替普瑞酮对香烟提取物引起的气道平滑肌细胞凋亡中p-JNK表达的影响

目的:探讨替普瑞酮(GGA)诱导的热休克蛋白70(HSP70)在香烟提取物(CSE)引起的气道平滑肌细胞(ASMCs)凋亡中对C-Jun N-terminal激酶(JNKs)的影响。方法:在体外培养Wistar大鼠的气道平滑肌细胞中,给予GGA处理前后,给予CSE刺激3 h。用流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡情况,Western blot的方法检测HSP70和p-JNK的表达。结果:CSE诱导ASMCs凋亡随CSE浓度的增加而逐渐增加,两者相比有显著性差异(P<0.05);GGA预处理后再加入不同浓度的CSE处理的气道平滑肌细胞的凋亡较单纯CSE组相比有显著性差异(P<0.05)。在给予CSE刺激后,各组中的HSP70的表达较对照组有明显的降低,而且随CSE浓度越高降低越明显(P<0.05);p-JNK的表达随CSE浓度的增高而增多(P<0.05)。GGA预处理后的各组细胞的HSP70的表达与对照组比较有明显的增多(P<0.05)。在给予GGA预处理后,再加入CSE处理的气道平滑肌细胞中,与对照组比较HSP70的表达有所降低但无显著差异,p-JNK的表达在GGA+CSE组中的表达较单纯CSE组中有所下降(P<0.05)。结论:较高浓度的CSE能引起气道平滑肌细胞的凋亡并且伴随p-JNK的表达的增多。GGA处理气道平滑肌细胞后引起HSP70表达的增加,并且抑制较高浓度CSE所致的平滑肌细胞的凋亡,这可能与HSP70下调p-JNK的活性有关。     

甲基强的松龙对香烟烟雾提取物诱导A549细胞I-κBα的影响

目的:观察香烟烟雾提取(CSE)诱导人类肺泡Ⅱ型上皮细胞A549后I-κBα的变化及甲基强的松龙(Mp)对其的影响.方法:体外培养A549细胞系,根据条件不同将其分为3组:(1)对照组:无血清DMEM处理.(2)CSE组:10%浓度CSE处理 .(3)CSE+Mp组:CSE刺激后加入0.015%甲基强的松龙处理.于不同时间段收集各组细胞裂解物后,应用免疫印迹法(Western blot)、酶联免疫法(ELISA)观察I-κBα的变化.结果: 对照组无变化,CSE组I-κBα从处理后15 min开始后减少,30 min后消失,CSE+Mp组I-κBα在15～30 min内始终有本底表达,3组间I-κBα蛋白的表达水平差异有统计学意义(P＜0.01).结论:甲基强的松龙能使CSE刺激后A549细胞I-κBα蛋白表达增加.     

外周血单个核细胞向平滑肌祖细胞分化的体外培养

目的 探讨外周血单个核细胞向平滑肌祖细胞分化的培养方法. 方法 分离人外周血单个核细胞,接种于加有牛垂体提取物的M-199培养基中,第8 天予以血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)刺激促进细胞分化,刺激15 d后运用RT-PCR、免疫荧光法和Western blot检测平滑肌细胞特异性α-辅肌动蛋白(α-SMA)、平滑肌肌球蛋白重链(SM MHC)、调宁蛋白(Calponin)、CD34、Tie-2 和Flk-1的表达, 并以流式细胞技术检测培养细胞α-SMA阳性表达率,对培养细胞进行鉴定. 结果 在PDGF-BB刺激培养15 d后细胞表达平滑肌细胞的标记α-SMA、SM MHC和Calponin,同时表达干细胞的标记CD34,并发现其Flk-1阳性表达,Tie-2阴性表达.PDGF-BB刺激后细胞α-SMA阳性表达率为 (90.57±5.63)%,与阴性对照细胞之间有统计学差异(P＜0.05). 结论 外周血单个核细胞分离后第8天,使用PDGF-BB刺激可使其向平滑肌前体细胞分化,提出了一种新的外周血单个核细胞向平滑肌细胞分化的培养方法.     

反义寡核苷酸对脑胶质瘤细胞生长抑制作用的动态研究

目的　探讨原癌基因 c- m yb反义寡核苷酸 (AON)对 C6脑胶质瘤细胞的体内生长抑制作用。方法　将 C6脑胶质瘤细胞接种于裸鼠皮下 ,当肿瘤长至 10 mm左右时随机分成 3组 (每组 12只 ) ,分别用 c- mybAON、正义寡核苷酸 (SON)和生理盐水瘤区原位注射 ,注药后 4、8、12和 16日各组处死动物 3只 ,动态观察肿瘤的体积、重量及病理学改变 ;用流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡 ;以免疫组化方法分析各组的 c- m yb、bcl- 2蛋白阳性表达率。结果　 c- myb AON组的肿瘤体积抑制率分别为第 4天 6 6 .7% ,第 8天 71.4% ,第 12天 72 % ,第 16天73% ,与对照组相比 ,其生长抑制作用具有显著性 (P<0 .0 5 ) ;AON组凋亡细胞百分率为第 4天 3.4% ,第 8天 2 7.1% ,第 12天 46 .1% ,第 16天 48.4% ,是 SON组和对照组相应时段凋亡细胞的 3.5倍以上 (P<0 .0 5 ) ;AON组 c-myb和 bcl- 2蛋白阳性表达率较对照组有显著降低 (P<0 .0 5 ) ;且 AON治疗后的脑胶质瘤中见较多炎性细胞浸润和钙化灶。结论　 c- myb癌基因有可能成为反义基因治疗恶性脑胶质瘤的优选靶点之一     

细胞表面分子在骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中的表达

目的研究成人骨髓间充质干细胞(MSCs)在诱导条件下定向分化为成骨细胞过程中,细胞表面分子的表达及变化特征。方法从人骨髓中分离有核细胞,在含有15%胎牛血清、维生素C和β-甘油磷酸钠的α-MEM培养基中培养。在培养早期加入10-8mol/L地塞米松(实验组)或保持基础培养状态(对照组1),同时部分细胞仅培养于α-MEM培养基中(对照组2)。于培养第7、12、17天分别收集实验组和各对照组细胞,用流式细胞方法观察细胞表面分子CD45、CD34、CD117、CD90和人白细胞抗原-DR(HLA-DR)的表达,并定量对比分析。结果成人骨髓MSCs在体外诱导条件下分化为具有成骨细胞特征的成熟细胞。培养第7天实验组、对照组1和对照组2均少量表达CD45,第12、17天CD45表达转为阴性。各组各时间点CD34、CD117表达均为阴性。培养第12天,实验组和各对照组细胞CD90表达均较第7天升高,以对照组升高明显。实验组细胞HLA-DR表达随着成骨细胞分化成熟逐渐上升,而对照组细胞HLA-DR表达下降。结论MSCs在诱导条件下可以向成骨细胞分化。细胞表面分子的表达在细胞分化过程中呈特征性改变,是成骨细胞分化早期的一个重要标志。     

香烟烟雾提取物诱导呼吸道上皮细胞间质性转化的实验研究

目的 探讨香烟烟雾提取物(CSE)在呼吸道上皮细胞间质性转化(EMT)中的作用,为进一步研究香烟烟雾提取物在慢性阻塞性肺疾病(COPD)气道重构发生机制提供新的线索.方法 用不同浓度(0％、0.5％、1.0％、2.5％、5.0％,其中浓度0作为对照组)的CSE刺激呼吸道上皮细胞BEAS-2B 72 h,逆转录PCR检测E钙粘蛋白(E-cad)、N钙粘蛋白(N-cad) mRNA表达情况,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清液中TGF-β1浓度;用2.5％CSE刺激BEAS-2B细胞不同时长(0、12、24、48h,其中时间0h作为对照),倒置显微镜下观察细胞形态变化,逆转录PCR检测E-cad、N-cad、补体C3 mRNA表达情况,ELISA法检测细胞培养上清液中TGF-β1、过敏毒素C3a浓度.结果 在不同浓度的CSE刺激BEAS-2B细胞72 h后,CSE各浓度刺激组较对照组E-cad mRNA表达下调,N-cad mRNA表达增加,且呈浓度依赖性(P＜0.05);ELISA法检测细胞培养上清液中TGF-β1水平,CSE各浓度刺激组较对照组增加(P＜0.05);2.5％CSE在不同时间点作用BEAS-2B细胞,刺激组细胞呈梭形改变,CSE各时间段刺激组较对照组E-cad mRNA表达减少,补体C3、N-cad mRNA袁这增加,且呈时间依赖性(P＜0.05),CSE各时间段刺激组细胞培养上清波中TGF-β1、C3a水平较对照组增加(P＜0.05).结论 CSE可诱导正常的呼吸道上皮细胞BEAS-2B发生EMT,补体C3激活可能参与此过程.     

5-氟尿嘧啶腹腔内缓释化疗对H22腹水瘤小鼠的抑瘤疗效观察

目的:观察5-氟尿嘧啶(5-FU)腹腔内缓释化疗对H22腹水瘤小鼠的抑瘤作用.方法:昆明种实验小鼠腹腔内注射0.2 ml H22腹水瘤细胞悬液(含癌细胞4×106)制备腹水瘤小鼠模型.成模小鼠分为生理盐水对照组、腹腔化疗组、缓释化疗组和缓释对照组4组,分别给予腹腔注射生理盐水、普通5-FU、5-FU缓释剂以及缓释对照品.观察各组小鼠的生存期;流式细胞仪测定腹腔注射后第9、12天各组小鼠腹水瘤细胞的凋亡率,计算增殖指数;腹腔注射后第12天电镜观察各组腹水瘤细胞涂片.结果:腹腔化疗组小鼠平均生存期低于缓释化疗组[(13.7±1.7) d vs (15.3±2.0) d, P＜0.05],但均明显高于生理盐水对照组和缓释对照组(P＜0.05),而后两者无显著差异.实验第9天,腹腔化疗组小鼠腹水瘤细胞的凋亡率(%)明显高于缓释化疗组(16.5±1.7 vs 8.1±0.9,P＜0.05),而第12天缓释化疗组明显高于腹腔化疗组(10.1±1.3 vs 7.6±0.8,P＜0.05).实验第9、12天,腹腔化疗组和缓释化疗组瘤细胞凋亡率均明显高于生理盐水对照组和缓释对照组(P＜0.05),后两者无显著差异.电镜观察结果显示腹腔化疗组和缓释化疗组腹水瘤细胞呈典型的凋亡形态学变化,而对照组瘤细胞形态无明显变化.结论:5-FU腹腔缓释化疗较腹腔化疗延长了荷瘤小鼠的生存期,对腹腔内肿瘤细胞的抑制作用较持久.     

新生大鼠原代心房肌细胞钙超载模型的建立

目的 探讨建立新生大鼠原代心房肌细胞钙超载模型的方法 .方法 用消化法分离新生大鼠心房肌细胞并进行原代培养.纯化后随机分为对照组(C组)、实验组(E1、E2、E3组),依次加入不同浓度(0.5、1.0、2.0 μmol/L)伊屋诺霉素(ionomycin),以钙离子指示剂Fluo-3/AM负载心房肌细胞,激光扫描共聚焦显微镜检测心房肌细胞游离钙离子浓度([Ca2+]i),建立新生大鼠心房肌细胞不同程度钙超载模型.结果 (1)培养至第4天,细胞生长密度可以达到瓶底70%左右;免疫组织化学染色鉴定:90%以上培养细胞α-肌动蛋白抗体染色呈阳性;(2)对照组心房肌细胞活性率为(73.00±2.37)%,与各实验组心房肌细胞活性率比较,差异无统计学意义(P>0.05);(3)经不同浓度ionomycin处理l h后,各实验组心房肌细胞[Ca2+]i明显增高,与对照组比较,差异有统计学意义(431.54±20.97、705.87±28.34、1 305.05±53.69 vs 257.08±18.63,P<0.05),且各实验组间心房肌细胞[Ca2+]i水平随ionomycin浓度的增加而上升,实验组间比较,差异有统计学意义(P<0.05).光镜下形态学观察表明,随ionomycin浓度的增加,荧光强度逐渐加强,呈浓度依赖性.结论 应用钙离子载体ionomycin能够建立可靠的心房肌细胞钙超载模型.     

Effect of chronic electrical stimulation on transformation of myosin heavy chain isoforms in differentiated C2C12cells

目的 研究钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN)在低频复合生理频率慢性电刺激(chronic electrical stimulation with lower physiological frequency,CESLPF)对骨骼肌细胞肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MHC)亚型表达的影响.方法 以体外2％马血清诱导小鼠成肌母细胞C2C12成肌分化为模型.实验分3组:对照组、CsA组和KN93组.对照组为正常分化的细胞;CsA组和KN93组在细胞诱导分化3d后,分别用CaN抑制剂环孢菌素A(CsA,8μmol)、Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶(CaMK)抑制剂KN93(6μmol)单一或联合CESLPF(10 +40 Hz,1.5 h/d,共2d)处理.通过RT-PCR、Western blot检测观察成肌分化过程中肌球蛋白重链亚型的表达水平及其转换情况,采用比色法检测CaN的活性.结果 在成功构建的体外成肌分化模型上发现,CsA和KN93能够抑制C2C12细胞MHC Ⅰ的mRNA及蛋白的表达.与分化对照组MHC Ⅰ mRNA相对表达量(0.79 ±0.04)相比,CsA组(0.62±0.03)和KN93组(0.69±0.05)能够抑制C2C12细胞MHC Ⅰ型纤维的表达(与对照组比P＜0.05);对照组、CsA和KN93处理组MHC Ⅰ蛋白相对水平分别是(0.91±0.05)、(0.36±0.01)和(0.66±0.02).对照组MHCⅡb相对表达量为(0.53±0.01),CsA(0.63±0.02)和KN93 (0.75±0.03)促进MHCⅡb型纤维的表达(与对照组比较,P＜0.05);CESLPF能够逆转上述改变(与对照组比较,P＞0.05).CsA能够抑制CaN的活性表达;CESLPF能够显著提高CaN活性(P＜0.05),但仍显著低于正常水平(P＜0.05).结论 CaN和CaMK是骨骼肌细胞MHCⅡ型向MHC Ⅰ型转变的重要调控酶,CESLPF可能是经CaN通路和非CaN通路联合作用促进肌型转换,该结果为临床应用CESLPF治疗OSAS提供了实验依据.     

Dectin-1受体、白细胞介素-17及白细胞介素-12在小鼠巨噬细胞活化后真菌性角膜炎中的表达

目的 检测小鼠活化巨噬细胞真菌性角膜炎中的人树突状细胞源性C型凝集素样受体-1(Dectin-1)受体、白细胞介素-17(IL-17)及白细胞介素-12(IL-12)的表达水平. 方法 分别向小鼠角膜创口内注入乳胶微粒液或PBS液构成实验组与对照组.于感染后第1,3,5,7,9d,裂隙灯显微镜下观测各组小鼠真菌性角膜炎特点,H-E染色观测其病理特征;通过Realtime-PCR检测小鼠角膜中Dectin-1受体、IL-17及IL-12基因mRNA的表达.结果 (1)实验组角膜浸润混浊,于第7天多发穿孔,未发现新生血管;对照组角膜混浊,于第5天广泛分布新生血管,未发现穿孔.(2)实验组角膜大量炎症细胞汇集,第5天基质细胞排列紊乱,破坏严重.(3) Realtime-PCR结果表明感染后第3,5,7,9d,实验组Dectin-1受体、IL-17、IL-12基因mRNA的表达量显著高于对照组(P＜0.05).结论 Dectin-1受体、Th1及Th17细胞免疫可能在角膜抵御真菌感染的机制中发挥重要作用.