槲皮素诱导耐甲氨蝶呤骨肉瘤细胞系U2-OS/MTX300凋亡

 【目的】 研究槲皮素对耐甲氨蝶呤骨肉瘤细胞株U2-OS/MTX300的增殖抑制和诱导凋亡作用及相关机制。【方法】 以不同浓度槲皮素及甲氨蝶呤处理U2-OS及U2-OS/MTX300。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法及平板克隆检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期,Hochest 33258 染色及流式细胞仪检测凋亡,Western blot法检测凋亡相关蛋白cleaved-PARP,Bax,Bak,Bcl-2及Bcl-XL表达。【结果】 槲皮素可明显抑制耐甲氨蝶呤骨肉瘤细胞U2-OS/MTX300的增殖,72 h IC50值为(22 ± 4)μmol/L、10、25、50μmol/L可显著抑制U2-OS/MTX300克隆形成数量,且随剂量增加抑制作用明显增强。槲皮素与甲氨蝶呤之间不存在交叉耐药性。槲皮素能诱导U2-OS/MTX300细胞S期阻滞,并可诱导胞内产生典型凋亡小体,流式细胞仪可检测到明显凋亡。其作用机制是通过上调Bax,Bak及下调Bcl-2表达,促进cytochrome C释放及诱发PARP等重要胞内蛋白断裂来实现。【结论】 槲皮素可显著抑制耐甲氨蝶呤骨肉瘤细胞系U2-OS/MTX300细胞增殖并诱导其凋亡,线粒体途径可能是其诱导凋亡的重要机制。     

miR-424负调控PAK2基因抑制骨肉瘤细胞增殖和诱导凋亡的体外研究

目的研究miR-424在骨肉瘤细胞中的表达及其对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其分子机制。方法采用RT-PCR法和Western blot法检测骨肉瘤细胞和健康人成骨细胞中miR-424、PAK2 mRNA及PAK2蛋白的表达情况。采用Lipofectamine2000在骨肉瘤U2-OS细胞中转染miR-424或si-PAK2,采用Western blot法检测转染后骨肉瘤U2-OS细胞中相关蛋白的表达,CKK-8法检测细胞的活性,流式细胞术检测细胞的凋亡。采用双荧光素酶报告基因实验检测miR-424对PAK2的靶向作用。采用Lipofectamine2000在骨肉瘤U2-OS细胞中共转染miR-424和pcDNA-PAK2,利用上述方法检测骨肉瘤U2-OS细胞增殖和凋亡、相关蛋白表达。结果与健康人成骨细胞hFOB1.19相比,骨肉瘤MG63、U2-OS、SOSP-9607细胞中miR-424的表达显著下调,PAK2 mRNA和蛋白的表达显著上调,差异均有统计学意义(P<0.05);miR-424抑制骨肉瘤U2-OS细胞增殖并促进细胞凋亡,减少Cyclin D1和Bcl-2的...     

hsa-miR-30a在人骨肉瘤细胞U2-OS中的表达及其对细胞凋亡的影响

目的:研究miR-30a在人骨肉瘤细胞U2-OS中的过表达对其凋亡的影响。方法:构建pEZX-MR04-pre-miR-30a真核表达载体,瞬时转染人骨肉瘤细胞株U2-OS,荧光显微镜及荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测miRNA-30a在U2-OS中的表达,并采用流式细胞仪检测稳转株细胞的凋亡情况。结果:荧光显微镜下观察真核表达载体pEZX-MR04-pre-miR-30a转染后的U2-OS细胞,可见大量绿色荧光;qRT-PCR检测U2-OS中miR-30a的表达明显提高;流式细胞检测转染后的U2-OS细胞的凋亡明显增加。结论:miR-30a在人骨肉瘤细胞U2-OS过表达能促进其凋亡,miR-30a可能是U2-OS细胞潜在的抑癌基因。     

三七提取液对SMMC-7721细胞Bcl-2与Bax蛋白表达的影响

目的:研究三七提取液体外抑制人肝癌细胞株SMMC-7721增殖及对凋亡调控基因Bax、Bcl-2蛋白表达的影响.方法:不同浓度的三七提取液作用于体外培养的SMMC-7721细胞,采用MTT法检测细胞的抑制率;以流式细胞术观察细胞凋亡率的变化;以蛋白免疫印迹(Western blotting)法检测细胞凋亡相关因子Bcl-2及Bax和蛋白水平的表达情况.结果:三七提取液对人肝癌SMMC-7721细胞的增殖具有抑制作用,且具有明显的时间和剂量相关性.细胞凋亡率随着药物浓度的增加而逐步增高.三七提取液作用后细胞内Bcl-2蛋白表达水平降低,Bax蛋白表达水平均升高,二者的变化趋势均呈一定的时间依赖关系.结论:三七提取液能够显著抑制人肝癌细胞增殖,诱导SMMC-7721细胞凋亡,其作用机制可能与上调Bax的表达及下调Bcl-2的表达有关.     

顺铂损伤U2-OS细胞诱导细胞周期阻滞、凋亡及p53、bcl-2、c-myc基因表达的实验研究

目的 探讨顺铂损伤U2骨肉瘤细胞(U2-OS)诱导细胞周期阻滞及凋亡过程中不同时间p53、bcl-2、c-myc基因表达的变化,为提高骨肉瘤化疗敏感性提供理论依据.方法 使用0、0.3、3.0、30.0 μg/mL顺铂作用U2-OS细胞2 h后继续培养0、6、12、24、48 h.采用四唑蓝比色法(MTT法)、流式细胞术、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白免疫印迹发光法(Western blot法)检测顺铂对U2-OS细胞体外增殖、凋亡作用、细胞周期变化及相关基因的表达.结果 不同浓度的顺铂在体外对U2-OS细胞均有抑制作用,其抑制率随着浓度明显增加,且有组间差异(P<0.05).在顺铂损伤早期细胞发生G1期细胞周期阻滞,且仅p53明显表达;继续培养48 h后,30.0 μg/mL顺铂作用过的细胞凋亡率达27.08%,p53、bcl-2和c-myc mRNA及蛋白表达呈现明显组间差异.结论 不同浓度顺铂通过细胞内p53、bcl-2、c-myc基因表达的变化,诱导骨肉瘤细胞凋亡是其抗肿瘤的机制之一.在细胞损伤早期p53的表达诱导了G1细胞周期的阻滞,而中后期p53的表达抑制了bcl-2的表达,促进细胞凋亡的发生.c-myc基因表达的抑制在损伤后期参与了抑制细胞的增殖.     

纳米羟基磷灰石对骨肉瘤U2-OS细胞生长的影响

目的研究羟基磷灰石纳米粒子对骨肉瘤U2-OS细胞生长的影响。方法通过体外细胞毒性实验、观察细胞形态及超微结构等方法,研究不同浓度羟基磷灰石纳米粒子对骨肉瘤U2-OS细胞生长的影响。结果羟基磷灰石纳米粒子对骨肉瘤U2-OS细胞有明显的抑制作用,且随浓度(31．25μg／ml到500μg／ml)和作用时间(1d到3d)的增加而增加,细胞出现皱缩、核浓缩、核碎裂等凋亡特征。结论羟基磷灰石纳米粒子抑制骨肉瘤U2-OS细胞的生长,在一定范围内随浓度和作用时间的增加而增加。     

Livin基因增强骨肉瘤转化和顺铂耐药性的体外实验研究

目的 探讨凋亡抑制蛋白(IAP)家族新成员Livin基因在骨肉瘤形成以及多药耐药过程中的作用.方法 应用亚克隆技术构建Livin基因短发夹RNA(shRNA)表达载体,稳定转染并筛选沉默Livin表达的克隆.细胞克隆形成法测定阳性克隆的非贴附性生长状态.流式细胞计数法测量Livin表达短期沉默后细胞周期和顺铂化疗敏感性的变化,以及长期沉默后的Hoechst33258核染色情况.Western blot检测Cyclin D1、Bcl-2、Bax、活化型Caspase-3和多聚ADP核糖多聚酶的表达变化.结果 在骨肉瘤U2-OS细胞中,shRNA介导了Livin mRNA和蛋白水平的下调,细胞克隆形成能力明显下降.在Livin表达沉默早期,处于G0/G1期细胞增加,Cyclin D1的表达减弱,对顺铂药物敏感性增强;长期沉默后凋亡小体形成,Bcl-2蛋白的表达下调,Bax、活化型Caspase-3和PARP的表达上调.结论 凋亡抑制蛋白Livin不但促进骨肉瘤的发生而且促进顺铂化疗耐药性的形成.     

PARP-1抑制剂对骨肉瘤细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨PARP-1抑制剂3-aminobenzamide（3-AB）对骨肉瘤U2OS细胞增殖及凋亡的影响。方法常规培养骨肉瘤U2OS细胞,采用CCK-8法检测U2OS细胞的增殖和流式细胞术检测细胞凋亡,并用caspase-3活性测定试剂盒检测caspase-3活性和Western-blot技术检测Bcl-2、Bax的表达。结果 3-AB能抑制骨肉瘤细胞的增殖,且与剂量和时间呈相关性,流式细胞术检测结果显示3-AB能促进骨肉瘤细胞的凋亡,且呈时间相关性,3-AB刺激早期caspase-3活性增高,Western-blot显示3-AB刺激后随时间延长Bax的表达量逐渐升高,而Bcl-2的表达量则轻度升高后降低。结论 PARP-1抑制剂3-AB能抑制骨肉瘤细胞的增殖,促进其凋亡,这为PARP-1作为骨肉瘤治疗的新靶点提供了初步实验依据。     

As2 O3上调FOXO3a促人大肠癌SW620细胞凋亡及其相关研究

目的观察三氧化二砷(As2 O3)对人大肠癌SW620细胞凋亡的影响,进一步研究As2 O3作用后,凋亡相关基因FOXO3a、Bcl-2和Bax 表达的关系.方法体外常规培养人大肠癌SW620细胞,以不同浓度As2 O3干预24 h ,观察细胞形态变化;Hoechst检测药物作用后细胞核形态变化;RT-PCR检测药物作用后FOXO3a、Bcl-2和Bax mRNA的表达;SP法检测药物作用后FOXO3a、Bcl-2和Bax蛋白的表达.结果 As2 O3作用后,SW620细胞数量明显减少,细胞变小、变圆,染色质固缩,胞核致密浓染,核碎裂增多并出现凋亡小体;FOXO3a和Bax mRNA和蛋白的表达随As2 O3浓度增加而增加,Bcl-2 mRNA和蛋白的表达随As2 O3浓度增加而减少.结论 As2 O3具有诱导大肠癌SW620细胞凋亡的作用,且与As2 O3浓度有量效关系.其机制可能是通过上调FOXO3a因子,继而上调Bax和下调Bcl-2的表达影响细胞凋亡.     

人参皂甙20（R）-Rg3对人胶质瘤U87细胞凋亡的影响

目的探讨人参皂甙20（R）-Rg3对人胶质瘤U87细胞凋亡作用的影响。方法应用MTT法及流式细胞术观察不同浓度的Rg3对U87细胞凋亡的影响,采用细胞吖啶橙／溴乙锭荧光观察凋亡形态学改变,采用WesternBlot技术检测细胞Bcl2、Bax、p-Akt及tAkt蛋白表达。结果Rg3显著抑制U87细胞增殖,Rg3呈剂量依赖性诱导肿瘤细胞凋亡。不同浓度Rg3作用U87细胞24h,U87细胞中Bax表达逐渐增高,Bcl-2表达降低．Bax／Bcl-2呈浓度依赖性升高,细胞p-Akt蛋白表达降低,而t—Akt蛋白未见改变。结论Rg3通过抑制P13K／Akt信号转导通路中的Akt磷酸化,影响胶质瘤U87细胞系Bcl-2蛋白表达降低,促凋亡Bax蛋白表达增加,调控胶质瘤细胞的凋亡。     

RNA干扰技术特异性抑制骨肉瘤survivin的表达

目的:体外转录合成survivin siRNA,观察其在骨肉瘤细胞株U2-OS中抑制survivin的表达情况.方法:体外转录合成survivin序列特异性双链RNA(dsRNA),转染U2-OS细胞株中,用RT-PCR和Western blot法检测转染前后survivin基因的mRNA和蛋白的表达,MTF法检测细胞增殖,观察U2-OS细胞生物学特性的改变.结果:转染特异性siRNA的细胞其survivin mRNA及蛋白表达均下调,干涉后细胞的增殖受到抑制.结论:体外转录合成特异性survivin siRNA能有效抑制骨肉瘤细胞株U2-OS中survivin的表达,抑制细胞的增殖,RNA干扰技术为骨肉瘤的治疗提供了一种新策略.     

干扰AURKA基因表达对人骨肉瘤细胞系U2-OS细胞增殖与细胞周期的影响

目的:探讨AURKA基因表达下调对骨肉瘤细胞增殖和细胞周期分布的影响?方法:脂质体瞬时转染法介导AURKA 小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)处理骨肉瘤U2-OS细胞, 采用实时荧光定量PCR及 Western blot方法检测转染前后AURKA mRNA和蛋白表达,CCK8实验检测细胞活力变化,流式细胞术检测细胞周期分布变化,Western blot检测周期相关蛋白的表达,5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)细胞增殖实验检测细胞增殖情况?结果:AURKA siRNA作用U2-OS细胞后, AURKA mRNA和蛋白的表达水平较正常对照组及阴性对照组显著降低,且差异有统计学意义 (P < 0.05),两对照组间AURKA表达无明显差异;下调AURKA表达后,细胞活力降低,且作用72 h后抑制率最高,约为(36.63 ± 2.38)%;细胞周期中S期细胞比例下降,G2/M期细胞比例增加,与正常对照组及阴性对照组相比差异有统计学意义(P < 0.05),提示存在G2/M期阻滞,S期细胞增殖率下降(P < 0.05),周期相关蛋白D1(Cyclin D1)表达水平下降(P < 0.05),周期相关蛋白B1(Cyclin B1)表达水平明显增加(P < 0.05)?结论:下调AURKA表达可抑制骨肉瘤细胞U2-OS的增殖, 同时导致细胞阻滞于G2/M期?     

糖皮质激素受体在3种人成骨肉瘤细胞株MG63、U2-OS及HOS中表达及差异

目的 研究糖皮质激素受体（glucocorticoid receptors,GR）在人成骨肉瘤细胞株MG63、U2-OS及HOS的表达及差异.方法 人成骨肉瘤细胞株MG63、U2-OS及HOS购买于ATCC,常规方法培养细胞.待细胞株生长良好时,检测3种细胞株的细胞骨架、黏附力等细胞特性,通过realtime RT-PCR和Western blot法检测GR表达情况.结果 3种人成骨肉瘤细胞株有不同细胞特性,GR在3种人成骨肉瘤细胞株中表达存在差异.结论 GR在不同功能的人成骨肉瘤细胞株中表达不同.     

人参皂甙Rh2诱导人喉癌细胞株Hep-2凋亡的研究

目的:研究人参皂甙Rh-2(G-Rh2)诱导喉癌Hep-2细胞凋亡的作用。方法:应用流式细胞术、琼脂糖凝胶电泳检测G-Rh2处理前后Hep-2细胞的凋亡情况,并应用SP免疫组化法检测药物处理前后相关基因产物Bax、Bcl-2蛋白的表达,观察G-Rh2对喉癌Hep-2细胞的诱导凋亡作用及其对细胞周期的影响。结果:(1)G-Rh2具有诱导凋亡作用,且呈量效、时效关系,细胞凋亡率随G-RH2浓度及作用时间的增加而升高,并可将细胞周期阻滞于G0/G1期。(2)G-Rh2处理Hep-2后,Bax表达上调,Bcl-2在G-Rh2处理前后无明显变化。结论:G-Rh2对体外培养的Hep-2细胞具有诱导凋亡的作用,其机制可能与上调Bax的表达及细胞周期阻滞有关。     

抑制miR-30a/HMGA2介导的骨肉瘤细胞自噬对化学药物治疗诱导的细胞凋亡的作用

目的：探讨微小RNA(microRNA,miR)-30a/高迁移率族蛋白A2(high mobility group protein A2,HMGA2)介导的骨肉瘤细胞自噬对化学药物治疗(以下简称化疗)药物诱导的细胞凋亡的影响。方法：随机选取30例经化疗药物治疗后表现为化疗敏感和化疗抵抗的骨肉瘤患者组织,分为化疗敏感组(n=15)和化疗抵抗组(n=15),采用real-time PCR检测两组中miR-30a和HMGA2的mRNA表达水平,以及骨肉瘤细胞U2-OS经不同浓度的化疗药物(顺铂、阿霉素、氨甲蝶呤)处理后miR-30a的mRNA表达水平;采用蛋白质印迹法检测细胞内自噬相关因子Beclin 1,自噬微管相关蛋白1轻链3B(microtubule associated protein 1 light chain 3B,LC3B)、自噬抑制因子P62的表达情况。在骨肉瘤细胞U2-OS中转染miR-30a模拟物和抑制剂,构建miR-30a高表达组、低表达组和对照组,采用蛋白质印迹法检测经过顺铂和阿霉素处理后上述3组细胞内Beclin 1,LC3B和P62的表达情况;采用单丹磺酰尸胺(monodansylcada,MDC)染色法检测细胞内自噬水平,ROS荧光探针-二氢乙啶(dihydroethidium,DHE)检测细胞内ROS水平,细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡程度,线粒体膜电位荧光探针JC-1检测细胞线粒体氧化损伤程度;采用双荧光素酶法检测miR-30a与HMGA2的相互作用,同时通过转染HMGA2模拟物和HMGA2-shRNA干扰质粒载体,构建HMGA2高表达组、低表达组和对照组,采用蛋白质印迹法检测经过顺铂和阿霉素处理后上述3组细胞内Beclin 1,LC3B和P62的表达情况。结果：化疗抵抗组中miR-30a的mRNA水平显著低于化疗敏感组(P<0.05),HMGA2的表达与miR-30a相反(均P<0.05)。在相对低浓度(5 μml/L)的化疗药物刺激下,骨肉瘤细胞U2-OS内的miR-30a mRNA表达下调,Beclin 1和LC3B均显著上调(均P<0.01),P62显著下调(P<0.01)。在miR-30a高表达组中,与对照组相比,Beclin 1和LC3B的表达水平与miR-30a明显下降(P<0.05),P62的表达水平明显升高(P<0.05),在miR-30a低表达组中则相反;在经过化疗药物处理后的miR-30a高表达组中,细胞自噬水平更低,细胞存活率更低,ROS水平更高,线粒体氧化损伤程度更高,细胞凋亡水平更高(均P<0.05),miR-30a低表达组则相反(均P<0.05)。双荧光素酶报告基因检测验证了miR-30a与HMGA2的靶向互补配对关系;与对照组相比,HMGA2高表达组中Beclin 1和LC3B的表达水平与HMGA2明显升高(P<0.05),P62的表达水平明显下降(P<0.05),在HMGA2低表达组中则相反。结论：积极发挥miR-30a/HMGA2抑制骨肉瘤细胞自噬的功能,能够破坏细胞应对ROS介导的自噬与凋亡的平衡,增强化疗药物对细胞的杀伤作用。     

华蟾素诱导人胶质瘤细胞U251凋亡的作用机制研究

目的研究观察华蟾素(Cinobufacini)对体外培养人胶质瘤细胞U251增殖抑制作用,并初步探讨其诱导U251细胞凋亡的分子机制。方法平皿克隆形成法测定不同浓度华蟾素对U251细胞锚定依赖性生长能力的影响;使用Wester Blot法观察不同浓度华蟾素处理人胶质瘤细胞48小时后,Bcl-2、Bax蛋白表达变化情况。结果平皿克隆法显示:华蟾素抑制人胶质瘤细胞U251生长,呈剂量依赖性;Wester Blot显示随着药物浓度升高,华蟾素可以逐渐抑制Bcl-2的蛋白表达,活Bax蛋白表达。结论华蟾素有诱导人胶质瘤细胞U251细胞凋亡的作用,其机制可能Bcl-2/Bax比值的下调,促进细胞凋亡有关。     

氯化锂对人骨肉瘤细胞U2-OS增殖、凋亡及Fas、Caspase-3 mRNA表达的影响

目的:研究氯化锂(LiCl)对人骨肉瘤细胞U2-OS增殖及凋亡的影响,并探讨其可能的机制。方法:以40、80、150mmol/L的LiCl作用于U2-OS细胞24、48和72h后,采用MTT法检测细胞增殖抑制率;作用48h后,流式细胞术法检测细胞凋亡率,并分析细胞周期;RT-PCR法检测凋亡相关基因Fas、Caspase-3mRNA的表达。结果:随LiCl作用剂量的增加,U2-OS细胞增殖抑制率增加,细胞凋亡率和Fas、Caspase-3mRNA表达量亦增加(F=61157.480,70.828和418.072,P<0.001);细胞周期分析显示细胞被阻滞于S期(P<0.001)。结论:LiCl可能通过促进凋亡基因Fas、Caspase-3的表达,抑制U2-OS细胞增殖并诱导凋亡。     

放疗对人肝癌细胞株Hep-G2中Bax和Bcl-2表达的影响

目的:探讨放疗对人肝癌细胞株Hep-G2中Bax和Bcl-2蛋白表达水平的影响.方法:6MV-X射线照射细胞,采用免疫组织化学染色观察人肝癌细胞株中Bax和Bcl-2的表达.结果:Bax和Bcl-2的表达在照射时间和照射剂量之间存在交互作用(F=1.733,P=0.042;F=1.700,P=0.048).4Gy照射剂量作用细胞48h后,Hep-G2细胞中Bax的表达达高峰、Bcl-2的表达至低谷.结论:放射线可能通过促进Bax表达和抑制Bcl-2表达诱导肝癌细胞凋亡.