胞的体外分离培养情况并加以鉴定。方法采用密度梯度离心(Percoll法)和贴壁培养结合的方法分离培养SD大鼠BMSCs;采用倒置相差显微镜观察BMSCs形态学特征;流式细胞仪检测细胞表面标志抗原CD45和CD90表达阳性率。结果第3代以后的细胞形态较一致,呈大而扁的梭形为主,第3～5代细胞增殖力保持旺盛;第3代细胞表面标志抗原CD45和CD90表达阳性率分别为:0.2%和94.7%。结论密度梯度离心结合贴壁培养的方法可获得较高纯度的BMSCs,对其进行研究和应用应选用第3～5代的BMSCs。     

辛硫磷对大鼠骨髓间充质干细胞DNA损伤、细胞凋亡及P53蛋白表达的影响

目的研究辛硫磷对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)DNA的损伤作用及其对氧化损伤、细胞凋亡和P53蛋白表达的影响。方法 Percoll离心法分离培养大鼠BMSCs,正常传代。取第3代BMSCs,调整细胞密度为1.0×106/瓶,当细胞至亚融合状态,分别以0(对照)、0.2、2和20μg/L的辛硫磷浓度染毒24h。采用MTT法检测BMSCs的存活率,分光光度比色法检测BMSCs超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量,单细胞凝胶电泳检测BMSCs的DNA损伤,流式细胞术检测大鼠骨髓间充质干细胞凋亡率,Western blotting检测BMSCs的P53蛋白表达水平。结果与对照组相比,0.2～20μg/L辛硫磷染毒24h,可诱发大鼠BMSCs的DNA损伤,且具有剂量-效应关系;各染毒组大鼠BMSCs的存活率、SOD和CAT活性均显著下降(P<0.05),细胞凋亡率和MDA含量均显著升高(P<0.05);辛硫磷染毒可以诱导大鼠BMSCs P53蛋白表达水平的增加(P<0.05)。结论辛硫磷可诱导大鼠BMSCs氧化损伤、DNA损伤、细胞凋亡和P53蛋白表达,且具有剂量-效应关系。     

不同时期骨髓间充质干细胞移植对矽肺大鼠CD4~+CD25~+调节性T细胞的影响

目的探讨在不同时间窗进行骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)移植对矽肺大鼠外周血CD4~+CD25~+调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)水平的影响。方法将42只SD雌性大鼠随机分为4组:对照组、矽肺模型组、早期治疗组(n=12)和晚期治疗组(n=6)。采用暴露式气管内一次性缓慢注入SiO_2混悬液建立矽肺大鼠模型,早期治疗组和晚期治疗组并分别于造模后第6 h和第42天经尾静脉注射BMSCs。造模后第14天对照组、矽肺模型组,早期治疗组分别处死大鼠各6只,造模后第56天各组分别处死6只。HE染色观察肺组织形态学变化,流式细胞仪检测外周血Tregs/CD4+比率。结果矽肺模型组在造模后第14天,肺组织病理改变以急性炎症反应为主,在造模后第56天以纤维化为主;早期治疗组和和晚期治疗组病理改变均较同时期矽肺模型组轻。外周血Tregs/CD4+比率,矽肺模型组大鼠明显下降(P0.01),早期治疗组和晚期治疗组在BMSCs治疗后第14天均有明显升高(P0.01),但早期治疗组到治疗后第56天升高效果已不明显(P0.05)。结论 BMSCs移植可能通过上调Tregs水平,延缓矽肺的纤维化进程。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定

[目的]建立分离纯化、培养、扩增骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSCs)鉴定的方法.[方法]采用密度梯度离心及贴壁培养相结合的方法分离、培养、扩增MSCs,并用流式细胞仪检测其表面标志CD34、CD44、CD105. [结果]培养48 h后即可见呈集落生长的细胞,72 h后可见少量贴壁MSCs细胞,7 d后贴壁细胞明显增多,梭形栅栏样分布,融合度达70%以上.第3代原代培养细胞表面标志CD44+、CD105+在95%左右,CD34的表达率甚低.[结论]联合应用密度梯度离心法及贴壁筛选法,可以获得纯度较高的骨髓MSCs     

AAV介导NGF过表达载体转染BMSCs对高强度聚焦超声致活体SD大鼠坐骨神经损伤模型保护作用

目的干细胞是当前研究的热门领域,利用干细胞定向分化作用可以促进神经损伤修复,但是干细胞具有分化方向不定和易老化的特点。本研究探究腺相关病毒(adeno associated virus,AAV)介导神经生长因子(nerve growth factor,NGF)过表达载体转染骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)对高强度聚焦超声致活体SD大鼠坐骨神经损伤模型的保护作用。方法分离和培养人源BMSCs,采用流式细胞仪检测BMSCs的CD29,CD45和CD90等表面蛋白表达。采用免疫组织化学染色鉴定BMSCs表面CD34和CD44表达。AAV腺病毒构建NGF过表达质粒,通过高强度聚焦超声制备SD大鼠坐骨神经损伤模型,根据处理方式不同,将SD大鼠分成空白对照组,模型组,BMSCs组和NGF过表达组。利用HE染色,电镜方法观察坐骨神经形态,示踪金染色观察神经接头的聚集,TUNEL染色检测细胞凋亡,RT-qPCR检测NGF和caspase-3mRNA表达。结果流式细胞仪检测第2代BMSCs表面蛋白,CD29阳性率为98.03%,CD90阳性率为96.92%,CD45阴性率为77.2%,共表达CD29、CD90且CD45表达阴性的细胞数占总细胞数的96.89%。BMSCs细胞表面CD34和CD44免疫组织化学染色呈阳性。慢病毒转染效率>90%,转染效率较高。HE染色结果中模型组大鼠坐骨神经有明显断裂,BMSCs组大鼠坐骨神经较模型组裂痕缩小,而NGF过表达组断裂处几乎不可见。电镜结果显示,模型组大鼠坐骨神经密度少,且形态不规则,BMSCs组大鼠坐骨神经较模型组密度大,且周边为纤维组织填充,NGF过表达组大鼠坐骨神经密度大,排列较为规则。示踪金染色显示NGF过表达组神经接头处可见神经聚集。RT-qPCR结果显示空白对照组、模型组、BMSCs组和NGF过表达组NGF mRNA相对表达量分别为1.18±0.05、0.77±0.06、1.75±0.07和3.09±0.08,F=9.082,P=0.019;空白对照组、模型组、BMSCs组和NGF过表达组caspase-3mRNA表达量分别为2.03±0.09、5.05±0.23、3.12±0.09和1.23±0.22,F=9.177,P=0.011。空白对照组、模型组、BMSCs组和NGF过表达组细胞凋亡率分别为(9.34±0.32)%、(31.24±3.43)%、(22.09±2.66)%和(4.97±1.05)%,F=9.664,P=0.014。结论腺病毒介导NGF过表达质粒转染BMSCs可以促进坐骨神经损伤大鼠坐骨神经修复,其机制可能是通过升高NGF mRNA,降低caspase-3mRNA水平实现。     

C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养、分化及两种不同品牌血清对其增殖的影响

目的 研究C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)体外分离培养、分化及比较含两种不同品牌血清培养基对其生长的影响,探索体外培养C57BL/6小鼠BMSCs更优方法。方法 差速贴壁法体外分离提取BMSCs,分别用含10%Yeasen胎牛血清和10%Gbico胎牛血清的DMEM/F12培养基进行培养,分别在2 d、4 d、6 d(后)通过倒置显微镜观察两组BMSCs的细胞形态;CCK-8法检测其生长趋势;免疫荧光染色鉴定表型;不同诱导培养基诱导其成骨、成脂分化。结果 成功分离BMSCs,原代培养细胞呈长角形涡状排列生长,第二代BMSCs免疫表型鉴定结果显示CD44、CD90、CD106为阳性表达,CD34为阴性表达;成骨、成脂诱导分化后,细胞茜素红、油红染色均呈阳性;CCK-8检测显示含Gbico血清培养基所培养的BMSCs更容易形成细胞集落且数量更多,生长上升趋势更为明显。结论 两种血清都能促进BMSCs的体外增殖,Yeasen血清有着更高的性价比,Gbico血清则在促进增殖方面表现更加良好。     

人骨髓间充质干细胞体外培养及生物学特性的研究

目的 建立体外分离培养人骨髓间充质干细胞(Human Bone-marrow Mesenchymal Stem Cells,hBMSCs)方法,并就hBMSCs表型鉴定、细胞周期、生长曲线等生物学特性进行初步研究. 方法采用密度梯度离心法分离培养hBMSCs,流式细胞仪检测hBMSCs表型鉴定、细胞周期、绘制hBMSCs生长曲线. 结果密度梯度离心法能分离出纯度较高的hBMSCs;流式细胞仪检测hBMSCs CD105、CD13阳性,CD34、CD45、HLA-DR表达阴性;hBMSCs的生长曲线呈S型;hBMSCs细胞生长周期提示大部分细胞处于相对不活跃的静止期. 结论采用密度梯度离心法体外分离培养骨髓可获得纯度较高的hBMSCs,hBMSCs具有独特的生物学特征.     

骨髓间充质干细胞的三维培养

目的：研究三维培养环境下骨髓间充质干细胞的生长情况,探讨骨髓间充质干细胞复合支架构建组织工程软骨的可行性。方法：全骨髓培养法分离骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）,免疫细胞化学测定其细胞表面抗原CD44、CD45,对BMSCs进行鉴定;冻干法制备壳聚糖（Chitosan,CS）支架,扫描电镜观测支架孔径;取BMSCs复合CS支架,通过三维培养观察BMSCs在CS支架上不同时段的生长情况。结果：三维培养环境下骨髓间充质干细胞生长良好,细胞在支架上分泌大量细胞外基质,并与支架黏附良好。结论：骨髓间充质干细胞可作为组织工程的种子细胞,构建组织工程软骨。     

骨髓间充质干细胞移植在肺气肿大鼠模型肺组织内定植研究

目的：观察骨髓间充质干细胞移植在肺气肿大鼠模型肺组织内的定植情况。方法：选择健康SD大鼠34只,按随机数字表法分为MSCs干预组（A组,10只,慢阻肺大鼠,尾静脉输注MSC 1×106个/mL）,肺气肿模型组（B组,10只,慢阻肺大鼠,尾静脉输注等体积PBS）及MSC对照组（C组,10只,正常大鼠,尾静脉输注MSCs 1×106个/mL）,正常对照组（D组,4只,正常大鼠,尾静脉输注等体积PBS）,采用烟熏法复制大鼠肺气肿模型。全骨髓培养法体外培养扩增雄性SD大鼠来源的MSCs,经GFP标记细胞后将其经尾静脉注入肺气肿模型SD大鼠体内,24 h内处死大鼠,取肺组织迅速冰冻切片,共聚焦激光显微镜下观察观察转染GPF的间充质干细胞在大鼠肺内定植情况。结果：成功培养具有分化潜能的骨髓间充质干细胞,MSCs传至第4代时有99.5%表达CD44、99.6%表达CD29等间充质干细胞表面标志,仅有0.4%表达CD34、1.0%表达CD45单核细胞以及造血干细胞表型;成功复制大鼠肺气肿模型,香烟烟雾暴露组（A、B组）平均肺泡间隔为（119.0±26.2）μm,高于对照组（C、D组）的（89.8±17.3）μm,差异有统计学意义（P〈0.05）;平均肺泡数为（173.9±68.3）个/mm2低于对照组的（280.3±104.0）个/mm2,差异有统计学意义（P〈0.05）;显微共聚焦发现MSCs经尾静脉注入大鼠体内24 h后可见A组大鼠肺组织内转染绿色荧光蛋白质粒的MSCs,而B组、C组及D组均未见转染荧光。结论：骨髓间充质干细胞经尾静脉输注入后可在肺气肿模型大鼠肺内定植,为MSCs治疗慢阻肺可能提供理论依据。     

诱导分化骨髓干细胞（MSCs）构建膀胱的实验研究

目的分离提起大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,体外培养扩增SD大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,通过组织工程技术．构建组织构建膀胱,为进一步临床应用奠定基础。方法将sD大鼠骨髓间充质干细胞进行体外培养扩增后,以生长状态良好的骨髓问充质干细胞接种于制备好的聚乳酸一聚乙醇酸支架上,进行体外联合培养,构建组织工程皮肤。观察细胞生长情况及组织工程构建膀胱。结果体外培养的SD大鼠骨髓间充质干细胞生长良好,传代扩增容易,骨髓间充质干细胞在聚乳酸一聚乙醇酸基质中生长良好,可体外构建组织工程膀胱。结论通过利用体外扩增培养的骨髓问充质干细胞制备的上皮细胞可以体外聚乳酸一聚乙醇酸支架构建组织工程膀胱。     

骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤的实验研究现状

本文通过介绍骨髓间充质干细胞的基本特性和其在脊髓损伤中的动物实验,综述了骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤实验研究的新进展。研究表明,骨髓间充质干细胞在脊髓损伤过程中分泌了营养因子、保护了受损的神经细胞、促进了轴突的生长、恢复了运动感觉功能,但也存在一些问题。     

新型磷酸钙骨水泥与骨髓间充质干细胞的共培养研究

目的 探讨新型可注射磷酸钙骨水泥与骨髓间充质干细胞共培养的可行性,为组织工程化骨的构建提供科学依据。方法采用浸提法制备CPC浸提液,加入到人骨髓间充质干细胞的培养体系中。MTT法测定细胞相对增殖率,进行细胞毒性反应分级：流式细胞仪检测CPC浸提液培养的hBMSCs的细胞周期。将新型磷酸钙骨水泥在不同凝结时间分别加入到BMSC浓度为1×10^7／L的6孔培养板中,逐日观察材料边缘细胞贴壁生长情况,培养一周后扫描电镜观察;取第三代BMSC,将密度调至1×10^7／L加入到12孔培养板,注入糊状磷酸钙骨水泥（成团期）,分别于培养1天、3天、5天、1周终止培养进行扫描电镜观察。结果新型磷酸钙骨水泥的细胞毒性反应为0～Ⅰ级,基本无毒性。光镜下见细胞在大部分组的CPC材料边缘生长良好,未见细胞变形、坏死;扫描电镜观察见大量细胞紧贴材料生长,细胞生长良好,细胞呈不规则的多角形、近圆形,在骨水泥表面与其他细胞相连融合成片。结论新型可注射性磷酸钙骨水泥具有良好的生物相容性．骨髓间充质干细胞能够在常规培养体系中与新型可注射可降解磷酸钙骨水泥共培养。     

新型磷酸钙骨水泥与骨髓间充质干细胞的共培养研究

目的探讨新型可注射磷酸钙骨水泥与骨髓间充质干细胞共培养的可行性,为组织工程化骨的构建提供科学依据。方法采用浸提法制备CPC浸提液,加入到人骨髓间充质干细胞的培养体系中,MTT法测定细胞相对增殖率,进行细胞毒性反应分级;流式细胞仪检测CPC浸提液培养的hBMSCs的细胞周期。将新型磷酸钙骨水泥在不同凝结时间分别加入到BMSC浓度为1×107/L的6孔培养板中,逐日观察材料边缘细胞贴壁生长情况,培养一周后扫描电镜观察;取第三代BMSC,将密度调至1×107/L加入到12孔培养板,注入糊状磷酸钙骨水泥(成团期),分别于培养1天、3天、5天、1周终止培养进行扫描电镜观察。结果新型磷酸钙骨水泥的细胞毒性反应为0～Ⅰ级,基本无毒性。光镜下见细胞在大部分组的CPC材料边缘生长良好,未见细胞变形、坏死;扫描电镜观察见大量细胞紧贴材料生长,细胞生长良好,细胞呈不规则的多角形、近圆形,在骨水泥表面与其他细胞相连融合成片。结论新型可注射性磷酸钙骨水泥具有良好的生物相容性,骨髓间充质干细胞能够在常规培养体系中与新型可注射可降解磷酸钙骨水泥共培养。     

脊柱结核患者骨密度与骨髓间充质干细胞迁徙研究

 目的 探究脊柱结核患者骨密度和骨髓间充质干细胞（BMSCs）迁徙能力的变化及相关性。方法 选取2020年6月1日-2021年12月1日某院住院的脊柱结核行脊柱内固定患者（结核组,72例）和胸腰椎骨折或椎管狭窄行脊柱内固定的患者（对照组,76例）,测定患者骨密度,结核组和对照组各采集6例患者手术时取的钉道血提取BMSCs,将提取的BMSCs进行单纯培养和卡介苗（BCG）共培养（即在BMSCs中加入BCG进行共培养）,采用划痕试验测定各组第8小时、第16小时、第24小时BMSCs迁徙率,比较各组BMSCs迁徙能力的差异,并对BMSCs标本来源患者骨密度和BMSCs迁徙率作相关性分析。结果 结核组患者的骨密度[（0.84±0.19） g/cm²]低于对照组[（0.95±0.16） g/cm²],差异有统计学意义（P<0.05）;结核组患者BMSCs迁徙率低于对照组（P<0.05）;加入BCG共培养后,结核组患者BMSCs迁徙能力依旧明显降低（P<0.05）。在第8小时和第16小时BMSCs迁徙率与其标本来源患者的椎体骨密度相关系数（r值）分别为0.80、0.67。结论 较胸腰椎骨折或椎管狭窄者患者,脊柱结核患者骨密度明显降低,脊柱结核患者BMSCs迁徙能力减弱;BCG对BMSCs的迁徙能力无明显影响,骨密度与BMSCs迁徙率呈正相关。     

[Long-term bone marrow culture]

Long-term bone marrow culture is an experimental in vitro model of hematopoiesis imitating conditions in vivo. It contains hematopoietic elements at various stages of differentiation as well as a supportive stromal microenvironment. Primitive hematopoietic stem cells of mesenchymal origin, the long-term culture initiating cells proliferate and differentiate into different cell types, giving rise to the adherent stromal layer and to various hematopoietic elements attached to it or floating freely in the supernatant medium. The stromal layer keeps the hematopoietic cells aggregated, helps their mitosis, differentiation and maturation by cell-to-cell contact, produces hematopoietic growth factors (cytokines), and forms the extracellular matrix required for cell attachment. Hematopoiesis occurs without exogenous growth factors. The appearance and development of the stroma, the proliferation and differentiation of hematopoietic progenitor cells, and the production of cytokines differ in long-term cultures of the normal and of pathologically altered bone marrow. Long-term bone marrow culture is applied in fundamental studies of normal and pathologically altered hematopoiesis, in pharmacological research, in the purging of residual leukemia cells from bone marrow autotransplants, and in the gene transfer. It is also suitable for testing carcinogenic and toxic chemicals causing hematopoietic damage through occupational or habitual exposure.     

Impaired expansion and multipotentiality of adult stromal cells in a rat chronic alcohol abuse model

It is well established that bone maintenance and healing is compromised in alcoholics. Adult bone marrow-derived stromal cells (BMSCs) and adipose tissue-derived stromal cells (ASCs) likely contribute to bone homeostasis and formation. Direct and indirect alcohol exposure inhibits osteoprogenitor cell function through a variety of proposed mechanisms. The goal of this study was to characterize the effects of chronic alcohol ingestion on the native number and in vitro growth characteristics and multipotentiality of adult BMSCs and ASCs in a rat model. Adult male Sprague-Dawley rats received a liquid diet containing 36% ethanol or an isocaloric substitution of dextramaltose (control). After 4, 8, or 12 weeks of the diet, ASCs were harvested from epididymal adipose tissue and BMSCs from femoral and tibial bone marrow. Cell doublings (CDs) per day and doubling times (DTs) were determined for primary cells (P0) and cell passages 1 through 6 (P1-P6). Fibroblastic (CFU-F), adipogenic (CFU-Ad), and osteogenic (CFU-Ob) colony-forming unit (CFU) frequencies were assessed for P0, P3, and P6. The CDs and DTs were lower and higher, respectively, for ASCs and BMSCs harvested from ethanol versus control rats at all time points. The CFU-F, CFU-Ad, and CFU-Ob were significantly higher in ASCs harvested from control versus ethanol rats for P0, P3, and P6 at all times. Both CFU-Ad and CFU-Ob were significantly higher in P0 BMSCs harvested from control versus ethanol rats after 12 weeks of the diet. The CFU-Ob for P3 BMSCs from control rats was significantly higher than those from ethanol rats after 8 and 12 weeks on the diet. All three CFU frequencies in ASCs from ethanol rats tended to decrease with increasing diet duration. The ASC cell and colony morphology was different between control and ethanol cohorts in culture. These results emphasize the significant detrimental effects of chronic alcohol ingestion on the in vitro expansion and multipotentiality of adult mesenchymal stromal cells (MSCs). Maintenance of the effects through multiple cell passages in vitro suggests cells may be permanently compromised.