利用pcDNA3．1／TOPOC TA克隆构建ANNEXIN A2基因的真核表达载体

目的克隆人类ANNEXIN A2基因，构建其正义真核表达质粒。方法采用逆转录聚合酶链式反应技术，从人类正常肺组织中扩增出人类ANNEXIN A2基因的完整编码区全长序列。通过DNA重组技术将该基因重组于pcDNA3．1／TOPO TA真核表达载体上，构建出人类ANNEXIN A2基因正义表达质粒。通过DNA测序方法对重组表达质粒进行鉴定。结果通过测序分析证实，构建的重组表达质粒目的基因片段为人类ANNEXIN A2基因的完整编码区1032bp。结论构建真核表达载体的方法快速简便．适于进一步研究基因的细胞生物学作用。     

利用pcDNA3.1/TOPO(R)TA克隆构建ANNEXIN A2基因的真核表达载体

目的克隆人类ANNEXIN A2基因,构建其正义真核表达质粒.方法采用逆转录聚合酶链式反应技术,从人类正常肺组织中扩增出人类ANNEXIN A2基因的完整编码区全长序列,通过DNA重组技术将该基因重组于pcDNA3.1/TOPO(R)TA真核表达载体上,构建出人类ANNEXINA2基因正义表达质粒.通过DNA测序方法对重组表达质粒进行鉴定.结果通过测序分析证实,构建的重组表达质粒目的基因片段为人类ANNEXINA2基因的完整编码区1 032 bp.结论构建真核表达载体的方法快速简便,适于进一步研究基因的细胞生物学作用.     

IL-37b基因克隆及其真核的表达载体构建

目的 克隆IL-37b编码区基因,并构建其真核表达载体.方法 通过RT-PCR扩增IL-37b编码区基因,DNA测序鉴定后,将阳性克隆提取质粒,通过酶切连接将目的片段定向克隆至真核表达载体pcDNA 3.1,通过菌落PCR和DNA测序等进行鉴定.结果 凝胶电泳显示RT-PCR扩增出1条大小约650 bp特异条带,DNA测序结果显示获取了大小为654 bp的IL-37b编码区基因.PCR和DNA测序对所构建的真核表达载体鉴定结果表明IL-37b编码区基因正确插入真核表达载体pcDNA3.1.结论 成功克隆了IL-37b编码区基因,并成功构建其真核表达载体,为下一步IL-37b生物学作用的深入研究奠定了基础.     

人CCR7基因真核表达载体构建及表达

目的构建人CCR7基因真核表达质粒,使其在真核细胞中稳定表达,为其临床应用奠定基础。方法以RT—PCR法从临床肺腺癌标本中扩增出CCR7编码区序列,定向克隆至载体pEGFP—N1中构建质粒pEGFP—CCR7,采用脂质体介导的基因转染技术将重组质粒DNA导人肺腺癌A549细胞中,加入G418对细胞进行筛选获得稳定表达CCR7的细胞,并用流式细胞仪对重组质粒的表达进行鉴定。结果PCR、酶切及测序结果证明重组质粒pEGFP—CCR7构建正确,荧光显微镜及流式细胞术在稳定转染A549细胞中检测到人CCR7的表达。结论人CCR7基因真核表达质粒已成功构建并稳定转染肺癌A549细胞株;本研究为临床应用提供了实验依据。     

染色体脆性位点抑癌基因FHIT真核表达质粒的构建

目的构建人染色体脆性位点抑癌基因FHIT真核表达质粒。方法以通过全基因合成的FHIT cDNA为模版,用PCR技术扩增,扩增片段用BamHI/Xho I双酶切后克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,用DNA测序法鉴定重组质粒。结果质粒DNA测序显示与文献报道的人FHIT cDNA序列一致。结论成功构建出含人FHIT基因的真核表达质粒。     

家兔C型利钠肽基因的克隆及鉴定

目的克隆家兔C型利钠肽基因,为其真核表达载体的构建奠定基础。方法通过RT-PCR从家兔腹主动脉组织中克隆C型利钠肽基因全长编码区,将该DNA片段亚克隆至克隆载体pMD18-T中,用Pst Ⅰ单酶切筛选出负向插入片段,对重组质粒进行鉴定。结果PCR、酶切及测序鉴定证实,家兔C型利钠肽基因全长编码区被准确插入到载体pMD18-T的TA克隆位点中。结论成功克隆家兔c型利钠肽基因,为其真核表达载体的构建及开展糖尿病足C型利钠肽基因治疗奠定了基础。     

人肥大细胞类糜蛋白酶分泌型真核表达载体的构建

目的构建人肥大细胞类糜蛋白酶（MC—Chy）分泌型真核表达载体。方法以MC-Chy基因的质粒pDEST17／CMA为模板,通过PCR扩增出融合有免疫球蛋白K链信号肽的人MC—Chy基因,定向克隆至真核表达载体pcDNA3．1,通过PCR、酶切和DNA测序鉴定。结果PCR扩增出免疫球蛋白K链融合人MC-Chy基因,DNA序列测定结果显示目的基因片段正确插入真核表达载体pcDNA3．1。结论成功构建了人MC-Chy分泌型真核表达载体,为下一步重组类糜蛋白酶的制备及其功能的深入研究奠定了基础。     

杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因真核表达重组质粒构建

目的 构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白（amastin）编码基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。方法 提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增,将扩增出的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒载体pcDNA3.1（＋）,构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。结果 扩增出大小约550bp的无鞭毛体蛋白基因;重组质粒pcDNA3.1-amastin经鉴定正确。结论 成功构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。     

APP基因真核表达载体的构建及其在SH-SY5Y细胞中的稳定表达

目的 构建淀粉样前体蛋白(APP)基因真核表达载体,转染SH-SY5Y细胞,建立稳定转染细胞系.方法 从质粒pcDNAs-APP中经PCR扩增出APP基因,利用DNA重组技术将其插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,经酶切和测序鉴定后,脂质体转染法转染SH-SY5Y细胞,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞系,通过印迹法(Western blot)检测APP的表达. 结果 pcDNA3.1(+)-APP重组体经PCR扩增后片段大小约为2 300 bp,与预期相同.测序结果与目的序列相同,重组体载体构建成功.Western印迹检测到SH-SY5Y细胞中APP的表达. 结论 成功构建pcDNA3.1(+)-APP真核表达载体并稳定转染SH-SY5Y细胞,成功表达了目的基因,为进一步研究阿尔茨海默病分子学机制奠定了基础.     

MAGE-3目的基因真核表达载体的构建

目的构建黑色素瘤抗原-3（MAGE-3）目的基因真核重组表达载体pcDNA3.1-MAGE-3.方法用RT-PCR法从肝癌组织制备含BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ酶切位点的MAGE-3目的基因,采用DNA重组技术将目的基因克隆至pGEM-T Easy载体和亚克隆至pcDNA3.1载体上,根据氨苄青霉素（Amp）抗性、蓝白筛选实验、引物扩增等方法筛选、鉴定阳性克隆,并对其中的插入序列MAGE-3目的基因进行DNA测序.结果扩增出MAGE-3目的基因;重组质粒pcDNA3.1-MAGE-3中的插入片段经DNA测序后与GenBank中MAGE-3相应序列比较,结果完全一致.结论成功构建了真核重组表达载体pcDNA3.1-MAGE-3,为肿瘤免疫治疗提供了条件.     

多房棘球绦虫elp基因在真核细胞COS7中的表达

目的　构建中国四川株多房棘球绦虫 elp基因真核表达载体 ,为核酸疫苗研究奠定基础。　方法　应用 RT-PCR方法从多房棘球绦虫续绦期幼虫 RNA获得 elp基因的编码序列 ,定向克隆于 p GEM- 11zf( +)。经酶切鉴定及测序后将目的基因亚克隆于真核表达载体 pc DNA3.1( +)。重组真核表达载体 pc D- EL P鉴定后 ,纯化无内毒素的重组质粒 ,电穿孔方法转染哺乳动物细胞 COS7。RT- PCR、dot- EL ISA和免疫组化方法鉴定目的基因在 COS7细胞中的表达。　结果　琼脂糖凝胶电泳、酶切及序列分析证实多房棘球绦虫 elp基因编码区已成功地克隆于真核表达载体 pc DNA3.1( +)。RT- PCR、dot- EL ISA和免疫组化证实 ,重组质粒在哺乳动物细胞 COS7中能够表达多房棘球绦虫 EL P抗原。　结论　成功地构建了中国四川株多房棘球绦虫 elp基因的真核表达载体 ,该载体在 COS7哺乳动物细胞中能表达 EL P抗原 ,为多房棘球绦虫 elp基因疫苗研究奠定了基础。     

大鼠源肺孢子菌p55基因片段真核表达质粒的构建及表达

目的构建大鼠源肺孢子菌抗原p55基因片段真核表达质粒,并研究该质粒在真核细胞COS-7中的有效表达。方法以含有p55全长基因的质粒为模板,通过PCR扩增p55基因片段,克隆至pGEM-T载体中,经酶切后再将p55基因重组至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-582,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,应用脂质体转染技术转染入COS-7细胞,RT-PCR检测其基因转录情况,SDS-PAGE鉴定其表达相应的目的蛋白质情况。结果成功扩增了p55基因片段,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-582,RT-PCR和SDS-PAGE方法证实该片段能在COS-7细胞中有效表达目的蛋白质。结论成功构建了大鼠源肺孢子菌p55基因片段的真核表达质粒载体,并在COS-7细胞中表达,为进一步进行核酸疫苗的研究奠定了基础。     

嵌合DNA hsp70/CD80真核表达质粒的构建及鉴定

目的　构建hsp70 /CD80嵌合DNA真核表达质粒 ,并对其进行鉴定。方法　采用基因工程技术 ,分别以pBR32 2-hsp70和 pcDNA3-CD80质粒为模板 ,经聚合酶链反应 (PCR)扩增出hsp70 /CD80嵌合目的基因 ,然后与 pcDNA3载体进行连接重组 ,构建成hsp70 /CD80嵌合DNA真核表达质粒 ,用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列分析等多种方法进行鉴定。结果　hsp70 /CD80嵌合DNA重组真核表达质粒经证实构建成功。 结论　hsp70 /CD80嵌合DNA重组真核表达质粒的成功构建 ,为进一步制备结核病hsp70 /CD80嵌合DNA疫苗奠定了基础。     

恶性疟原虫FCC-1/HN株环子孢子蛋白基因片段的亚克隆及表达

目的 构建恶性疟原虫FCC－1／HN株CSP基因的重组真核表达质粒pBK－CSP,在大肠杆菌中进行表达,并进行鉴定。方法 采用限制性内切酶法从重组的大肠杆菌－分枝杆菌穿梭质粒pBCG5.6/CSP中分离出经过测序鉴定的CSP基因片段,将其亚克隆于pBK－CMV真核表达载体,构建重组真核表达质粒pBK-CSP.经IPTG诱导,重组质粒在大肠杆菌DH5α中进行表达,并进行SDS－PAGE及免疫印迹分析。结果 从pBCG5.6/CSP中分离出SP基因片段,成功构建pBK-CSP重组质粒;SDS－PAGE及免疫印迹分析结果显示特异性蛋白条带的相对分子质量约为42000。结论 从pBCG5．6／CSP中成功分离出CSP基因片段,并成功构建pBK-CSP重组质粒,诱导表达CSP非融合蛋白,为恶性疟原虫DNA疫苗的研制奠定了基础。     

人子宫颈癌基因HCCR-2反义真核表达载体的构建及鉴定

目的克隆人子宫癌基因HCCR-2并构建其反义真核表达载体。方法从人肝癌细胞株HepG2提取RNA，利用RT-PCR方法，克隆出一包括HCCR-2编码区的长约1kb的片段，并将其与T载体连接，测序证实无误后，用SalⅠ、SacⅡ双酶切重组T载体，然后将该片段反向插入真核表达载体pIRES2-EGFP的多克隆位点，最后对重组真核表达载体进行双酶切鉴定。结果RT-PCR扩增出一长约1kb的HCCR-2片段，琼脂糖凝胶电泳显示目的片段成功反向连接到pIRES2-EGFP载体上。结论成功克隆了HCCR-2基因并构建了其反义真核表达载体pIRES2-EGFP/HCCR-2（-）。     

神经细胞特异性真核表达载体TUBA1α-EGFP的构建及鉴定

目的 探讨构建具有神经细胞表达特异性的TUBA1α-EGFP真核表达载体,为进一步研究神经元细胞的发生与转化奠定基础.方法 采用PCR技术克隆出长分别为1.121 kb与0.72 kb的TUBA1α启动子及EGFP基因部分序列,利用Gateway 克隆技术构建pLV.EX2 d.null-TUBA1α>EGFP质粒.最后对产生的重组子进行琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定.结果 经琼脂糖凝胶电泳鉴定,所克隆的1.121 kb与0.72 kb的TUBA1 α启动子及EGFP基因片段成功地连接到pLV.Des2 d.null载体上,DNA测序证实插入到载体中的片段为目的 片段.结论 成功构建了神经细胞特异性真核表达载体TUBA1 α-EGFP.     

pCMV-tag2B—HBX质粒的构建和表达

目的构建乙型肝炎病毒X基因（HBX）的真核表达质粒，诱导并鉴定其表达。方法将克隆获得的HBX全长cDNA片段插入带有报告基因的真核表达质粒pCMV-tag2B，构建HBX的重组表达载体pCMV-tag2B—HBX，经DNA测序证明HBX的cDNA片段的插入方向和其全长cDNA的碱基顺序，将重组质粒转染HepG2细胞系，诱导其表达，用Western Blot进行鉴定。结果构建的重组表达载体pCMV-tag2B-HBX经双酶切表明有相应大小的DNA片断，序列分析证实为正确的有完整读码框的X基因，用脂质体转染法可将pC-MV-tag2B-HBX导入HepG2细胞并成功表达，目的蛋白经Western Blot鉴定具有生物学活性。结论成功构建了HBX真核表达质粒pC-MV-tag2B-HBX，重组质粒能表达具有生物学活性的HBX蛋白，为研究HBX的功能打下了基础。     

日本血吸虫酪氨酸羟化酶基因的克隆、真核表达及鉴定

目的扩增日本血吸虫的酪氨酸羟化酶（Schistosoma japonicum Tyrosine Hydroxylase,SjTH）编码基因,构建pcDNA3.1(+) SjTH真核表达载体,并检测其在COS 7细胞中的表达情况。方法以日本血吸虫成虫cDNA为模板,RACE PCR扩增SjTH编码基因,并与pGEM T连接进行亚克隆,双酶切后回收目的基因,并与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,PCR和双酶切初步鉴定后测序,纯化无内毒素重组质粒pcDNA3.1(+) SjTH,转染入COS 7细胞,G418筛选阳性克隆,RT PCR和Western blot鉴定重组SjTH蛋白的表达。结果RACE PCR 扩增出SjTH编码基因,大小约1 392bp,经双酶切鉴定、测序及Blast分析鉴定重组真核质粒构建成功。脂质体介导无内毒重组真核质粒pcDNA3.1(+) SjTH转染入COS 7细胞,G418筛选出阳性克隆,RT PCR证实阳性单克隆细胞带有SjTH编码基因,Western blot鉴定单克隆细胞表达重组SjTH蛋白,大小约54kD。结论真核表达载体pcDNA3.1(+) SjTH构建成功,G418筛选出阳性克隆,真核表达重组SjTH蛋白,为后续研究SjTH蛋白功能奠定基础。     

11β-HSD2重组真核表达载体构建及对A549细胞IL-6的影响

目的 本文旨在构建11β-羟基类固醇脱氢酶2 (11β-HSD2)基因的重组真核表达载体,并检测其转染入哺乳动物细胞后对白介素6(interleukin-6,IL-6)表达水平的影响.方法 用PCR方法扩增11β-HSD2基因的全长cDNA,先亚克隆至pGMT载体,测序正确后再亚克隆至pcDNA3.1 myc-hisC 以构建其重组真核表达载体.将重组的真核表达载体瞬时转染人肺腺癌细胞系A549,用Western blot 方法鉴定表达情况,并用ELISA方法检测IL-6表达水平.结果 测序表明11β-HSD2的重组真核表达载体构建成功,Western blot显示真核表达载体能够在A549细胞中成功表达,并可使IL-6表达水平升高.结论成功构建了11β-HSD2基因的重组真核表达载体,初步验证了该基因的促炎效应.