用PCR技术直接检测致病真菌的实验研究

目的　建立和评价从血标本中直接PCR检测病原真菌的方法。方法　用红、白细胞裂解液 ,基因释放剂等直接处理血标本 ,提取微量的靶DNA ,然后用真菌通用引物及种特异性引物进行PCR扩增。结果　在几种重要致病真菌制备的人血标本中检测出靶DNA ,其敏感性达 10个孢子 /ml以下 ,且从标本处理到报告结果仅需 6h。结论　用PCR方法可简便快速特异敏感地从血标本中直接检测病原真菌 ,提示可为临床快速诊断深部真菌病打下基础。     

用复合PCR检测炭疽芽孢的研究

目的 建立同时检测炭疽芽孢杆菌两具毒力相关质粒基因的复合PCR技术，并用于模拟污染土壤中炭疽芽孢的检测。方法 根据炭疽芽孢杆菌两个毒力相关质粒pX01和pX02上的水肿因子和荚膜基因设计引物，并探讨建立复合PCR同时扩增这两种基因的方法。评价其特异性和敏感性，并将炭疽芽孢杆菌疫苗株A16.R的芽孢加入土壤制备污染土壤，用复合PCR检测其中的芽孢，评价该方法的实用性。结果 我们发现在影响复合PCR的条件中，不同引物的比例与浓度条件最为关键；复合PCR检测的敏感性比单一基因PCR检测敏感性低10倍。用复合和单一PCR检测土壤中的炭疽芽孢表明，二者都能检测出0.25g土壤中的10^3个芽孢。结论 我们建立的复合PCR能够特异敏感的检测土壤中的炭疽芽孢。     

白念球菌DNA探针的制备

应用聚合酶链反应扩增白念珠菌标准株的EO3基因片段,扩增产物125bpDNA用半抗原地高辛标记,制备成探针,该探针显色敏感度达0．01pg,与热带念珠菌、近平滑念珠菌、临床分离的白念珠菌及大肠杆菌、痢疾杆菌、肠球菌等细菌进行斑点杂交试验,结果表明EO3125bpDNA探针仅与白念珠菌杂交,具有高度特异性。     

应用PCR-反向斑点杂交法快速检测和鉴定医学重要真菌

目的　建立一种以PCR为基础的的检测和鉴定医学重要真菌的方法。方法　将白念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、季也蒙念珠菌、都柏林念珠菌和新型隐球菌的种特异性探针加尾后固定于硝酸纤维素膜上 ;用标记生物素的真菌通用引物扩增经提取的各真菌DNA ,与固定在膜上的探针杂交。结果　所用的真菌通用引物可扩增12种临床常见的真菌DNA ,扩增片段长度在 35 0bp左右。 8种特异性探针分别与上述真菌PCR扩增产物杂交 ,结果表明 8种探针具有高度的特异性。通过 39例临床标本和 2 5例临床分离菌株的检测 ,PCR -反向杂交法与真菌培养法的结果基本一致 ,且鉴定时间也由传统培养鉴定方法约需 1周的时间缩短至 2天。结论　该方法可快速、正确地将 8种临床常见真菌鉴定到种水平 ,如经大量临床标本的检测验证 ,可望在临床微生物实验室开展。     

南海海域真菌检测

无菌采集海水,经真菌增菌、真菌培养、分纯后进行鉴定和药敏实验.结果 :从南海海域分离出的真菌38株,以胶红酵母菌分离率最高,其次是无名假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌;在真菌药敏实验中,以两性霉素B敏感性最好,没有发现耐药株.认为南海海域真菌种类广泛,此项调查对于该海域真菌感染的防治有重要意义.     

聚合酶链反应检测病原真菌及新生隐球菌的实验研究

目的使临床系统性真菌病的诊断提高到分子水平。方法首先应用一对外侧的基于ｒＤＮＡ的真菌通用引物进行ＰＣＲ扩增，此后应用新生隐球菌种特异性内侧引物对首轮扩增产物进行第二轮扩增鉴定。结果应用外侧引物对能对代表８属１７种的２５株医学重要真菌进行扩增，而对所有细菌和人ＤＮＡ均为扩增阴性，内侧引物对仅对新生隐球菌获得扩增。应用两轮ＰＣＲ扩增（通用ＰＣＲ和随后的种特异性ＰＣＲ）方法从获得临床标本到鉴定病原菌仅需８小时。结论这种依据ＰＣＲ的检测和鉴定系统为临床快速诊断系统性真菌病提供了一种全新的实验方法并可望应用于临床     

复合探讨PCR定量检测HBV方法的建立及临床应用

我们采用复合探针技术,设计、建立的实时、荧光定量检测ＨＢＶ ＤＮＡ的方祛,对实验条件进行了优化,并对临床提供的２０２份血清标本进行ＨＢＶ ＤＮＡ检测,与ＥＬＩＳＡ方法结果进行比较。 一、资料与方祛 １ 资料：２０２份血清标本由重庆医科大学附属第一医院提供;ＨＢＶ标准质粒由军事医学科学院放射研究所配制,定量;仪器为ｉＣｙｃｌｅｒ自动荧光ＰＣＲ仪（美国ＢＩＯ－ＲＡＤ公司生产）;ＨＢＶ ＥＬＩＳＡ试剂盒由上海科华实业有限公司提供;特异性引物的设计和合成为根据Ｐｒｉｍｅｒ３软件,自行设计并合成了以下引物序列：…     

目视化常见角膜致病真菌基因芯片的构建

目的制备目视化常见角膜致病真菌基因芯片。方法将6属12种角膜致病真菌设计合成特异性寡核苷酸探针加尾后，固定于带正电荷尼龙膜的相应区域，用生物素标记的通用引物对12株标准菌株和82株临床分离株进行PCR扩增，将扩增产物与固定有寡核苷酸探针的尼龙膜进行反向斑点杂交，观测相应区域的斑点显色情况。结果12种真菌均产生了530～630 bp的PCR扩增产物，得到了具有各自特征的杂交后生物素-亲和素斑点显色图谱，可直接从该图谱上判断不同菌种。对82株临床分离株的检测敏感率为84．1％，未出现非特异性交叉反应。结论利用PCR结合反向斑点杂交技术制备目视化基因芯片，能够在3～4h完成对我国临床上常见的12种角膜致病真菌的菌种鉴定，特异性及敏感性较高。     

碘伏对真菌性角膜溃疡常见分离真菌的体外抗菌活性

观察不同浓度碘伏对真菌性角膜溃疡常见分离真菌的体外抗菌活性,取100%的生长抑制为最低抑菌浓度（MIC）,质控菌株采用近平滑念珠菌。结果显示碘伏对白色念珠菌、烟曲霉菌、串珠镰刀菌的MIC（90）均为0.125mg/ml,茄病镰刀菌的MIC_（90）为0.25mg/ml。认为碘伏对真菌性角膜溃疡常见分离真菌有明显的体外抗菌活性,其眼用剂型的开发对临床上真菌性角膜溃疡的治疗具有重要价值。     

PCR和实时荧光PCR法检测华支睾吸虫的比较研究

目的 利用PCR技术建立快速、灵敏、特异的检测华支睾吸虫的方法,并比较PCR和实时荧光PCR检测华支睾吸虫的灵敏性和特异性,探讨其在华支睾吸虫检测中的应用价值.方法 根据华支睾吸虫的特异性基因序列,设计了PCR引物及实时荧光PCR的特异性引物和探针,分别进行灵敏性和特异性实验.结果 设计的引物能够扩增华支睾吸虫DNA,而且探针的特异性很高.实时荧光PCR对华支睾吸虫的检测阈值为3 fg/μl,灵敏度比PCR高两个数量级.结论 PCR和实时荧光PCR检测华支睾吸虫的灵敏性和特异性均很高,操作简便,为华支睾吸虫的检测提供了有效的技术手段和方法.     

甘露糖在介导二相性白念珠菌粘附中的重要作用

目的研究甘露糖介导的二相性白念珠菌对人口腔颊粘膜细胞的粘附作用。方法分别将孢子相、菌丝相白念珠菌与人口腔颊粘膜细胞进行粘附试验,并用刀豆蛋白A(ConA)作为甘露糖的特异性结合剂,预处理二相性白念珠菌后再进行粘附试验,比较二相性白念珠菌的粘附率;通过气相色谱法测定二相性白念珠菌细胞壁的甘露糖含量,比较二相性白念珠菌细胞壁的甘露糖含量。结果菌丝相白念珠菌对口腔颊粘膜细胞的粘附率显著高于孢子相;用ConA分别预处理菌丝相及孢子相白念珠菌后,再重复进行粘附试验,分别与前述未经ConA处理的粘附率比较,粘附率显著降低。气相色谱法测定孢子相、菌丝相白念珠菌(106cells)细胞壁甘露糖的含量分别为33±2.11μg、151±9.96μg。结论白念珠菌细胞壁上的甘露糖是介导二相性白念珠菌与人口腔颊粘膜细胞粘附的重要物质,且菌丝相白念珠菌细胞壁上的甘露糖含量明显高于孢子相,菌丝相白念珠菌对人口腔颊粘膜细胞的粘附作用强于孢子相。     

白念珠菌的生物形态分型研究

本文报道了首先建立的白念珠菌（白念）的生物形态分型法－型别由５个数字组成的编码表示。１７５株临床分离的白念被分为８５个型,以编码００００２为最常见（占７．４％）,分辨指数为０．９８２。并分析了型别与临床的关系,初步表明菌落条纹与毒力可能有一定关系。该法具有简单、经济、重复性好和分辨率高等优点,适于病原学研究和流行病学调查。     

鹦鹉热衣原体套式PCR和DNA测序方法研究

目的　建立特异、灵敏、快速的鹦鹉热衣原体 (Cps)分子生物学检测方法。 方法　采用套式PCR扩增检测和DNA测序方法 ,并进行实验室评价。结果　 4株Cps均能被套式PCR扩增出 2 14bp目的条带 ,而沙眼衣原体、肺炎衣原体、肺炎支原体等其它微生物均不能检出 ;Cps套式PCR灵敏度高于CpsPCR ;模拟样本均能被检出。Cps(CS株 )套式PCR产物直接测序与Cps典型株序列完全一致。结论　套式PCR是检测Cps特异、灵敏 ,且快速的分子生物学检测方法     

多引物嵌套式聚合酶链反应在艾滋病病毒感染诊断中的应用

目的 评价多引物嵌套式聚合酶链反应(Nested-PCR)在艾滋病病毒(HIV)感染诊断中的应用。方法 采用柱离心式小量组织/细胞基因组脱氧核糖核酸(DNA)抽提试剂盒提取DNA。用3套分别来自于长末湍重复序列(LTR)-gag、pol、env不同区域的序列引物进行嵌套式PCR扩增。结果 用多引物嵌套式PCR对28例不同来源标本进行检测,其中13例为HIV感染者,4例为HIV可疑感染者,4例为人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)感染者且HIV抗体检测为阴性,7例为正常者。经过检测每一套引物均漏检了1份标本,即每一套引物敏感性均为92.3％。HTLV标本经检测均为HIV阴性。根据判断标准,该检测方法敏感性和特异性均达到100％,最低检测线达到103外周血单核细胞(PBMC)。结论 多引物嵌套式PCR具有高敏感性及特异性,在鉴定HTV感染方面有重要的意义.可作为蛋白印迹试验的补充和辅助诊断。     

单核细胞增生性李斯特菌PCR快速检测方法建立及应用

目的　通过扩增hly基因PCR法建立快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌 (Lm )方法。 方法 :用PCR法扩增hly基因来检测标准菌株及临床分离的Lm的纯培养物和模拟污染的生猪肉、水和牛奶 ,并应用于实际食品检验工作中进行验证。结果　 34株Lm的PCR结果呈阳性 ,而其它李斯特菌 ,包括英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌、西尔李斯特菌、威儿李斯特菌和格氏李斯特菌以及非李斯特菌均未出现特异性的片段。表明所扩增的hly基因 3’末段 82 7bp的DNA片段对Lm具有较高的特异性。PCR法对Lm纯培养物的检测限达 10 5CFU/ml,对模拟污染生猪肉、水和牛奶的 30℃ 16h改良LEB增菌培养液用PCR法检测 ,结果检测限达 10CFU/ 2 5 g(ml)。进一步研究表明该PCR扩增体系能检测出 6 .5pg的LmDNA ,整个检测过程只需 2 4h。采用该法对扬州市区 16 9份食品样品检测 ,8份样品Lm呈阳性且结果与传统的生化鉴定方法完全一致。结论　扩增hly基因的PCR法对Lm的鉴定具有特异性强、灵敏度高、速度快和易操作等优点 ,可用于食品的Lm的分离     

基于PCR的金葡菌准确检测方法的建立及应用

目的建立基于PCR的金葡菌准确检测方法。方法选择nuc基因的一段保守序列并设计引物。采用PCR扩增技术对117株金葡菌的nuc保守区域进行扩增,然后采用焦磷酸测序对PCR产物进行特异性检测。同时采用传统细菌分离培养法和PCR扩增nuc基因法对16份生鸡肉样品进行金葡菌检测。结果建立的检测方法可准确鉴定117株金葡菌,准确率100%。在16份生鸡肉样品检测中,PCR法检出6份金葡菌阳性样品,阳性率为37.5%;传统细菌分离培养法检出5份阳性样品,阳性率为31.3%。结论建立的基于PCR的检测方法灵敏度高、稳定性好、特异性强,可适用于金葡菌的准确检测。     

Severe Asthma with Fungal Sensitization: A Case Report and Review of Literature

There is a substantial body of evidence supporting an association between asthma severity and fungal exposure and sensitization. Fungal allergens are a recognized risk factor for severe asthma. We describe the case of a 44-year-old asthmatic whose asthma control deteriorated after moving to a new flat with walls covered in mould. Allergic bronchopulmonary aspergillosis was excluded. Although sensitization to Candida was demonstrated by a positive Candida-specific radioallergosorbent test, the patient did not entirely satisfy the criteria for a diagnosis of allergic bronchopulmonary candidiasis. The patient's asthma control improved after engaging in a monthly washing regimen of the walls. This case further demonstrates the association between fungal sensitization and asthma severity. The term severe asthma with fungal sensitization has been recently coined to describe this phenomenon.     

肉鸡白念珠菌病常用实验诊断方法比较研究

目的 探究肉鸡白色念珠菌病简便快速诊断方法。方法 对50例来自不同鸡场的临床疑似样本分别采用KOH镜检法、改良KOH镜检法、分离纯化与形态观察法、TTC显色培养法、组织切片法和巢式PCR法进行试验。结果 上述方法的样本检测阳性率分别为62.0%(31/50)、78.0%(39/50)、82.0%(41/50)、82.0%(41/50)、86%(43/50)和88.0%(44/50),耗时分别为1~2 h、1~2 h、7~8 d、6~7 d、8~10 d和7~8 h。结论 通过比较各种常用方法的优缺点,建议采用巢式PCR法与改良KOH镜检法相结合作为肉鸡白念珠菌病简便快速诊断的优选方案,其特异性强,敏感度高,耗时少,并兼顾病原侵染状态的直观性。