多药耐药相关基因及其蛋白在介导胰腺癌细胞原发性耐药中的作用及调控

目的 检测多药耐药相关基因（MDR1）及其蛋白（P-gP）在胰腺癌细胞株的表达,初步探讨胰腺癌发生先天性耐药的机理。方法 选择8株人胰腺癌细胞株,采用RT-PCR方法检测MDR1mRNA在胰腺癌细胞中的表达;通过免疫细胞化学方法检测P-gP的表达;以流式细胞仪检测胰腺癌细胞对罗丹明的外排情况,评价P-gP泵功能;最后通过P-gP抑制物维拉帕米与化疗药物联合应用,检测其对胰腺癌细胞的杀伤作用。结果 MDR1mRNA在胰腺癌细胞株SW1990中的表达最高,除PCT-2未检测到MDR1的表达外,其余6株细胞均有MDR1的微弱表达;免疫细胞化学染色结果证实P-gP在SW1990中的表达明显高于其他细胞株。57．9％±5．4％的SW1990细胞内有罗丹明蓄积,而在P-gP阴性对照细胞中,99．5％±3．3％的细胞内存在罗丹明的积聚,两者差异有统计学意义（P〈0．05）。P-gP抑制物维拉帕米与阿霉素或表阿霉素联合应用时可以部分逆转肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。结论 MDR1及P-gP在人胰腺癌细胞中存在一定量的表达;维拉帕米联合阿霉素可以明显抑制P-gP阳性细胞的生长。     

葡萄籽多酚逆转胆囊癌细胞株GBC-SD耐药的研究

目的研究葡萄籽多酚（GSP）逆转先天性耐药细胞株GBC-SD耐药的机制，寻找高效低毒的耐药逆转剂。方法选择先天性耐药细胞株GBC-SD为研究对象。MTT比色法测定各化疗药物的半数抑制浓度（IC50）；RT-PCR测定MDR1 mRNA的变化；流式细胞仪检测P-gP，bcl-2蛋白和细胞内阿霉素浓度的变化。结果（1）无毒（3μg／mL）和低毒（6μg／mL）浓度的GSP处理后各化疗药物的IC50值均明显下降（P〈0．05），能明显逆转GBC-SD的多药耐药性；（2）上述两浓度的GSP能下调GBC-SD细胞MDR1 mRNA表达（P〈0．05）；（3）上述两浓度的GSP能下调GBC-SD细胞P-gP和bcl-2蛋白表达（P〈0．05）；（4）GSP增加GBC-SD细胞内ADM药物浓度（P〈0．05）。结论GSP能部分逆转先天性耐药细胞株GBC-SD多药耐药性，其作用机制为下调GBC-SD细胞MDR1 mRNA，及P-gP和bcl-2蛋白表达。     

汉防己甲素和吉西他滨协同使用对化疗耐药胰腺癌细胞的凋亡诱导作用

目的：研究汉防己甲素对胰腺癌化疗耐药产生与凋亡的影响。方法：分对照组（只加培养基）、吉西他滨组（Gemcitabine组）和汉防己甲素联合吉西他滨组（Tet/Gem组）,后2组采用不同浓度汉防己甲素和吉西他滨作用于人胰腺癌敏感株BxPC-3和吉西他滨耐药株BxPC-3/Gem细胞,通过MTT法检测抗肿瘤药物的细胞毒作用,碘化丙啶（PI）染色检测细胞凋亡。结果：BxPC-3/Gem耐药胰腺癌细胞株耐药指数（RF）为4.70,汉防己甲素作用耐药胰腺癌细胞后其RF降至1.69,证明汉防己甲素可逆转BxPC-3/Gem耐药胰腺癌细胞对吉西他滨的耐药。化疗耐药胰腺癌细胞凋亡在12h、18h、24h,Tet/GEM组与GEM组、对照组比较,差异有非常显著性意义（P〈0.01）。结论：汉防己甲素可以逆转BxPC-3/Gem耐药胰腺癌细胞对吉西他滨的耐药,协同吉西他滨促进对化疗耐药胰腺癌细胞凋亡作用。     

丹参预处理对肝脏缺血再灌注后胃肠激素的影响

目的探讨丹参预处理对肝脏缺血再灌注后胃肠激素的影响。方法前瞻性研究2010年5月至2012年5月广州军区武汉总医院收治的32例肝病患者,对所有患者行肝部分切除术,术中行第一肝门阻断。按随机数字表法将32例患者分为2组：缺血再灌注组（IR组,15例）和丹参预处理组（SM组,17例）,两组患者均在术中行肝部分切除,以P6ngle法行第一肝门阻断约15～20min,IR组术前3d给予30mL／d生理盐水静脉滴注,SM组术前3d给予丹参注射液30mL／d静脉滴注;12例开腹手术而未行肝门阻断者作为阴性对照组（s0组）;5例健康志愿者作为正常对照组（CO组）。分别测定各组胃动素、胆囊收缩素、血管活性肠肽、胰泌素水平变化情况。多组比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD—t检验。结果c0组胃动素水平为（347±14）μg/L,SO组术后24、48、72h胃动素水平分别为（324±13）μg/L、（345±12）μg/L和（345±13）μg/L,IR组分别为（307±10）μg/L、（316±9）μg/L和（338±13）μg/L,SM组分别为（313±7）μg/L、（337±12）μg/L和（345±12）μg/L。s0组术后24h胃动素水平显著低于c0组（t=5．25,P〈0．05）;IR组术后24、48、72h胃动素水平显著低于同时相点sO组（t=10．05,8．09,2．07,P〈0．05）;SM组胃动素表达水平在术后24、48h显著低于SO组（t=9．83,2．28,P〈0．05）,但是至术后72h与S0组比较,差异无统计学意义（t=0．36,P〉0．05）;SM组胃动素表达水平在术后24、48、72h显著高于IR组（t=3．80,7．10,2．35,P〈0．05）。CO组胆囊收缩素水平为（2．53±0．06）μg/L,SO组24、48、72h胆囊收缩素水平分别为（3．28±0．09）μg/L、（2．52±0．09）μg/L和（2．54±0．16）μg/L,IR组分别为（4．34±0．21）μg/L、（3．63±0．31）μg/L和（3．25±0．09）μg/L,SM组分别为（3．71±0．28）μg/L、（3．28±0．11）μg/L和（2．53±0．09）μg/L。SO组术后24h胆囊收缩素水平显著高于c0组（t=4．33,P〈0．05）;IR组术后24、48、72h胆囊收缩素水平显著高于同时相点的s0组（t=9．32,5．37,2．16,P〈0．05）;SM组胆囊收缩素表达水平在术后24、48h显著高于s0组（t=7．21,3．42,P〈0．05）,但是至术后72h与S0组比较,差异无统计学意义（t=0．29,P〉0．05）。SM组胆囊收缩素表达水平在术后24、48、72h显著低于IR组（t=5．62,4．63,3．57,P〈0．05）。CO组血管活性肠肽水平为（11．8±1．6）μg/L,SO组术后24、48、72h血管活性肠肽水平分别为（21．5±3．8）μg/L、（12．2±1．6）μg/L和（11．9±1．7）μg/L,IR组分别为（29．7±4．1）μg/L、（22．9±4．2）μg/L和（18．8±2．8）μg/L,SM组分别为（22．4±4．1）μg/L、（16．4±2．3）μg/L和（12．1±1。6）彬L。s0组术后24h血管活性肠肽水平显著高于C0组（t=3．59,P〈0．05）;IR组患者血管活性肠肽表达水平在术后24、48、72h显著高于同时相点S0组（t=6．35,3．22,2．36,P〈0．05）。SM组患者血管活性肠肽表达水平在术后24、48h显著高于s0组（t=5．04,2．33,P〈0．05）,但是至术后72h与s0组比较,差异无统计学意义（t=0．18,P〉0．05）。SM组患者血管活性肠肽表达水平在术后24、48、72h显著低于IR组（t=4．27,3．87,2．45,P〈0．05）。CO组胰泌素水平为（75±5）μg/L,SO组术后24、48、72h胰泌素水平分别为（98±6）μg/L、（76±4）μg/L和（76±4）μg/L,IR组分别为（129±6）μg/L、（102±8）μg/L和（89±6）μg/L,sM组分别为（104±8）μg/L、（90±6）μg/L和（74±4）μg/L。S0组术后24h胰泌素水平显著高于CO组（t=3．27,P〈0．05）;IR组患者胰泌素表达水平在术后24、48、72h显著高于同时相点s0组（t=5．20,2．94,1．77,P〈0．05）。SM组患者胰泌素表达水平在术后24、48h显著高于s0组（t=4．16,2．54,P〈0．05）,但是至术后72h与SO组比较,差异无统计学意义（t=0．23,P〉0．05）。SM组患者胰泌素表达水平在术后24、48、72h显著低于IR组（t=5．13,4．32,2．87,P〈0．05）。结论肝门阻断所致胃肠道淤血可导致同期胃动素表达下调,胆囊收缩素、血管活性肠肽、胰泌素表达上升;丹参可能通过改善微循环、减轻胃肠道水肿,改善胃肠运动功能,间接影响胃肠激素的分泌表达。     

葡萄糖神经酰胺合成酶基因在人胰腺癌细胞SW1990及其耐药亚株中的表达和意义

目的探讨葡萄糖神经酰胺合成酶（glucosylceramide synthase,GCS）基因在人胰腺癌细胞SW1990及其耐药亚株中的表达和意义。方法体外培养人胰腺癌细胞SW1990和其耐药亚株SW1990／FU、SW1990／ADM、SW1990／GEM,以细胞活性测定（CCK-8法）检测耐药亚株的耐药指数,相对定量荧光实时PCR（RT—PCR）法检测GCS mRNA的表达,免疫印迹法检测GCS蛋白表达水平。结果与亲本株相比,SW1990／FU、SW1990／ADM、SW1990／GEM的耐药指数分别为339．7、11．9、56．6。RT—PCR和免疫印迹检测结果显示亲本株和耐药亚株均有GCS mRNA和蛋白的表达,GCS mRNA在3株耐药亚株中的表达均比亲本株有增高趋势,且SW1990／ADM、SW1990／GEM的GCS蛋白表达水平较亲本株升高,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论GCS基因在人胰腺癌细胞株SW1990和其3株耐药亚株中表达阳性,GCS蛋白在SW1990／ADM、SW1990／GEM中呈高表达,表明GCS可能参与胰腺癌耐药株细胞对ADM、GEM的耐药。     

人硫酸酯酶1转染对胰腺癌细胞膜结构及对细胞生物学行为的影响

目的检测人硫酸酯酶1在胰腺癌细胞株中的表达水平,及转染后对胰腺癌细胞膜的结构及生长增殖能力的影响。方法应用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测7株胰腺株硫酸酯酶1mRNA的表达水平。采用脂质体Lipofectamine方法对Panc-1细胞进行硫酸酯酶1基因转染。Western blot检测转染前后Panc-1细胞硫酸酯酶1蛋白表达。共聚焦显微镜检测细胞膜表面硫酸肝素蛋白多糖（HSPG）结构的变化,应用噻唑蓝（MTT）比色分析法测定胰腺癌细胞的生长增殖能力,并检测转染前后的胰腺癌细胞对3种化疗药物（5-氟尿嘧啶、吉西他滨及放线菌素D）敏感性的影响。结果7株人胰腺癌细胞株中3株硫酸酯酶1mRNA呈高表达,其余4株低表达或无表达。硫酸酯酶1稳定转染后,Panc-1细胞稳定表达硫酸酯酶1蛋白成分。转染后细胞膜表面HSPG结构明显改变,并且硫酸酯酶1表达细胞增殖速度减慢,转染组细胞倍增时间为（68．2±4．3）h,明显慢于对照组（50．3±3．2）h,P〈0．05。转染后的胰腺癌细胞对化疗药物的敏感性并无明显改变。结论人硫酸酯酶1的表达通过影响细胞膜表面HSPG的结构,影响胰腺癌细胞的生长增殖能力,可能作为胰腺癌基因治疗的靶点。     

胰腺癌多药耐药细胞株BxPC-3/ADM的建立及耐药机制的初步探讨

目的 构建胰腺癌多药耐药细胞株BxPC-3/ADM,通过动态监测诱导耐药过程,探讨其耐药的可能机制.方法 逐步增加阿霉素浓度对BxPC-3细胞进行诱导,在不同的阿霉素诱导浓度,MTT法检测细胞对多种化疗药物的耐药指数,RT-PCR和Western印迹法检测细胞MDR1和MRP mRNA和蛋白的表达.结果 成功构建多药耐药细胞株BxPC-3/ADM;在0.05 μg/ml至8 μg/ml阿霉素诱导浓度,细胞对5-Fu、MMC和Gem的耐药指数无明显增加;在16 μg/ml浓度3种化疗药物的耐药指数有较明显上升,同时伴有MDR1 mRNA表达的明显增加;至32 μg/ml 5-Fu和Gem的耐药指数未再有继续上升,而MMC的耐药指数则继续上升,同时MDR1 mRNA表达未再增加,而MRP mRNA表达则明显增加.Western印迹实验显示MDR1和MRP蛋白表达变化与mRNA表达变化趋势一致.结论 MDR1基因在诱导早期的耐药中起主导作用,在后期则和MRP基因协同发挥作用.     

MDR1 siRNA对胰腺癌细胞株BxPC-3耐药性影响的实验研究

目的：观察阻断多药耐药基因1（MDR1）表达后胰腺癌细胞对化疗药物敏感性的变化,探索提高胰腺癌化疗疗效的新方法。方法：采用RNA干扰技术．构建MDR1 siRNA重组质粒．脂质体介导转染人胰腺癌细胞株BxPC-3,并筛选稳定转染细胞克隆,RT-PCR和Western印迹法检测MDR1 mRNA和蛋白的表达变化。将细胞接种于裸鼠,观察移植瘤对化疗药物吉西他滨敏感性的变化。结果：转染MDR1 siRNA质粒后胰腺癌细胞株BxPC-3 MDR1 mRNA与蛋白表达水平明显降低。体内实验结果显示,将转染前后的细胞接种于裸鼠,转染组移植瘤对化疗药物吉西他滨更为敏感（P〈0．05）。结论：通过RNA干扰技术,可在转录和翻译水平降低MDR1在胰腺癌细胞株BxPC-3中的表达,并能提高细胞对化疗药物的敏感性。     

鞘内注射硫酸镁或/和吗啡对大鼠切口疼痛的影响

目的观察在大鼠切口疼痛模型中鞘内注射（IT）硫酸镁（MgSO4）或／和吗啡对大鼠切口疼痛的影响。方法雄性SD大鼠96只,随机均分为12组,每组8只,分别为假手术组、对照组、术前MgSO4 375μg治疗组和术后MgSO4 375μg治疗组、术前MgSO4 188μg治疗组和术后MgSO4 188μg治疗组、术前吗啡5μg治疗组和术后吗啡5μg治疗组、术前吗啡2．5μg治疗组和术后吗啡2．5μg治疗组、术前MgSO4 188μg加吗啡2．5μg治疗组和术后MgSO4 188μg加吗啡2．5μg治疗组。按Yaksh法施行鞘内置管。按Brennan法建立大鼠足底切口痛模型。分别于术前、术后2h、3h、6h、12h、1d、2d、3d、5d以von Frey细丝法（机械性痛觉过敏）、热辐射法（热痛觉过敏）和累积疼痛评分法观察大鼠疼痛行为学变化。结果与假手术组和术前值比较,对照组、术前或术后MgSO4 375μg治疗组、术前或术后MgSO4 188μg治疗组、术前或术后吗啡2．5μg治疗组大鼠在术后2h、3h、6h、12h、1d、2d的累积疼痛评分均明显升高（P〈0．05或P〈0．01）,von Frey纤毛刺激机械缩足反射阈值（MWT）均明显降低（P〈0．01）,热刺激缩足潜伏期（TWL）均明显缩短（P〈0．05或P〈0．01）;与对照组比较,术前或术后吗啡5μg治疗组、术前或术后MgSO4 188μg加吗啡2．5μg治疗组大鼠的累积疼痛评分均明显降低（P〈0．01）,MWT均明显升高（P〈0．01）,TWL均明显延长（P〈0．05或P〈0．01）。结论在大鼠切口疼痛模型中．单次IT吗啡5μg或MgSO4 188μg加吗啡2．5μg能提供术后早期抗伤害作用。     

胰腺癌细胞对5—Fu和吉西它滨获得性耐药后bcl—XL和mcl—l表达的变化

目的：探讨胰腺癌细胞对5－Fu和吉西它滨的获得性耐药后bcl-XL和mcl-l表达的变化。方法：应用SRB方法检测5－Fu和吉西它滨对胰腺癌细胞株Panc-1,Mia-Paca-2和Capan-1的细胞毒性作用，应用Western blot法来检测bcl-XL和mcl-l的蛋白表达水平。结果：5－Fu和吉西它滨对3株胰腺癌细胞均产生了细胞毒性作用，5－Fu长期作用后，Capan-1细胞IC50上升了2．1倍（P＜0．05）。吉西它滨长期作用后，Capan-1细胞IC50上升了1．5倍（P＜0．05）。5－Fu或吉西它滨长期作用后，产生了获得性耐药的胰腺癌细胞bcl-XL和mcl-1表达水平上调。结论：5－Fu或吉西它滨长期作用后，产生了获得性耐药，这种耐药与bxl-XL和mcl-l的过度表达相关。     

膝关节后交叉韧带断裂治疗临床分析

目的 对35例膝关节后交叉韧带断裂治疗进行临床分析,重点探讨了有关交叉韧带断裂的治疗问题。方法 经明确诊断后,分析采用胫骨附着处撕脱骨折复位固定手术治疗26例、早期髌韧带中1／3移植重建3例、单纯长腿石膏固定6例。结果 本组病例全部进行随访,随访时间13个月－5年,胫骨附着处撕脱骨折复位固定及髋韧带中1／3移植重建29例为优良、单纯长腿石膏固定6例为差。结论 后交叉韧带断裂后应该及时给予手术修复;膝后外侧手术入路,操作简单,暴露充分;少于3个月的陈旧性病例仍适应手术治疗。     

不同方法重建指尖离断静脉回流的疗效分析

目的：探讨不同方法重建指尖离断静脉回流的疗效。方法：2008年3月-2013年2月收治指尖离断患者80例,38例吻合指侧方静脉重建回流,术中吻合动静脉比例1：1或1：2或2：2,平均1：2;22例吻合指腹静脉重建回流,术中吻合动静脉比例1：1;20例未吻合静脉,术中仅吻合1条动脉,行侧切口或甲床放血。观察各组治疗效果。结果：吻合指侧方静脉组手指全部成活,无一例发生回流障碍;吻合指腹静脉组19例发生静脉危象,其中4例手指坏死;未吻合静脉组20例均发生回流障碍,其中6例手指坏死。58例获随访,随访时间6~28个月。吻合指侧方静脉组32例,指尖外形佳、指腹饱满;吻合指腹静脉组14例,指体轻度萎缩,指甲生长不平整;未吻合静脉组12例,指体萎缩明显。吻合指侧方静脉组指甲生长近平整,长度长于其他两组[（14.4±3.2）mm比（12.5±2.3）mm和（12.2±2.2）mm],远侧指间关节活动度大于其他两组[（63±5）°比（48±3）°和（45±7）°],两点分辨觉小于其他两组[（4.6±0.4）mm比（7.1±1.2）mm和（7.3±0.6）mm],感觉级别高于其他两组[S（3.45±0.39）级比S（2.57±0.42）级和S（2.55±0.49）级],差异均具有显著性（P〈0.05）。吻合指腹静脉组和未吻合静脉组在指甲长度、运动和感觉方面差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：吻合指侧方静脉能有效解决指尖再植静脉回流问题,可避免回流障碍,成活率高,促进指甲生长,可恢复 DIPJ 活动度及感觉。     

胫骨干骨折的手术治疗对策

目的：明确不同固定器械在胫骨干不同骨折类型固定中的特点，以指导临床应用。方法：68例胫骨干骨折，行加压钢板螺钉、交锁髓内钉、单侧外固定架固定后，作临床疗效分析。结果：加压钢板固定组42例，感染5例，骨不连1例，平均愈合时间3．8个月；交锁髓内钉固定组13例，无感染及骨不连，平均愈合时间5．4个月；单侧外固定架组13例，骨不连1例，踝关节背伸受限3例，平均愈合时间4．5个月。结论：胫骨骨折交锁髓内钉固定并发症少，功能恢复好，适用范围广，但要注意及时进行动力加压。加压钢板及外固定架固定应选择各自的最佳适应证，以达到理想的疗效。