催化信号放大系统的制备及其在免疫组化和原位杂交中的应用

目的：应用本实验室制备的催化信号放大（ｃａｔａｌｙｚｅｄ　ｓｉｇｎａｌ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ,ＣＳＡ）试剂,提高免疫组化（ＩＨＣ）和原位杂交（ＩＳＨ）的敏感性。方法：ＣＳＡ法应用于ＩＨＣ检测５０例１０种不同类型的肿瘤切片中４０种不同的抗原和ＩＳＨ检测６种不同的ＲＮＡ成分,并与相应的常规方法进行敏感性比较。同时分析了存在的问题。结果：ＣＳＡ－ＩＨＣ法较传统的ＰＡＰ法、ＡＢＣ法和 ＬＳＡＢ法敏感 ５００～１０００倍,较 ＥｎＶｉｓｉｏｎ法敏感 ２０～１００倍。 ＣＳＡ－ＩＳＨ法可使探针浓度从 ３ μｇ／ｍｌ降到 ０． ５～１μｐ／ｍｌ,杂交时间从 ２ ｄ缩短到 １ｄ,杂交阳性率明显提高。结论：本实验室制备的 ＣＳＡ系统与常规方法相比具有较高的敏感性、稳定性和低背景等优点,完全可取代进口试剂,非常适合于一抗昂贵、抗原性弱的ＩＨＣ检测,还可作为常规ＩＳＨ染色方法。     

催化信号放大法的改进

目的:探讨酪胺与过氧化物酶发生酶促反应后,用热缓冲液洗以进一步提高和改善催化信号放大法(CSA)的敏感性和特异性.方法:应用7种不同类型的一抗,2张不同肿瘤的组织芯片,同时进行EnVision法、LsAB法、标准CSA法和改进CSA法染色,比较敏感性和特异性.结果:改进CSA法最为敏感,其次是标准CSA法、EnVision法和LsAB法,改进CSA法的敏感性较标准CSA法高2～3倍.4种方法背景染色基本一致,细胞定位准确.结论:改进后的CSA法的稳定性、敏感性好于标准CSA法.     

石蜡包埋组织切片原位核酸杂交研究

目的 :探讨石蜡包埋组织切片的原位核酸杂交方法 ,以检测克山病 ( KSD)尸检心肌中的RNA。方法 :应用生物素标记的人工合成寡核苷酸探针 ,对 72例心肌石蜡包埋组织切片进行原位核酸杂交。结果 :各型克山病心肌石蜡组织切片的阳性杂交信号为 80 %～ 87.9% ,而正常对照仅为 14.3%。结论 :应用人工合成寡核苷酸之原位核酸杂交技术 ,对长期保存的石蜡组织进行回顾性研究是可行的。     

应用直接酪胺信号放大方法显示Y染色体荧光原位杂交信号

目的用直接酪胺信号放大(tyramine signal amplification,TSA)方法显示Y染色体荧光原位杂交信号,以提高检测脑组织切片Y染色体荧光原位杂交信号的灵敏度。方法以小鼠Y染色体重复序列pY353/B cDNA为模板标记RNA探针,以雌性小鼠为对照,用原位杂交方法杂交Y染色体特异性基因区域,分别用直接TSA方法和"三步抗体法"显示荧光原位杂交信号。通过计数Y染色体阳性细胞核占所有细胞核的百分率来计算TSA法和"三步抗体法"检测脑组织切片Y染色体荧光原位杂交信号的灵敏度,比较分析两种方法灵敏度的差异。结果"三步抗体法"在脑切片检测Y染色体阳性信号的灵敏度和特异度分别为85.67%和100%;直接TSA法在脑切片检测Y染色体阳性信号的灵敏度和特异度分别为92.82%和100%。结论TSA方法检测脑组织切片Y染色体荧光原位杂交信号的灵敏度比"三步抗体"法有显著的提高,可以用于脑内追踪和分析骨髓干细胞的迁移规律。     

人IL—3cDNA探针制备及应用

采用多聚酶连反应（ＰＣＲ）扩增人ＩＬ—３ｃＤＮＡ片段,以地高辛（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ—１１—ｄＵＴＰ）为标记物,随机引物法标记ＩＬ—３ｃＤＮＡ探针。探针经斑点杂交和核酸原位杂交证明：用制备ＩＬ—３ｃＤＮＡ探针检测细胞ＩＬ－－３ｍＲＮＡ表达具有特异性强,灵敏度高,使用简便,杂交结果直观,探针可较长时间保存和无放射性污染等优点。     

宫颈癌组织及细胞中环氧合酶-2的表达及其意义

目的: 研究宫颈癌组织及细胞株中环氧合酶-2(COX-2)蛋白及基因表达情况. 方法: 用免疫组化方法检测29例宫颈癌患者COX-2的表达水平,并以14例慢性宫颈炎症患者和18例正常宫颈上皮为对照组;用免疫细胞化学方法和原位分子杂交法检测宫颈癌细胞株SiHa和HeLa中COX-2蛋白及基因表达. 结果: ①宫颈癌患者COX-2表达阳性率为75.9%,高于慢性宫颈炎症患者和正常宫颈上皮组(P<0.01);②COX-2在不同宫颈癌FIGO(国际妇产科联盟)分期、病理分级中的表达水平不同,但这一差异无统计学意义(P>0.05);③COX-2在宫颈鳞癌及腺癌中均有表达,但两者相比无显著性差异(P>0.05),在腺鳞癌中未见COX-2表达;④COX-2在宫颈癌细胞株SiHa和HeLa中均有阳性表达,两者表达强度无明显差异;⑤在宫颈癌细胞株SiHa和HeLa中均可见到COX-2 mRNA呈阳性表达. 结论: 宫颈癌中COX-2的表达水平明显上调,其表达与宫颈癌的发生发展有关.     

胃癌组织ezrin表达的意义

目的:研究ezrin基因与胃癌发生发展的关系.方法:采用原位杂交和免疫组化法,检测60例胃癌和15例正常及40例不典型增生胃黏膜中ezrin mRNA及蛋白的表达.结果:在正常胃黏膜、不典型增生胃黏膜及胃癌组织中ezrin mRNA及蛋白阳性表达率呈递减趋势.组间差异性均有统计学意义(P＜0.001);ezrin mRNA和蛋白表达在不同浸润深度、肿瘤大小和有无淋巴结转移组内表达率的差异性有统计学意义(P＜0.05),而在年龄、性别和脉管侵犯组内差异无统计学意义(P＞0.05).Ezrin mRNA和蛋白表达呈正相关(rs=0.990,P＜0.01).结论:Ezrin表达降低与胃癌的发生、发展及浸润转移有密切关系.     

Caveolin-1基因mRNA和蛋白在胃癌组织的表达

目的:通过研究Caveolin-1 mRNA及蛋白在胃不同病变组织中的表达,对mRNA及蛋白表达的相关性及与胃癌临床病理参数间的关系进行分析.方法:25例正常胃黏膜、65例不典型增生胃黏膜及71例胃癌组织,采用免疫组化SP法检测蛋白的表达情况;依据GenBank中Caveolin-1基因序列(NC-000007),设计并合成全长21 bp的寡核苷酸探针,运用原位杂交技术对Caveolin-1 mRNA的表达进行检测.结果:Caveolin-1 mRNA和蛋白在正常胃黏膜、不典型增生胃黏膜及胃癌细胞胞浆中的阳性表达率呈递减趋势,阳性率分别为:92.0%,83.1%,38.2%和88.0%,83.1%,28.2%.Caveolin-1 mRNA和蛋白表达在不同浸润深度、有无淋巴结转移组、有无脉管侵犯组内表达率的差异有统计学意义(P＜0.05),在年龄及性别组内表达率的差异无统计学意义(P＞0.05).Caveolin-1 mRNA和蛋白表达呈正相关(rs=0.967,P＜0.05).结论:Caveolin-1 mRNA和蛋白在正常胃黏膜、不典型增生胃黏膜、胃癌中阳性表达率均逐渐降低,两者在不同病变组织中表达的一致性提示该基因在癌组织中的低表达发生于转录或以上水平的抑制.     

导流杂交与杂交捕获二代及原位杂交在女性生殖道人乳状瘤病毒检测中的比较

目的：通过比较导流杂交（HybfiMax）与杂交捕获二代（HC-Ⅱ）及原位杂交（ISH）在女性生殖道人乳头状瘤病毒（HPV）感染检测中的，一致性，评价导流杂交法的应用价值。方法：对413例女性的宫颈脱落细胞标本，用HybfiMax和HC-Ⅱ进行HPV检测，比较检测结果的一致性，并计算两种方法对高级别病变检出率的差异；对101例患者的宫颈石蜡切片标本进行HPV16／18原位杂交（ISH），比较HybriMax分型结果与ISH结果的一致性。结果：HybriMax与HC-Ⅱ对13种高危型HPV的检测结果总符合率为92．5％，Kappa指数为0．75，一致性极好，对组织病理证实为宫颈上皮内瘤变Ⅱ级（CINⅡ）及其以上病变的检出率无差异。HybriMax和ISH检测HPV16／18的符合率为89．1％，Kappa指数为0．776，一致性极好。结论：HybirMax检测结果与HC-Ⅱ及ISH高度吻合，是较理想的HPV检测方法。     

恶性淋巴瘤组织中内皮细胞特异性分子-1mRNA及其蛋白的表达

目的探讨恶性淋巴瘤组织中内皮细胞特异性分子-1(ESM-1)mRNA和蛋白的表达及其与临床病理特征的关系.方法采用免疫组化S-P法、原位杂交方法对58例淋巴瘤组织和10例正常淋巴结的ESM-1蛋白及mRNA进行检测.结果 ESM-1蛋白及 mRNA 在淋巴瘤组织中均有表达,在血管中较少表达.结论 ESM-1分子可能参与了淋巴瘤的发生发展过程.     

原位杂交与免疫组化技术用于评价化疗后结直肠癌患者MLH1、MSH2和hMSH6表达水平的对比研究

目的 探讨原位杂交方法和免疫组化方法两种不同方法在检测评价直肠癌术后新辅助化疗治疗后患者三种错配修复蛋白(hMLH1、hMSH2和hMSH6)表达水平的效果。方法选取本院收治的散发性结直肠癌(SCRC)患者260例,取手术切除的肿瘤组织,使用较原位杂交和免疫组化法测定hMLH1、hMSH2和hMSH6表达水平的效果,比较三种指标之间的关联性。结果不同部位的肿瘤各种特征之间未见明显差别。原位杂交法检测hMLH1、hMSH2、hMSH6的阳性率显著高于免疫组化检测的阳性率;免疫组化法检测结果提示hMLH1与hMSH2的表达无明显相关性,hMLH1或hMSH2与hMSH6表达分别呈正相关;原位杂交法检测结果提示hMLH1与hMSH2,hMLH1与hMSH6,hMSH2与hMSH6表达均呈正相关。结论原位杂交法和免疫组化方法两种方法在检测评价直肠癌术后辅助化疗后患者三种错配修复蛋白hMLH1、hMSH2和hMSH6表达水平的效果中原位杂交法更优。     

STAT3在食管上皮内瘤变及食管癌组织中的表达及其意义

目的探讨STAT3mRNA及STAT3蛋白在食管上皮内瘤变演变过程中的作用。方法选取食管癌高发区的食管上皮内瘤变病例150例(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级各50例)及食管癌100例进行研究,将其中60例接受食管癌切除术患者的食管上、下残端的正常黏膜组织作为对照。采用原位杂交技术和免疫组织化学法检测正常食管黏膜、食管上皮内瘤变及食管癌组织中STAT3在mRNA及蛋白水平的表达情况。结果 STAT3mRNA在正常食管黏膜、食管上皮内瘤变及食管癌组织中的阳性表达率分别为3.33%、53.33%及89.00%;STAT3蛋白在上述组织中的阳性表达率分别为6.67%、60.67%及94.00%。不同程度的食管上皮内瘤变病例中,病变组织中STAT3mRNA及STAT3蛋白的表达随食管上皮内瘤变病变程度的加重而增加。STAT3在mRNA和蛋白水平的表达存在一致性(r=0.768,P<0.05)。结论 STAT3在食管上皮内瘤变及食管癌组织中高表达,它可能在食管上皮内瘤变的演变过程中发挥重要作用。     

Increased expression of neuropeptide Y and its mRNA in STZ- diabetic rats

目的：研究糖尿病大鼠下丘脑和胰腺神经肽Y的mRNA及蛋白表达情况,以探讨NPY和糖尿病的关系。方法：建立链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠模型,设立糖尿病、糖尿病胰岛素治疗及对照组,饲养24周后处死动物。用原位杂交和免疫组化检测下丘脑和胰腺NPY的mRNA及蛋白表达情况。结果：1.糖尿病大鼠下丘脑NPY的mRNA及蛋白表达均增加,NPY的mRNA表达主要在弓状核,说明弓状核是NPY产生的主要部位。2.给予胰岛素治疗后,STZ糖尿病大鼠下丘脑的NPY的mRNA及蛋白表达均较糖尿病组明显下降,说明胰岛素缺乏是STZ糖尿病大鼠下丘脑NPY增多的重要原因之一。3.下丘脑NPY增高的糖尿病大鼠具有多饮、多食;胰岛素治疗后其NPY下降,糖尿病大鼠的多饮、多食明显缓解,证实NPY参与STZ糖尿病大鼠的某些病理生理过程。4.首次揭示在STZ糖尿病大鼠胰岛中NPY的mRNA及蛋白表达增加。胰岛素NPY阳性细胞的分布也发生改变,由主要分布在周边变为整个胰岛散在分布,给予胰岛素治疗后,胰岛中的NPY和mRNA及蛋白表达未见明显改变。结论：糖尿病下丘脑NPY的增多,主要参与糖尿病的多饮、多食等病理生理过程。虽然糖尿病胰岛的NPY增多原因及其作用还不完全清楚,但为今后进一步的研究提供了重要线索。     

小鼠性决定基因SRY探针的制备

目的 研究制备地高辛标记的小鼠性决定基因SRY探针,用于检测小鼠体内SRY基因表达的研究。方法 按已知的雄性小鼠Y染色体上性决定蛋白基因(SRY)的序列,请上海博亚公司合成四条oligoDNA,采用PCR技术连接并扩增,地高辛标记的方法制备基因探针。结果 用细胞原位杂交方法证实这种探针具有较高的敏感性和特异性。结论 小鼠性决定基因SRY探针的制备成功为进一步研究异体雄性小鼠骨髓移植到雌性小鼠体内后的分布和表达提供了实验基础。     

胃癌组织中Dnmt1基因mRNA和蛋白的表达

目的:探讨正常胃黏膜、不典型增生胃黏膜及胃癌组织中Dnmt1基因mRNA及蛋白的表达以及两者之间的关系.方法:应用原位杂交技术及免疫组化SP法检测20例正常胃黏膜、40例不典型增生胃黏膜及60例胃癌组织中Dnmt1基因mRNA及蛋白的表达状况.结果:Dnmt1 mRNA在正常胃黏膜腺上皮中基本呈阴性表达(除部分增生的小凹上皮),其阳性率在正常胃黏膜、不典型增生胃黏膜及胃癌三组间呈递增趋势,组间有统计学差异(P<0.01).Dnmt1蛋白在正常胃黏膜腺上皮中基本呈阴性表达(除部分增生的小凹上皮和淋巴细胞),其阳性率在正常胃黏膜、不典型增生胃黏膜及胃癌三组间呈递增趋势,组间有统计学差异(P<0.01).Dnmt1 mRNA和蛋白的阳性表达与年龄、性别、肿物的大小、浸润深度、有无脉管转移等临床病理特征无关,而与有无淋巴结转移有关(P<0.05).Spearman等级相关分析显示Dnmt1蛋白与mRNA表达呈正相关(rs=1.000,P<0.01).结论:Dnmt1在胃癌组织中的高表达与胃癌的发生、发展及淋巴结转移密切相关.     

口腔颌面部肉瘤中hTERTmRNA和hTERT蛋白的表达

目的:探讨hTERTmRNA及hTERT蛋白在口腔颌面部肉瘤组织中表达的生物学意义。方法:应用原位杂交和免疫组化技术检测37例口腔颌面部肉瘤和14例良性间叶组织肿瘤中hTERTmRNA和hTERT蛋白的表达,探讨口腔肉瘤组织中hTERT表达的生物学意义。结果:肉瘤中hTERTmRNA的阳性表达率明显高于良性肿瘤(62.2%/14.3%,P<0.05)。在低度、中度和高度恶性肉瘤组织中,hTERTmRNA阳性表达率分别为41.67%、50.00%和86.67%,统计分析显示低度恶性与高度恶性组间差异有统计学意义(P<0.05)。复发肉瘤中hTERTmRNA的阳性表达率明显高于原发肉瘤(P<0.05)。在发生淋巴结转移或远处转移的肉瘤中hTERTmRNA表达有升高趋势(P>0.05);口腔肉瘤中hTERT蛋白的阳性表达率明显高于良性肿瘤(P<0.05),并随肉瘤分化程度的降低而呈升高趋势,其中低度恶性肉瘤与高度恶性肉瘤比较差异显著(P<0.05)。hTERT蛋白表达与肉瘤复发密切相关(P<0.05),发生淋巴结转移或远处转移的肉瘤中hTERT蛋白表达明显升高(P>0.05)。结论:hTERT基因在口腔颌面部肉瘤发生与发展过程中可能起重要作用。     

不脱钙骨组织免疫组织化学与原位杂交的方法研究

目的 :探讨在低温塑料包埋制备的不脱钙骨切片上运用免疫组化和原位杂交技术的可行性。方法 :采用改进的甲基丙稀酸甲酯低温塑料包埋法包埋SD大鼠胫骨近端 ,制备不脱钙的骨组织切片。切片行Goldner′s三色法染色观察骨小梁结构 ;采用免疫组化SABC法和原位杂交技术检测骨组织细胞中胰岛素样生长因子 1(IGF 1)mRNA和蛋白表达。结果 :三色法染色示骨小梁结构完整 ,部分骨小梁边缘可见红染的类骨质 ,成骨细胞与破骨细胞清晰可见。免疫组化和原位杂交示IGF 1mRNA和蛋白表达于成骨细胞 骺板软骨细胞及骨髓腔中部分单核细胞的胞浆中。此外 ,在骨小梁基质中也可见IGF 1蛋白的阳性表达。结论 :利用低温塑料包埋制备的不脱钙骨切片可同时进行免疫组化和原位杂交检测观察 ,该方法为骨质疏松等代谢性骨病的分子病理学研究提供了有效的技术平台。     

p53蛋白和p53 mRNA在牙源性囊肿和成釉细胞瘤中表达的意义

目的：探讨成釉细胞瘤(AB)和牙源性角化囊肿(OKC)中p53蛋白及p53 mRNA表达的生物学意义。方法：采用免疫组化S—P法和原位杂交方法分别对p53蛋白和p53 mRNA进行检测。结果：p53蛋白在AB、OKC及正常口腔粘膜上皮细胞核中表达阳性率分别为85．7％、44．0％和33．3％，组间差异显著(P＜0．01)。伴随AB的复发与恶变，p53蛋白阳性表达强度增加，核表达数目增多，组间差异显著(P＜0．01)。角化细胞颗粒细胞p53蛋白表达减少或缺失，但却有p53 mRNA的阳性产物。p53 mRNA与p53蛋白之间存在高度负相关(r＝-0．957，P＜0．01)。结论：p53蛋白和p53 mRNA的表达是判断成釉细胞瘤预后的指标。     

大鼠肾缺血再灌注损伤时c-fos基因的表达

为探讨原癌基因c－fos在急性缺血性肾脏损伤修复中的分子调控作用，用免疫组织化学法及原位分子杂交技术，对急性肾缺血再灌注后大鼠肾组织内Fos蛋白及c－fosmRNA表达的分布、强度、时程和动力学等特征进行了研究。缺血再灌注早期即可诱导肾组织中c－fos的高效表达，肾缺血45min，Fos蛋白表达在再灌注1h、2h～4h达高峰、8h锐减、24h消失。c-fosmRNA0.5h出现、1h达高峰、2h锐减，到4h时极少。原癌基因c－fos的高效表达可能参与缺血再灌注所致肾脏损伤修复的分子调控，从而影响其病变过程。     

足月妊娠子宫肌间隙连接cx43mRNA及其蛋白的表达意义

目的：从转录及翻译水平研究细胞间隙连接基因ｃｏｎｎｅｘｉｎ（Ｃｘ）４３及其蛋白在足月妊娠子宫肌中的表达．方法：应用核酸原位杂交技术和ＳＰ免疫组织化学法,研究５１例足月妊娠子宫肌,２０例正常子宫平滑肌中,Ｃｘ４３ ｍＲＮＡ及其蛋白的表达规律．结果：Ｃｘ４３ ｍＲＮＡ及其蛋白在足月妊娠子宫平滑肌中的表达明显高于其在正常子宫平滑肌中的表达（Ｐ〈０．０５）．结论：Ｃｘ４３ ｍＲＮＡ及其蛋白在足月妊娠子宫肌