中国姥鲨软骨源新生血管抑制因子（Sp8）的分离纯化及生？…

从中国姥鲨软骨组织提蛋白质中筛选具有新生血管抑制活性和抗肿瘤活性的分子。方法：盐酸胍抽提姥鲨软骨蛋白,采用超滤和分子筛柱层析等方法分离纯化获得相对分子质量为８．３＊１０＾３的蛋白质,以体外抑制血管内皮细胞增殖,体外抑制新生血管生长和抑制小鼠移植Ｓ１８０肉瘤生长作为筛选指标。     

鲨鱼软骨活性物质的研究现状

鲨鱼是大型软骨鱼类,其软骨含有多种活性物质,具有抑制新生血管的生成、抑制肿瘤的转移和生长、增强免疫和消炎等作用。软骨粗提物或纯化制剂在临床上均有较好的抑制肿瘤作用,但是这种作用一直存在争论,尚待进一步的研究加以确证。     

魟鱼软骨多糖的分离纯化及生物活性的研究

目的研究魟鱼软骨多糖(raycartila geglycosam inoglycans,RCG)的提取、分离与纯化方法,并初步探讨其生物活性。方法采用盐酸胍提取、丙酮分级沉淀、膜超滤、Sephadex凝胶柱色谱分离、纯化获得魟鱼软骨多糖,由HPLC确定其相对分子质量和质量分数;建立Lewis肺癌小鼠模型,将实验分为生理盐水(Saline)组、不同剂量(500、250、125mg/kg)鱼软骨多糖组、环磷酰胺(CTX,60mg/kg)组,观察小鼠肿瘤生长情况,绘制肿瘤生长曲线,计算原发瘤与肺转移灶数抑瘤率,免疫组织化学染色计数肿瘤组织微血管密度(MVD),采用RT-PCR检测瘤组织血管内皮生长因子(VEGF)基因表达。结果经HPLC检测,该组分为单一多糖,其质量分数达99%以上。生物活性检测结果表明,与生理盐水组比较,该多糖各剂量组小鼠的肿瘤生长曲线平缓,原发瘤抑瘤率、肺转移灶数与生理盐水组比较差异显著(P<0.05、0.01);与生理盐水组比较,鱼软骨多糖各剂量组MVD显著减少、VEGFmRNA表达水平显著降低(P<0.01)。结论鱼软骨多糖明显抑制小鼠Lewis肺癌原发瘤的生长和转移,并可抑制肿瘤的血管形成。     

损伤软骨的细胞提取、鉴定及生物学活性研究

目的对从膝关节软骨损伤区分离出的细胞进行鉴定,并对其生长活性进行研究,以解决自体软骨细胞移植中软骨细胞来源不足的问题。方法通过膝关节镜,在软骨损伤区取少量损伤软骨组织,不含正常软骨及软骨下骨为实验组;取正常软骨组织为对照组。在胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶作用下从实验组中提取细胞,对照组中提取正常软骨细胞。实验组细胞培养贴壁后在倒置相差显微镜下观察细胞的形态是否与对照组软骨细胞一致。实验组细胞行甲苯胺蓝染色鉴定,与对照组对比;噻唑蓝（MTT）法比较两组细胞生长活性;以具有专利知识产权的Ⅰ/Ⅱ型复合胶原膜为生长载体,培养实验组和对照组第3代软骨细胞,在电镜下观察两组生长活性。结果从少量损伤的软骨组织中提取的细胞为活性正常的软骨细胞,其特征及生长活性与对照组比较,差异无统计学意义（p <0.05）。结论软骨损伤过程中软骨细胞未发生变性,少量损伤的软骨组织仍可获得适量软骨细胞,MTT 法和电镜扫描表明,其生长活性符合自体软骨细胞移植的要求,无需取正常软骨组织作为细胞来源。     

大鼠关节软骨干细胞的分离培养及其特性的鉴定

目的分离培养大鼠关节软骨干细胞(ACSCs)并鉴定其特性。方法运用纤连蛋白黏附法从大鼠关节软骨细胞中分选出ACSCs,流式细胞技术分别鉴定干细胞阳性表面抗原(阳性标志物CD90与CD44)和阴性表面抗原(阴性标志物CD45、CD31与CD34)在ACSCs中的表达水平,单克隆形成实验鉴定ACSCs的单克隆形成能力,成骨、成脂及成软骨诱导鉴定ACSCs的多向分化潜能。结果纤连蛋白可以特异性地分选出ACSCs。ACSCs高表达CD90与CD44,几乎不表达CD45、CD31与CD34。经过7d培养,单个ACSC可以形成大于32个细胞的单克隆细胞团。ACSCs具备很强的成骨、成脂和成软骨分化能力。结论大鼠关节软骨内存在ACSCs,ACSCs具有比较典型的干细胞特征。     

兔原代肋软骨细胞的三步酶消化法高效分离及体外培养观察

目的观察三步酶消化法分离兔原代肋软骨细胞的效果和收获效率,并观察其体外传代培养的生物学特性.方法三步酶消化法设计为以培养液配制的1g/L胰蛋白酶/1g/L EDTA、1g/L透明质酸酶和2g/LⅠ型胶原酶顺序消化肋软骨分离细胞,检测细胞收获效率和存活率;体外传代培养观察细胞形态、生长及胞外基质中Ⅰ型和Ⅱ型胶原、蛋白多糖聚集体等的变化.结果①肋软骨经三步酶消化软骨基质逐步解离和降解,细胞被完全分离,每克软骨的细胞收获量平均为4 295.7×104个细胞,细胞存活率平均为97.2%.②原代和第1代细胞附壁生长呈三角形或多角形,生长融合时呈卵圆形,Ⅱ型胶原免疫组化和甲苯胺蓝异染反应均呈阳性,原代细胞外基质有高的硫酸糖胺多糖含量为(80.61±11.40)μg/cm2;第3代后细胞逐渐变为梭形,Ⅱ型胶原免疫组化为阴性,甲苯胺蓝异染反应亦明显减弱,第4代细胞外基质的硫酸糖胺多糖含量为(44.74±10.18)μg/cm2.结论①三步酶消化法能完全消化降解肋软骨基质,使细胞完全分离,并具有高细胞收获率和高细胞存活率.②原代和第1代肋软骨细胞具有良好的生物学活性.     

血管生成抑制因子canstatin与肿瘤的关系

Canstatin为Ⅳ型胶原α2 链双链片段的内源性蛋白 ,作为特异性的血管生成抑制因子 ,能抑制内皮细胞 (EC)增生、迁移并有抑制EC形成血管等功能 ,有望成为抑制肿瘤生长的新途径。作者对canstatin的发现、生物学特性及其与肿瘤的关系进行了综述     

兔关节软骨细胞的分离培养及生物学特征

目的 探讨兔关节软骨细胞分离培养的方法和生物学特性。方法 从4周龄新西兰白兔关节分离培养软骨细胞,倒置显微镜下观察原代及传代培养的细胞形态学变化,并计数绘制生长曲线。测定细胞冻存复苏后的存活率。用甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学法了解葡萄糖胺多糖（GAGs）,Ⅱ型胶原的合成情况并鉴定细胞。结果 成功建立体外培养兔关节软骨细胞的实验方法。原代培养的软骨细胞呈多角形,传代3次后出现反分化。形态学、免疫化学染色显示细胞培养3代以内可以保持表型的稳定,冷冻复苏存活率为92％。结论 本文建立的体外培养关节软骨细胞的方法简单可行。体外培养的兔软骨细胞表型能保持3代稳定,具有良好的生物学活性,可用于实验研究,可经深低温冷冻保存。     

猪脑钙调素的分离,纯化及鉴定

The calmodulin has purified by heating, phenyl-Sepharose affinity chromatography, DEAE-cellulose chromatography and Sephadex G50 chromatography from the porcine brain and characterized. The results showed that the purified calmodulin appears just one band on PAGE slab with M.W. of 14.1 +/- 1.0 kd (containing 1 mmol/L CaCl2) and 16.9 +/- 1.2 kd (containing 1 mmol/L EGTA). Electrophoresis migration was distinctly different between the sample containing CaCl2 and the sample containing EGTA; pI = 4.35; the quantity of calmodulin required for half maximum activation of 2800 unit of PDE was 15ng. The purified calmodulin increased the activity of PDE and this action was inhibited by trifluoperazine. The yield was 4.2 mg/100g of the porcine brain.     

大鼠腰椎终板软骨细胞的培养及其生物学性状的研究

目的通过对大鼠腰椎终板软骨细胞的培养,观察细胞的生物学性状,探讨终板软骨细胞的生物学行为厦影响因素。方法取犬鼠腰椎终板软骨细胞,在加10％灭活胎牛血清的F12-DMEM培养液中培养,建立体外终板软骨细胞培养模型。采取绘制细胞生长曲线、HE、甲苯胺蓝染色厦免疫组织化学染色等方法,对细胞形态、活力、生长情况厦软骨细胞的表型进行鉴定。结果终板软骨细胞可以在体外培养,但细胞活力随着培养时间的延长厦传代逐渐降低;终板软骨细胞的生长情况厦细胞表型类似于关节软骨,有Ⅱ型胶原和aggrecan的表达。结论体外成功培齐了大鼠腰椎终板软骨细胞,为进一步研究终板软骨在椎间盘退变中的作用打下了基础。     

bFGF对胃癌血管新生和生物学行为的影响

目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在胃癌中表达及其对血管新生和肿瘤生物学行为的影响.方法:应用免疫组化SP法检测74例胃癌,17例癌旁bFGF表达及间质微血管密度(MVD).结果:胃癌中肿瘤细胞、间质新生血管高度表达bFGF.胃癌bFGF表达明显高于癌旁正常组织(P<0.01).癌旁正常胃粘膜及伴有肠上皮化生的胃粘膜bFGF表达较弱.bFGF高表达组的平均MVD值明显高于bFGF低表达组的平均MVD值(P<0.01).此外bFGF表达程度与胃癌淋巴结转移密切相关.结论:bFGF可促进肿瘤间质微血管生成,加速肿瘤浸润和转移.     

赤魟亲环素A的融合表达、纯化及活性特征

目的探讨赤鱼亲环素A基因(dsCypA)的生物学功能.方法构建硫氧还蛋白基因融合表达体系PETTRx-dsCypA,低温诱导表达的融合蛋白dsCypA-TRX,利用金属螯合亲和层析纯化后,经蛋白酶切割和进一步纯化,得到高纯度成熟重组dsCypA,测定其酶活性.结果重组dsCypA具有与人CypA相近的肽基脯氨酸顺反异构酶活性,这在鱼类CypA中是首次报道.结论 dsCypA的功能克隆可能部分地解释赤魟工尾刺中药应用的分子生物学机制,也为从比较生物学的角度,深入开展CypA基因的结构与功能关系研究奠定了基础.     

犬根尖牙乳头干细胞的分离培养和生物学特性

的：分离培养比格犬（Beagle犬）根尖牙乳头干细胞并研究其生物学特性。方法：拔除Beagle犬上颌年轻恒前牙,切取根尖牙乳头,采用酶消化法分离培养Beagle犬根尖牙乳头细胞,进行成纤维细胞克隆形成实验、生长曲线测定、多向分化能力研究及间充质干细胞相关表面标记物STRO-1、CD146和CK的表达分析,并将其移植至免疫缺陷鼠皮下观察矿化组织的形成。结果：Beagle犬根尖牙乳头组织中存在一群具有高度增殖能力的细胞,在相同培养条件下,其克隆形成率明显高于人根尖牙乳头干细胞,差异具有统计学意义（P<0.001）;所获得Beagle犬根尖牙乳头干细胞具有成骨、成脂和成软骨等多向分化能力;在体外经成骨诱导后可形成矿化结节,成脂诱导后可形成脂滴,成软骨诱导后免疫组织化学染色Ⅱ型胶原阳性表达;同时该群细胞STRO-1和CD146阳性表达,而CK阴性表达;与羟基磷灰石混合移植于免疫缺陷鼠皮下可形成矿化组织和牙髓 牙本质复合体样结构。结论：Beagle犬根尖牙乳头中存在具有高增殖能力和多向分化能力的根尖牙乳头干细胞。     

小鼠骨髓来源内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

目的：探讨自小鼠骨髓分离培养内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPC）的方法及其鉴定和生物学特性。方法：密度梯度离心法分离获取小鼠骨髓单核细胞,培养于EGM-2 SingleQuots培养液中,每天于倒置显微镜下观察EPC的形态。应用细胞免疫荧光法、流式细胞技术鉴定EPC表面抗原标志CD34、血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2）,荧光显微镜检测EPC吞噬DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白（DiI-AC-LDL）及结合FITC标记的荆豆凝集素（nTC-UEA-lectin）功能。结果：早期EPC呈长梭形,细胞群落可呈现线状、管状、网状生长状态,培养7d后出现干细胞集落,并逐渐增多;培养3周后,细胞集落逐渐消失,细胞呈现铺路石样生长状态。培养获得的EPC绝大部分可同时表达细胞表面标记物CD34及VEGFR2,并具有吞噬DiI-AC-LDL及结合FITC-UEA-lectin功能。结论：自小鼠骨髓中分离、培养、纯化EPC是一种方便、经济、高效的培养方法。通过该方法培养获得的EPC增殖能力强,数量充足,生物学特性稳定。该方法对今后利用EPC进行细胞移植治疗的相关实验有着重要意义。     

猪外周血内皮祖细胞的分离培养及生物学特性

目的从小型猪外周血中分离、培养内皮祖细胞(EPCs),并进行相关鉴定,分析其生物学特性。方法采用密度梯度离心法获得小型猪外周血单个核细胞并进行体外传代培养,分别采用倒置相差显微镜观察、免疫荧光染色、流式细胞仪分析及Matrigel实验和DiI-acLDL摄取实验,对其细胞表型及功能进行相关鉴定。结果外周血单个核细胞在培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样形态;培养第14天,约80%的细胞DiI-acLDL吞噬实验阳性,且CD133、CD34、flk-1、CD31、CD144的表达阳性率分别达到25.1%、55.9%、97.7%、82.0%和95.4%;细胞培养于凝固的Matrigel表面7 d后,形成特征性的网格状结构。结论该实验成功从小型猪外周血单个核细胞中分离培养出EPCs,在其体外扩增诱导的过程中,表达EPCs和成熟内皮细胞的特征性标志。     

藤黄酸胺基醇酯的合成及其抗肿瘤活性

以藤黄酸为原料,与相应的二溴烷烃反应得到藤黄酸溴代烷基酯,再将其与不同的胺反应得到20个藤黄酸胺基醇酯衍生物(3a~3t),其结构经IR、MS、¹H NMR确证。采用MTT法测试目标化合物对肝癌细胞Bel-7402、SMMC-7721、Bel-7404、QGY-7701和 HepG2的体外抗肿瘤活性。结果显示,大多数化合物表现出较强的抗肿瘤活性,其中化合物3c,3g,3h,3p和3t活性强于藤黄酸,3g和3h的抗肿瘤活性强于紫杉醇。     

3-(4-羟基苯基)-6-甲氧基-7-羟基-4H-色烯-4-酮的合成及其抑制新生血管的作用

 目的 合成目标化合物3-(4-羟基苯基)-6-甲氧基-7-羟基-4H-色烯-4-酮(化合物1),考查该化合物抑制新生血管生长活性。 方法 以异香兰素为起始原料,经过插氧、水解、酰化和环合四步反应合成目标化合物;以新生血管抑制剂2-甲氧基雌二醇为阳性对照,采用人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial Cells, HUVECs)筛药模型和子宫内膜基质细胞(endometrial stromal cells, ESCs)模型分别测定该化合物的新生血管抑制活性和细胞毒性。结果 在合成路线上改进了文献方法,用常规反应替代了文献方法中较难控制的微波反应,同时提高了合成收率;生物活性测定结果显示目标化合物的EC50和TI值分别为47.37 μmol/L和7.39。 结论 首次报道了目标化合物抑制新生血管的作用,该化合物具有与2-甲氧基雌二醇相近的体外活性。     

非小细胞肺癌细胞外泌体源性FZD10促进体外血管生成

目的 探讨非小细胞肺癌（NSCLC）细胞外泌体源性FZD10在血管生成中的作用及其机制。方法 采用超速离心法分离外泌体,并利用Western blot和RT-qPCR技术分析NSCLC细胞（95D和H1299）、正常人支气管上皮细胞（BEAS-2B）及其外泌体中FZD10的表达;通过转染FZD10-siRNA敲低FZD10表达,用FZD10未敲低和敲低的NSCLC细胞外泌体分别处理HUVEC细胞,利用体外血管生成实验观察其成管能力,采用ELISA和RT-qPCR技术分析血管生成相关因子VEGFA和Ang-1的表达;进一步利用Western blot分析外泌体源性FZD10对信号通路PI3K、Erk1/2和YAP/TAZ激活的影响。结果 同BEAS-2B细胞及其外泌体相比较,FZD10在95D和H1299细胞及其外泌体中高表达（P<0.01）;95D和H1299细胞来源的外泌体可促进HUVEC的微管形成及VEGFA、Ang-1的蛋白分泌、m RNA的表达（P<0.01）,但在95D和H1299细胞敲低FZD10后这些效果受到抑制。FZD10的敲低可抑制PI3K、Erk1/2信...