肿瘤坏死因子α和血管紧张素Ⅱ诱导血管内皮细胞组织因子基因表达及其机制的研究

目的；研究肿瘤坏死因子α（TNFα），血管紧张素Ⅱ（AngⅡ)对内皮细胞组织因子（TF）表达的影响，并探讨TF基因5‘上游序列在TNFα，AngⅡ诱导内皮细胞该基因转录中的调控作用。方法：应用细胞原位杂交技术检测TF mRNA水平。采用基因重组技术构建含有人TF基因不同上游序列荧光毒酶报告基因质粒，经脂质体法转染内皮细胞，检测及分析报告基因活性。结果：TNFα和AngⅡ均可以诱导内皮细胞TF mRNA的表达增强。在TF基因上游序列－244／＋121bp存在时，TNFα，AngⅡ均可使转梁内皮细胞荧光素酶表达量明显增加，而在－111／＋121bp存在时TNFα，AngⅡ组与对照组荧光素酶表达量均无明显差异，而且较－244／＋121bp存在时荧光素酶表达量明显降低。结论：TF基因上游－244／－112bp序列的存在对TNFα，AngⅡ诱导内皮细胞TF基因表达起重要的调节作用。     

二氧化硅活化巨噬细胞中早期生长反应因子-1及其信号转导通路的研究

目的 探讨早期生长反应因子(Egr-1)及其信号转导在矽肺发生发展中的作用。方法用细胞免疫荧光、原位杂交方法检测二氧化硅(SiO2)刺激后Egr-1的表达定位,用报道质粒及EMSA检测其活性改变;用激酶活性分析法检测si0：刺激巨噬细胞后ERK1／2活性改变,进一步用激酶抑制剂初步探讨SiO2活化Egr-1的信号转导通路。结果SiO2刺激RAW264．7细胞短时间Egr-1核蛋白表达及转录因子明显增加;且在处理后30～60min,Egr-1核蛋白结合活性明显升高(为未处理组的20倍);在刺激后15min ERK1／2活性开始升高,30min达高峰(活性为对照组的29倍)而后渐降至基础水平;进一步用激酶阻断发现,Egr-1 mRNA及蛋白表达均减少。结论SiO2能激活巨噬细胞中Egr-1,且此过程可能由ERK1／2、p38介导,提示SiO2-ERK1／2、p38-Egr-1通路可能在矽肺发生发展过程中起重要作用。     

转录因子Sp1和Sp3对食管癌细胞ezrin基因的表达调控作用

目的:明确转录因子Sp1和Sp3对食管癌细胞ezrin基因的表达调控作用.方法:将转录因子表达载体CMV-Sp1和CMV-Sp3分别转染食管癌EC109细胞,采用定量RT-PCR和Western blot技术检测过表达转录因子Sp1和Sp3对ezrin mRNA和蛋白表达的影响;将ezrin基因启动子驱动的报告基因表达载体与内参照质粒pRL-TK和转录因子表达载体共转染EC109细胞,采用双荧光素酶报告基因分析系统检测转录因子Sp1和Sp3对ezrin基因启动子的激活作用以及这种激活作用是否依赖于ezrin基因的Sp1结合位点-75/-69.结果:过表达转录因子Sp1和Sp3显著提高EC109细胞ezrin mRNA和蛋白表达水平以及启动子活性.Sp1和Sp3增强ezrin基因启动子活性的作用位点不同,只有Sp1通过-75/-69位点调控ezrin基因启动子活性.结论:转录因子Sp1和Sp3可调控EC109细胞ezrin基因的表达.     

丹参提取物单体对肿瘤坏死因子诱导内皮细胞组织因子表达的干预作用

研究丹参提取物单体(764—3)对肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF—α)诱导人血管内皮细胞(human vascular endothelial cell，HUVEC)组织因子(tissue factor，TF)基因表达的干预作用，及其对单个内皮细胞胞内游离钙([Ca^2 ]i)水平的影响，以探讨764．3对心血管血栓栓塞性疾病防治的可能机制。进行人脐静脉原代内皮细胞、ECV304细胞株的培养。采用限制性内切酶法，构建含有人TF基因不同上游调控序列的荧光素酶报告基因质粒，经脂质体法转染内皮细胞，用TNF—α及764-3处理内皮细胞，测定细胞裂解物荧光素酶及β半乳糖苷酶活性。以Fluo3／AM为荧光指示剂，用激光扫描共聚焦显像系统观测[Ca^2 ]i的改变。结果发现在TF基因上游序列-244／ 121bp存在下，TNFα可使转染内皮细胞荧光素酶表达量比对照组明显增加，764-3使这种增加有所降低。而-111／ 121bp存在时，TNF—α组与对照组荧光素酶表达量无明显差异，均比-244／ 121bp存在时明显降低，此时，764-3并未引起荧光素酶表达量明显改变。激光扫描共聚焦显像显示，TNF—α可引起人内皮细胞[Ca^2 ]i持续缓慢升高，加入7643后[Ca^2 ]i迅速大幅度降低，逐渐恢复到基线水平。提示764—3可抑制TNF—α诱导的人内皮细胞TF基因表达增强，这种作用依赖于该基因上游序列-244／ 121bp的存在，推测胞内游离钙离子可能参与此抑制作用。     

肿瘤坏死因子α和血管紧张素Ⅱ诱导血管内皮细胞组织因子基因表达及其机制的研究

目的:研究肿瘤坏死因子α(TNFα)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对内皮细胞组织因子(TF)表达的影响,并探讨TF基因5’上游序列在TNFα、AngⅡ诱导内皮细胞该基因转录中的调控作用。方法:应用细胞原位杂交技术检测TFmRNA水平。采用基因重组技术构建含有人TF基因不同上游序列荧光素酶报告基因质粒,经脂质体法转染内皮细胞,检测及分析报告基因活性。结果:TNFα和AngⅡ均可以诱导内皮细胞TFmRNA表达增强。在TF基因上游序列-244/+121bp存在时,TNFα、AngⅡ均可使转染内皮细胞荧光素酶表达量明显增加,而在-111/+121bp存在时TNFα、AngⅡ组与对照组荧光素酶表达量均无明显差异,而且较-244/+121bp存在时荧光素酶表达量明显降低。结论:TF基因上游-244/-112bp序列的存在对TNFα、AngⅡ诱导内皮细胞TF基因表达起重要的调节作用。     

内皮细胞应力反应元件的研究进展

内皮细胞能对力学刺激发生反应,流体切应力能直接调节内皮细胞基因的表达,现已发现内皮细胞内受切应力调节的基因有20多种。目前认为其调节机制是通过存在于基因的启动子内并且能够被切应力所诱导的启动基因转录的顺式调控元件－－应力反应元件来调节基因的转录。目前已知的应力反应元件至少涉及4种转录因子的结合位点及10余种受切应力调控的相关基因。这4种转录因子分别是：（1）NF－κB;（2）AP－1;（3）Egr-1和（4）SP1。对应力反应元件的基序及基序结合蛋白的鉴定有待进一步的深入,以后还可能有效的应力反应元件被发现。在采用基因疗法来调控血管壁不同区段基因表达这方面已进行了有益的探索,显示出良好的前景。     

二氧化硅活化巨噬细胞中核转录因子早期生长反应基因-1的表达

目的 研究二氧化硅(SiO2)刺激的巨噬细胞中核转录因子早期生长反应基因-1(early growth response gene-1,Egr-1)表达和定位分布的动态变化,探讨Egr-1在硅沉着病发病机制中的作用。方法 用免疫组织化学方法观察大鼠实验性硅沉着病组织中肺巨噬细胞Egr-1表达的动态变化;用逆转录-聚合酶链反应(RT—PCR)、Western印迹和免疫荧光方法分别检测体外SiO2刺激的巨噬细胞系RAW264．7中Egr-1 mRNA、蛋白表达及其定位。结果 大鼠实验性硅沉着病中肺巨噬细胞Egr-1表达明显上调,阳性反应强度在14d时达到高峰。体外SiO2作用RAW264．7细胞15～240min,Egr-1 mRNA表达均明显增高,峰值位于15min,480min时仅微量表达。Egr-1蛋白于60min时核移位最明显,持续至120min,随后减少;在60～120min时间内,Egr-1核蛋白及总蛋白的表达量亦达峰值,其后开始下降。结论 SiO2能激活巨噬细胞中核转录因子Egr-1,提示Egr-1可能在硅沉着病的发生发展中起重要的调控作用。     

Ⅰ型胶原基因启动子研究进展

Ⅰ型胶原由α1(Ⅰ)链(COL1A1)与α2(Ⅰ)链(COL1A2)组成,人COL1A1与COL1A2基因的启动子都已鉴定并克隆.调节转录的核因子有Sp1、NF-1、AP-1、CBF、NF-κB、C-myb、c-Krox、BFCOL1、Zf9、Sp3、Smads、TGP、Egr-1、TWIST与NP/NMP4等.在COL1A1和/或COL1A2基因启动子上已鉴定出TGFβ、糖皮质激素、TNFα、IFNγ与视黄酸等的应答元件.     

I型胶原基因启动子研究进展

I型胶原由 α1(I)链 (COL1A1)与 α2 (I)链 (COL1A2 )组成 ,人 COL1A1与 COL1A2基因的启动子都已鉴定并克隆。调节转录的核因子有 Sp1、NF- 1、AP- 1、CBF、NF- кB、C- myb、c- Krox、BFCOL1、Zf9、Sp3、Smads、TGP、Egr- 1、TWIST与 NP/ NMP4等。在 COL1A1和 /或 COL1A2基因启动子上已鉴定出 TGFβ、糖皮质激素、TNFα、IFNγ与视黄酸等的应答元件     

硫代磷酸酯寡核苷酸的合成及其对内皮细胞组织因子(Tissue factor,TF)基因表达及TF促凝活性的作用

为合成与 TF基因启动子区切应力反应元件 ( Shear stress responsive element,SSRE)形成三链 DNA的硫代磷酸酯寡核苷酸 ( Triple helix- forming phosphorothioate oligodeoxynucleotides,TFO- ps) ,探讨其对内皮细胞TF基因表达及 TF促凝活性的影响。我们设计反向 TFO ( T2 1GTa)序列 ,采用固相亚磷酰胺三酯固相法合成TFO。在 TFO的 3′末端进行硫代磷酸酯修饰。应用电泳迁移分析 ( Electrophoretic mobility shift assays,EMSA)观察寡核苷酸和硫代脱氧寡核苷酸的亲和性。在 ECV3 0 4内皮细胞株观察 γ- 32 P标记硫代磷酸酯 TFO的细胞摄取及其对 TF基因表达的影响。结果显示 ,TFO- ps( T2 1Gta- ps)与靶序列能形成三链 DNA,其 Kd值为 3 .6× 10 - 1 0 M。在内皮细胞株 ECV3 0 4细胞 ,TFO- ps( T2 1GTa- ps)的细胞吸收率为 11.65 % ,主要分布在核沉淀 ,约占吸收总量的77.2 5 % ,显著降低内皮细胞 TF基因 m RNA表达及 TF蛋白合成的平均光密度 ( AOD)值 ,显著降低 TF的促凝活性。以上结果表明 ,TFO- ps( T2 1GTa- ps)具有较好的抗凝活性 ,其机制与抑制 TF基因表达有关     

流体剪应力对EA.Hy926细胞IL-8受体mRNA表达的影响

为研究EA．Hy926细胞在不同时间、不同大小流体剪应力作用下IL-8受体CXCR1、CXCR2 mRNA的表达规律,通过体外培养人脐静脉内皮细胞株EA．Hy926细胞,分别施加5．56、10．02、15．27 dyn／cm2三种剪应力,选取剪切5 min、10 min、15 min、20 min、25 min和30 min、1、2、4和8 h等10个时间点进行观测,以半定量RT- PCR方法检测IL-8受体mRNA表达变化。结果表明,在5．56 dyn／cm2剪应力作用下,与静止组相比,各时间点CXCR1 mRNA与CXCR2 mRNA表达均显著升高(P<0．05)。在10．02 dyn／cm2剪应力作用下,CXCR1 mRNA表达随时间相对缓慢下降;而CXCR2 mRNA表达在30min出现短暂的升高,然后随着作用时间的延长开始缓慢下降。在15．27 dyn／cm2剪应力作用下,其CXCR1、CXCR2 mRNA的表达随时间呈现较显著性降低(P<0．01),当持续作用4 h以上其CXCR2 mRNA表达极低。以上结果表明,不同强度、作用时间的流体剪应力参与调节IL-8受体表达。     

层流剪应力对内皮细胞IL-8受体CXCR1表达的影响

为研究内皮细胞在不同时间、不同大小层流剪应力作用下IL-8受体CXCR 1的表达规律,通过体外培养人脐静脉内皮细胞株EA.Hy926细胞,分别施加5.56、10.02、15.27 dyn/cm2三种剪应力,选取剪切1、2、4和8 h等4个时间点进行观测,Western blot检测IL-8受体CXCR 1表达变化。结果表明,在5.56 dyn/cm2剪应力作用下,与静止组相比,CXCR 1表达随作用时间的增加而显著升高(P<0.01),至4h达到最大值,为对照组的2.2倍。在10.02dyn/cm2剪应力作用下,CXCR 1的表达随剪应力作用时间而相对缓慢增加,但仍高于对照组(P<0.05)。在15.27dyn/cm2剪应力作用下,其CXCR 1的表达随时间呈现较显著性降低(P<0.01),当持续作用8 h,其CXCR 1的表达为对照组62.59%。以上结果表明,不同强度、作用时间的层流剪应力参与调节IL-8受体CXCR 1的表达。     

流体切应力对人内皮细胞迁移和整合素基因表达的影响

目的研究流体切应力空间梯度和均匀切应力对内皮细胞（ECs）迁移和整合素基因表达的影响，为阐明应力诱导血管重建的分子机制提供一些实验依据。方法将脐静脉内皮细胞置于平行平板流动腔系统，分别施加11dyn／cm^2的均匀切应力（矩形组）和5～14dyn／cm^2的切应力梯度（梯度组）为受力组，以静态条件下培养的ECs为对照组（静止组）。Transwell方法检测切应力对ECs迁移能力的影响；半定量RT-PCR测定ECs整合素α3β1、α5β1mRNA3、6和12h的表达情况。结果①同静止组相比，切应力梯度组ECs3h的迁移（88±4 vs 23±3，P〈0．01，n=3）能力显著提高；而均匀切应力组ECs3h迁移（21±3VS23±3）同静止组相比，差异无统计学意义（P〉0．05，n=3）；②ECs受切应力梯度作用3h即可诱导ECs整合素α3β1、α5β1mRNA表达（P〈0．01，P〈0．05）；均匀切应力于6h激活ECs整合素理，亚型表达（P〈0．01），α3 、β1亚型表达延迟到12h激活（P〈0．01）。结论切应力通过上调整合素基因表达促进了ECs迁移，提示整合素信号通路参与了切应力条件下ECs迁移过程的信号转导。     

Endothelialization of PTFE vascular grafts under flow induces significant cell changes

BACKGROUND: To minimize thrombogeneity of small diameter PTFE grafts they are usually coated in vitro with endothelial cells under static culture conditions. The disadvantage of this technique is that a cell layer is formed that fails to withstand shear stress typical in normal blood flow. METHOD: Since the in vivo functional and structural status of endothelial cells correlates with the applied shear stress, we developed a computer-controlled perfusion system to seed and culture cells on PTFE-grafts up to a confluent monolayer under the influence of increasing shear stress. The confluence of endothelial coating was defined by immunohistological staining of cross sections, and by upper light microscopy of flattened graft samples. In addition, the expression of fibronectin as an important adhesion molecule was estimated. RESULTS AND DISCUSSION: The application of pulsatile shear stress (6.6 dyn/cm2, 5 min) to grafts endothelialized under perfusion (n = 7) did not lead to a disruption of the confluent cell layer. In contrast, a 5 min long shear stress of 3 dyn/cm2 was sufficient to wash more than 50% of cells off the PTFE-graft cultured under static conditions (n = 6). The perfusion cultures showed a significantly higher proliferation rate in comparison with static cultures. This effect was reproducibile in both serum-containing and serum-free culture media. The expression of fibronectin by endothelial cells was significantly higher in the perfused graft compared to the static one. These results suggest the practicability of endothelialized PTFE vascular grafts, preconditioned to shear rates similar to the in vivo situation, as an alternative bypass material in cardiac surgery.     

流体切应力梯度对血管内皮细胞排列和形状的影响

目的研究不同梯度切应力作用下,血管内皮细胞(endothelial cells,ECs)排列和形状变化,旨在了解流体切应力梯度对ECs形态的影响,为进一步探讨其功能变化提供实验基础。方法建立可对体外培养ECs施加梯度切应力的流动腔装置,并应用该装置对人脐静脉ECs加载了大小在15dyn/cm2～6.6dyn/cm2(1dyn=10-5N)范围、梯度分别为1.5dyn/cm2和3dyn/cm2的切应力,加载时间均为6h。比较这两种不同切应力梯度对ECs的细胞方向角、细胞宽长比和细胞形态指数的影响。结果在不同切应力梯度作用下,ECs的细胞方向角分布散乱,细胞无排列规律。与3dyn/cm2相比,1.5dyn/cm2切应力梯度下ECs的宽长比和细胞形态指数明显减少,趋向于拉伸状态。结论在不同切应力梯度作用下,ECs均排列紊乱,无规律可循。然而,在相对较小的切应力梯度作用下,细胞容易被拉伸,细胞形状趋向于伸长,而较大切应力梯度作用下,细胞形状则趋向于圆形。     

Intermittent short-duration exposure to low wall shear stress induces intimal thickening in arteries exposed to chronic high shear stress

We sought to determine whether intermittent short-duration exposure to low wall shear stress could induce intimal thickening in arteries chronically exposed to high shear stress. An arteriovenous fistula (AVF) was created between the left common carotid artery and the corresponding external jugular vein in 20 Japanese white male rabbits. After 4 weeks, blood flow was increased 10-fold to 182 +/- 39 ml/min and shear stress was increased to 33.4 +/- 13 dyn/cm(2). The AVF was then occluded for 1 h by finger compression with an 85% reduction in carotid artery blood flow (27 +/- 7 ml/min) and a reduction in wall shear stress to 4.9 +/- 1.7 dyn/cm(2) (P < 0.0001). Release of finger compression restored flow to the AVF and high shear stress to the carotid artery. This procedure was repeated at weekly intervals with a cumulative total of 4 h of low shear stress exposure. Arteries exposed to intermittent low shear stress developed a layer of intimal thickening which consisted of 3-4 layers of smooth muscle cells lined with thin elastic fibers and medial hyperplasia. Control arteries exposed to 8 weeks of continuous high shear had no intimal thickening. Transient exposure to low shear stress upregulated TGF-beta1, MMP-2, -14, and TIMP-2 gene expression while MMP-9 expression was downregulated. We conclude that repeated, intermittent short-duration exposure to low shear stress in the setting of high flow and high shear stress can induce arterial intimal thickening. Short-duration alterations in hemodynamic forces can induce rapid vascular cell message expression, which may effect arterial remodeling. This experiment suggests that a threshold value of 5 dyn/cm(2) may be needed in order to initiate and sustain the intimal thickening response.     

流体切应力作用时间对内皮细胞IL-8 基因表达的影响

内皮细胞对力学环境变化敏感，流体切应力可以直接调节内皮细胞基因的表达。为阐明内皮细胞白细胞介素-8（IL-8）基因的表达除受化学因子的调节外还受力学因素的影响，本文用流体切应力（2.23、4.20、6.08dyne/cm^2）处理培养的人脐静脉内皮细胞，然后采用定量RT-PCR的方法检测内皮细胞IL-8基因的表达情况。结果显示：未用切应力处理的内皮细胞没有IL-8基因的表达；切应力处理内皮细胞后，1h IL-8mRNA表达增加，2hIL-8mRNA表达量至最高值，3hIL-8mRNA表达量开始下降，4h后IL-8mRNA持续低表达；各实验组（2.23、4.20、6.08dyne/cm^2）均表现出相同的IL-8mRNA随时间的变化规律。提示流体切应力确可诱导内皮细胞表达IL-8，而且IL-8的表达量与切应力作用时间有关，呈双相性变化。流体切应力诱导内皮细胞表达IL-8，可能在急性炎症和动脉粥样硬化的发生、发展过程中具有重要作用。     

流体切应力强度对内皮细胞IL-8基因表达的影响

内皮细胞位于血流与血管之间，内皮细胞调控的机械力相关反应已成为正常血管反应的一部分。切应力在调节内皮细胞功能上具有重要作用。流体切应力可以直接调节内皮细胞基因的表达，其中包括诱导内皮细胞表达IL－8，而且IL－8的表达量与切应力作用时间有关。 为阐明内皮细胞IL－8基因的表达除了与切应力的作用时间有关外还与切应力的强度有关，我们用不同强度的流体切应力（2．23、4．20、6．08、8．19、9．67、12．15、14．40、16．87、19．29dyne/cm^2）处理培养的人脐静脉内皮细胞，然后采用定量RT－PCR的方法检测内皮细胞IL－8 基因的表达情况。结果显示：未用切应力处理的内皮细胞没有IL－8基因的表达，切应力处理内皮细胞后，低切应力（2．23dyne/cm^2）时IL－8mRNA表达量明显增加为高切应力（19．29dyne/cm^2）时IL－8mRNA表达量的约68（作用1小h）或52倍（作用2h）。IL－8mRNA的表达量与内皮细胞所施加的切应务强度呈反变关系，直线回归方程，1h时为y=7.57-0.11x，相关系数r=7.97;2h时为y=7.92-0.10x，相关系数r＝0．96。式中：y为切应力作用下内皮细胞IL－8mRNA的表达量（拷贝数的对数值）；x为施加于内皮细胞的切应力强度（dyna/cm^2)。不同的切应力作用时间（1h,2h）均表现出相同的IL-8mRNA随切应力强度的变化规律。提示流体应力诱导内皮细胞表达IL－8，不仅与切应力的作用时间有关，而且IL－8的表达量与切应力强度有关。流体切应诱导内皮细胞IL－8mRNA的表达急剧增高，可能在炎症机制和动脉粥样硬化的发生、发展过程中具有重要作用。     

The effect of gradually graded shear stress on the morphological integrity of a huvec-seeded compliant small-diameter vascular graft

The premature endothelialization of tissue-engineered grafts had often induced cellular detachment at an early period of implantation in arterial circulation, resulting in occlusion at an early period of implantation. This study was aimed to determine whether gradually increased shear stress applied ex vivo improves cell retention and tissue morphological integrity including cell shape and alignment, actin fiber alignment and expression of vascular endothelial (VE) cadherin. Tissue-engineered grafts used for this study were human umbilical vein endothelial cell (HUVEC)-seeded compliant small-diameter grafts made of poly(L-lactide-co-epsilon-caprolactone) fiber meshes fabricated by electrospinning. The shear stresses applied to grafts, generated using a custom-designed mock circulatory apparatus, were 3.2, 8.7 and 19.6 dyn/cm(2). The grafts completely monolayered prior to shear stress exposure exhibited a polygonal cobblestone morphology with randomly distributed actin fibers and VE cadherin at the continuous peripheral region of adjacent cells. The 24-h-loading of high shear stresses (8.7 and 19.6 dyn/cm(2)) equivalent to those of the arterial circulatory system resulted in severe cellular damage resulting in the complete loss of cells. However, a gradually increased graded exposure from a low (3.2 dyn/cm(2)) to a high shear stress (19.6 dyn/cm(2)) resulted in a markedly reduced cell detachment, a highly elongated cell shape, and orientation or alignment of both cells and actin fibers, which were parallel to the direction of flow. Although VE-cadherin expression was not detected yet, a higher degree of tissue integrity was achieved, which may greatly improve the performance particularly at an early period of implantation.