Screening of mimotope of Salmonella typhimurium lipopolysaccharide from phage-displayed peptide]

OBJECTIVE: To identify and characterize the mimotope of lipopolysaccharide (LPS) from cyclic 7-mer phage peptide library. METHODS: Cyclic 7-mer phage-displayed peptide library was screened using monoclonal antibody 2F4 (mAb 2F4) against Salmonella typhimurium LPS as the target, and the selected clones were tested by sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and specific antigen inhibition ELISA. RESULTS: After 3 round of screening, 34 of the 38 selected clones were identified as positive for binding to mAb 2F4. Salmonella typhimurium LPS was capable of inhibiting the binding between the cones and mAb 2F4, with the 50% inhibitory concentration of all the positive clones within the range of 0.125-0.250 microg/ml. Sequence analysis was performed for 10 of the positive clones, whose amino acid sequences were subsequently deduced, and 7 of them had conservative amino acid of P-X-WAS-X-W with the mean hydrophobic amino acid content of 71.4% in all the sequences. CONCLUSION: The phage-displayed peptide is capable of simulating the epitope of Salmonella typhimurium LPS.     

汉坦病毒核衣壳蛋白mAb B11模拟结合肽的筛选和鉴定

目的：应用噬菌体展示肽文库筛选可与肾综合征出血热病毒mAb B11特异性结合的短肽。方法：采用Protein-A亲和纯化的单抗为筛选配基，对噬菌体展示的随机12肽文库进行生物亲和淘选，夹心ELISA、竞争ELISA鉴定筛选克隆的结合特性，并进一步对阳性克隆进行序列测定和分析。结果：通过4轮淘选，ELISA测定显示筛选到的噬菌体短肽多数能与B11单抗特异性地结合（12／15），序列分析表明8个阳性克隆氨基酸序列分为4组，同源性分析显示核心序列可能为（M／F）HR（H／T）X（H／W）或（R／F）HX（H／T）P（W／M）（L／Y）。结论：基于表位水平的HFRSV特异性诊断试剂的研制和小分子多肽疫苗的设计提供了重要依据     

丙型肝炎病毒包膜蛋白E2抗原模拟表位的筛选和鉴定

目的：筛选丙肝病毒（HCV）包膜蛋白（E2）特异性噬菌体模拟表位。方法：以抗－HCV E2的单克隆抗体作为固相筛选分子，对噬菌体同七肽库进行5轮“吸附－洗脱－扩增“的筛选过程，随机挑取50个克隆，经酶联免疫吸附法（ELISA）鉴定、交叉反应以及竞争抑制性实验，最后对所选克隆进行DNA序列分析，以确定HCV E2抗原的模拟表位。结果：经噬菌体富集后，得到12个阳性克隆，确定氨基酸序列XXPXYXW为HCV E2的模拟表位。结论：用噬菌体七肽库成功筛选得到HCV E2的模拟表位，为开展用HCV模拟表位探索HCV的防治研究创造了条件。     

抗大肠杆菌LPS多克隆抗体的制备与LPS模拟肽的筛选

目的获得抗大肠杆菌脂多糖(LPS)多克隆抗体与模拟LPS表位的线性噬菌体展示肽克隆。方法制备兔抗鼠大肠杆菌抗血清,鉴定抗血清效价。以亲和纯化的多克隆抗体为靶,筛选噬菌体随机线性十二肽库。双夹心ELISA和竞争抑制ELISA鉴定阳性噬菌体克隆。结果兔抗血清能与大肠杆菌LPS反应。用亲和层析纯化的多克隆抗体为靶分子进行三轮筛选,随机挑选17个克隆,其中6个克隆显示与多抗结合。大肠杆菌LPS可抑制阳性噬菌体克隆与多抗结合,所有克隆的IC50(达到50%抑制率的LPS浓度)为250ng/ml。结论获得能与大肠杆菌LPS反应兔多克隆抗体,筛选得到可模拟大肠杆菌LPS表位的噬菌体展示线性十二肽。     

噬菌体随机肽库筛选MUC1抗原模拟表位

目的噬菌体随机多肽文库筛选及鉴定MUC1抗原的模拟表位。方法利用纯化获得的BC2抗体筛选噬菌体随机7肽库,通过夹心ELISA分析噬菌体克隆,测定阳性克隆DNA序列并进行同源性及氨基酸分析,竞争性抑制实验鉴定噬菌体克隆。结果经3轮筛选,获得了30个阳性克隆,DNA序列分析并推导出氨基酸序列:TAPDLRP、SAPDLRP、AAPDSRP及LAPDFRP。鉴定结果表明:4个噬菌体展示肽克隆抑制率均在50%以上。结论所得序列TAPDLRP、SAPDLRPAAPDSRP及LAPDFRP模拟MUC1抗原表位。     

可结合细胞表面IL-2Rα的短肽分子的筛选

目的利用噬菌体肽库技术筛选可特异性结合IL-2Rα的短肽序列，探索获得IL-2Rα小分子拮抗剂的可能性。方法以高表达IL-2Rα的MT-2细胞为钓饵。筛选噬菌体线性12肽库。用抗IL-2Rα单克隆抗体竞争洗脱结合的噬菌体，细胞ELISA、免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆，并测序。结果随机挑选的17个克隆中有7个可与MT-2细胞结合。免疫组化显示阳性噬菌体克隆M15可与MT-2细胞及PHA刺激的PBMC结合。根据阳性克隆DNA序列，推导出氨基酸序列，共有6种序列，富含亲水氨基酸并包含Tyr、Phe、Leu保守残基。结论得到含Tyr、Phe保守残基的序列，阳性序列可结合细胞表面的IL-2Rα。     

MUC1抗原的表位预测及模拟位的筛选

目的预测MUC1抗原的B细胞表位,从噬菌体随机多肽文库筛选及鉴定MUC1抗原的模拟位.方法联合运用多种方法对MUC1的二级结构和表面特性,如理化性质、亲水性、可塑性、溶剂可及性及免疫原性等方面进行分析,预测MUC1的抗原表位.利用纯化获得的BC2抗体筛选噬菌体随机7肽库,夹心ELISA分析噬菌体克隆,测定阳性克隆DNA序列,竞争性抑制实验鉴定阳性噬菌体克隆.结果MUC1存在有多个潜在的抗原表位位点,可能的蛋白质抗原表位区域:1-10,24-54,65-77,84-91,108-134,140-156,159-174,179-196,199-210,220-233,237-265,270-299,316-337,351-362,369-396,411-420,445-502.经3轮筛选,获得了30个阳性克隆,DNA序列分析并推导出氨基酸序列:TAPDLRP、SAPDLRP、AAPDSRP及LAPDFRP 4个噬菌体展示肽克隆抑制率均在50%以上.结论应用多参数预测MUC1抗原的B细胞表位,为进一步研究MUC1结构和功能、选择表达新型MUC1分子奠定了基础.所得序列TAPDLRP、SAPDLRP、AAPDSRP及LAPDFRP模拟MUC1抗原表位.     

递呈BAC5单抗识别位点的M13噬菌体克隆系的建立

【目的】获得可递呈抗低分化和未分化癌细胞单克隆抗体 (BAC5单抗 )抗原表位的M13 噬菌体克隆系。【方法】以BAC5单抗为靶抗体 ,对由M13 噬菌体构建的随机 12肽文库进行生物淘洗。用抗体竞争方法从阳性克隆中选出与BAC5单抗结合率较高的克隆系。通过ELISA方法检测BAC5单抗对上述克隆的选择性识别。【结果】经过 3轮淘洗 ,获得的阳性克隆率为77% (35 /4 5 )。来自C2、C17和C2 9号克隆的噬菌体对外加BAC5单抗的结合率分别为 71 6 %、49 4%和 6 4 0 % ,高于其它阳性克隆。BAC5单抗与来自上述 3个克隆的噬菌体呈阳性反应 ,与来自辅助型M13 株的噬菌体 (VCSM13 )和淘洗前的文库噬菌体(RPLM13 )呈阴性反应。【结论】来自C2、C17和C2 9号克隆的噬菌体有可能递呈与BAC5单克隆抗相关的抗原表位。     

Mapping epitopes of human papillomavirus type 16 L1 protein with a phage display epitope library

Ｍａｐｐｉｎｇｅｐｉｔｏｐｅｓｏｆｈｕｍａｎｐａｐｉｌｏｍａｖｉｒｕｓｔｙｐｅ１６Ｌ１ｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈａｐｈａｇｅｄｉｓｐｌａｙｅｐｉｔｏｐｅｌｉｂｒａｒｙＬｉｕＴｉａｎｊｕ刘天菊，ＳｉＬüｓｈｅｎｇ司履生，ＷａｎｇＹｉｌｉ王一理，ＳｕｎＸｉａ...     

亲环素A抗原表位氨基酸序列及三维结构研究

目的：研究人抗亲环素A（CyPA)McAb D4识别的抗原表位的氨基酸组成及其在蛋白分子上的三维定位。方法：以抗人亲环素A McAb D4作捕获抗体,对噬菌体展示肽库进行淘筛,并对筛选出的噬菌体中插入片段进行DNA序列测定和氨基到序列分析,再用RasMol蛋白质三维结构分析软件在亲环素A分子的三维结构中查找相应的抗原表位。结果：经过三轮淘筛和扩增,选择7个克隆进行序列,提示该抗原表位是构象性的。用RasMol蛋白质三维结构分析软件在亲环素A分子的三维结构中,找到由W121、S99、L98、Q111、S110、F112、L122构成的疏水代状结构,可能就是McAb D4的抗原表位。结论：人亲环素A分子上W121、S99、L98、Q111、S110、F112、L122构成一个构象型抗原表位。     

抗IgE中和抗体表位的筛选和鉴定

目的: 对噬菌体线性7肽库进行筛选,得到诱发机体产生抗IgE中和抗体的IgE表位肽. 方法: 以抗IgE抗体为靶,筛选噬菌体线性7肽库,双夹心ELISA鉴定阳性克隆. 结果: ELISA鉴定随机挑选的经3轮筛选后所得48个噬菌体克隆,其中15个克隆显示与抗IgE抗体有较强的结合能力,序列测定得到氨基酸序列为:DHIDMGL;DHMWLGL;DHQDAGF;DHMDQNL. 竞争性ELISA结果显示4个序列均能与IgE竞争性结合抗IgE mAb,MAP点杂交结果显示筛选得到的多肽能与抗IgE抗体特异性结合. 结论:经筛选得到的7肽序列具有相似的骨架区,并与IgE的CH3区高度同源. 初步验证这些噬菌体展示肽能与抗IgE中和抗体特异性结合,为IgE相关多肽疫苗的研究提供了依据.     

噬菌体随机肽库筛选抗恶性疟原虫乳酸脱氢酶单抗2A5的识别表位

目的利用噬菌体随机肽库技术筛选恶性疟原虫乳酸脱氢酶(pfLOH)抗体2A5的识别表位。方法以抗pfLDH的单抗2A5筛选噬菌体随机12肽库,挑取阳性克隆测定DNA序列,推导其氨基酸序列并进行同源性分析。通过ELISA、竞争抑制试验鉴定获得的噬菌体短肽与单抗2A5之间的结合特性。结果从噬菌体随机12肽库中筛选出21株可与2A5单抗特异结合的噬菌体克隆,其中多数克隆呈现核心序列SQK(R)L,该序列与pfLDH的一级序列具有一定同源性。竞争抑制实验显示,带有核心序列的噬菌体克隆可与pfLDH竞争结合单抗2A5。结论 SQK(R)L是pfLDH单抗2A5特异识别的表位。     

人端粒酶逆转录酶功能区表位的筛选与鉴定

目的 筛选并鉴定人端粒酶逆转录酶(hTEIH)功能区表位。方法 应用差减筛选法，以抗hTERT多克隆抗体为靶筛选噬菌体12肽库，通过夹心ELISA、抗hTERT多抗特异性阻断实验、竞争抑制实验鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果 经3轮筛选，从随机挑取的24个噬菌体克隆中有13个克隆特异地与抗hTERT多抗结合，而不与正常小鼠IgG结合，其中11个克隆的氨基酸序列富含组氨酸(最高达41．6％)及亲水氨基酸(最高达91．67％)。结论 得到11个序列不同的hTERT表位，为研制针对hTERT的小分子抑制剂提供了实验依据。     

用噬菌体随机12肽库筛选单纯疱疹病毒2型gD基因模拟抗原表位的研究

目的用针对HSV-2gD的单克隆抗体（McAb）从噬菌体展示随机12肽库中筛选HSV-2gD基因的抗原模拟表位，寻找更有效的小片段短肽作为HSV新型基因工程疫苗的候选抗原。方法利用HSV gD McAb淘筛噬菌体随机12肽库，经“吸附-洗脱-扩增”的4轮筛选，随机挑取噬菌体克隆经酶联免疫吸附实验（ELISA）进行鉴定，并对阳性克隆所携带的外源DNA片段进行序列测定和计算机辅助分析。结果经4轮生物淘筛后特异性噬菌体克隆得到了富集，对阳性克隆的分析结果表明P-PLW和PYH--H氨基酸序列是模拟妒基因抗原表住的骨架结构，携有此短肽的噬菌体可以与McAb特异结合。结论从噬菌体随机12肽库中筛选到的外源序列可以模拟HSV-2 gD McAb针对的抗原表位，可能是HSV-2gD一个抗原表住的替代抗原，为进一步研究HSV-2基因疫苗奠定了基础。     

日本血吸虫抗原的表位模拟肽筛选及免疫保护性

目的　筛选日本血吸虫雄虫抗原的表位模拟肽 ,并探讨其诱导小鼠抗日本血吸虫的免疫保护性。　方法　用日本血吸虫可溶性雄虫抗原的IgG对噬菌体随机 1 2肽库进行亲和筛选。 3轮筛选后 ,经Dot-ELISA检测获得阳性噬菌体克隆 ,并用混合特异性噬菌体克隆免疫小鼠及进行抗日本血吸虫免疫保护性分析。　结果　 1 8个特异性噬菌体克隆均显示有抗原性 ,其噬菌体混合克隆免疫诱导小鼠产生了特异性抗体 ,以及 31 72 %的减虫率和 51 54%的减卵率 ,与对照组比较差异有显著性 (P <0 0 0 1 )。　结论　筛选噬菌体肽库获得的日本血吸虫可溶性雄虫抗原的表位模拟肽分子能诱导小鼠产生抗日本血吸虫的保护性免疫。     

能结合HCV E2蛋白的人CD81模拟肽的筛选与活性鉴定

目的用CD81单克隆抗体筛选噬菌体随机展示十二肽库,以期得到可模拟人CD81功能位点、能抑制HCVE2与其受体—人CD81分子结合的小肽。方法用CD81单抗从噬菌体随机展示十二肽库中筛选人CD81模拟肽,用ELISA鉴定阳性噬菌体克隆;以阳性噬菌体免疫BALB/c小鼠,分析小鼠免疫血清对阳性噬菌体与HCVE2结合的阻断作用;以HCVE2蛋白包被酶标板,检测阳性噬菌体对HCVE2与人CD81分子结合的抑制作用。结果对十二肽库进行3轮筛选后,经ELISA和DNA测序,鉴定出3个(C4,C13和C16)阳性克隆,与人CD81无同源序列。阳性噬菌体克隆C16免疫小鼠血清能阻断该克隆与HCVE2的结合。C16克隆能以剂量依赖的方式竞争性抑制HCVE2蛋白与人CD81的结合。结论用人CD81单抗从噬菌体随机展示肽库中筛选出的阳性噬菌体克隆所编码的小肽在功能上能模拟人CD81与HCVE2的结合活性,能竞争性抑制HCVE2与人CD81分子的结合,在抗HCV药物及疫苗研究中具有潜在应用价值。     

Schistosoma japonicum: construction of phage display antibody library and its application in the immunodiagnosis of infection

Background A monoclonal antibody would be an effective tool for the detection of circulating antigens in the serum of patients with schistosomiasis, but the traditional way of producing monoclonal antibodies is not cost-effective. The objective of this study was to find a new method for the large-scale production of monoclonal antibodies against Schistosoma japonicum (Sj).Methods A phage display antibody library for Sj was constructed. To obtain a single-chain variable fragment antibody (scFv) against Sj, the library was screened with metabolic antigens from adult Sj worms (Sj-MAg) using enzyme-linked immunosorbent assay. The soluble scFvs selected were used to detect Sj antigens in the serum of acute and chronic schistosomiasis patients.Results Six positive clones with good reactivity to Sj-MAg were obtained from the phage display antibody library of about 1.07 x 106 individual clones. Only two of these six clones bound specifically to Sj-MAg and were chosen for further analysis. Specific soluble anti-Sj-MAg scFvs were produced by inducing the 2 clones with isopropyI-D-thiogalactopyranoside. The characteristics of the scFvs were then determined. The results of Western blot showed that these scFvs could bind to Sj-MAg specifically and had a molecular weight of about 31 kD. When testing serum from schistosomiasis patients with one of the two specific scFvs, its sensitivity was found to be 60% and 37% in acute and chronic patients, respectively, with a specificity of 90%. When the two specific scFvs were combined,their sensitivity was found to be 75% and 57% in acute and chronic patients, respectively, with a specificity of 85%.Conclusions The results indicate that the scFvs are potentially useful for the diagnosis of schistosomiasis. The library construction also provides a useful tool for the further screening of other antibodies for both diagnostic and immunotherapeutic applications and for epitope analysis and vaccine design.     

特异性抗SSA/Ro噬菌体抗体的制备及其基因序列分析

目的　由已构建的人源单链可变区噬菌体抗体库中制备出抗SSA/Ro单克隆抗体 ,并对这些抗体的基因序列进行分析。方法　将冻存的抗体库菌种复苏制备噬菌体抗体库。用PCR、基因序列分析及酶切的方法对其进行鉴定。以组织培养皿法对该噬菌体抗体库进行富集筛选 ,用ELISA方法对富集后次级抗体库进行鉴定。制备单克隆抗体并鉴定其特异性 ,对单克隆抗体的可变区基因序列进行测序分析。结果　所制备的噬菌体抗体库的滴度为 1 6× 10 12 cfu/ml,外源基因的插入重组率为 80 % ,插入片断为人抗体可变区基因 ,且该抗体库具有良好的多样性。富集筛选回收的噬菌体数逐渐增加 ,富集后的抗SSA/Ro噬菌体抗体次级库吸光度 (A)值为富集前的 2 8倍 ,且该次级库有良好的抗SSA/Ro特异性。经富集制备出 5个特异性抗SSA/Ro单克隆抗体 ,这些单克隆抗体重链及轻链可变区基因分别与VH1、VH3、VH4、Vκ1、Vκ2、Vκ3基因家族有高度同源性。结论　本实验室构建的scFv噬菌体抗体库可以用于特异性抗体的筛选及单克隆抗体的制备。制备出的抗SSA/Ro单克隆抗体可变区基因序列与人胚系基因比较有突变 ,为研究相关疾病的发病机理开创了新的途径     

十二肽库中与结缔组织生长因子特异结合噬菌体的筛选

目的:从随机十二肽库中筛选与结缔组织生长因子(CTGF)特异结合的噬菌体克隆。方法:用基因重组方法制备硫氧化还原蛋白(TrxA)以及硫氧化还原蛋白-结缔组织生长因子(TrxA-CTGF)融合蛋白;噬菌体肽库经TrxA预吸附后,与TrxA-CTGF结合,逐步增加选择压力,经过4轮亲和筛选后随机挑取10个克隆,提取单链DNA后测序;用直接和间接ELISA方法检测噬菌体阳性克隆与CTGF结合的特异性。结果:10个克隆中8个DNA序列完全一致(810A),另有2个有不同序列(810B,810C);3个阳性克隆用直接和间接ELISA试验证实能与CTGF发生特异性结合,与TrxA及阴性对照比较差异显著(P<0.05)。结论:成功获得与CTGF特异结合的噬菌体克隆,为CTGF小分子抑制剂的研究打下基础。     

从噬菌体随机肽库筛选庚型肝炎病毒E2抗原表位

目的：筛选能识别庚型肝炎病毒（ＨＧＶ） Ｅ２区的单克隆抗体和有竞争抑制活性的多肽。方法：利用抗ＨＧＶ Ｅ２区的３株单克隆抗体Ｍ６,Ｍ１３,Ｍ３０作为筛选配基,对构象限制性的随机环９肽库进行亲和筛选,并对阳性噬菌体克隆进行功能鉴定。结果：证实亲和筛选具有良好的富集效果后,随机挑出１６个噬菌体克隆进行交叉结合实验,有１４个克隆与Ｍ６抗体有较强的特异结合;其中１０个克隆在竞争抑制实验后中抑制率大于５０％