小鼠釉基质丝氨酸蛋白酶基因打靶载体的构建及鉴定

目的：对牙釉质丝氨酸蛋白酶（EMSP1）基因 进行体外扩增，构建基因打靶载体，利用基因打靶技术建立转基因动物模型，研究EMSP1生理功能和病理学意义。方法：根据EMSP1的DNA序列，采用Oligo 6.0软件设计两对引物，以129品系小鼠基因组DNA为模板，分别扩增长为5 000 bp和1 700 bp片段作为同源长短臂。将其分插入通用型基因敲除载体pSSC-9的正向筛选基因neo两侧，用PCR方法、限制性酶切DNA 序列分析进行鉴定。结果：采用双酶切鉴定，阳性重组克隆分别切出5000 bp和1700 bp片段，表明长短臂已克隆于载体中。DNA序列分析表明，成功构建 EMSP1基因打靶载体pSSC-9- EMSP1。结论：成功构建小鼠EMSP1基因打靶载体。     

结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3的基因克隆及生物信息学分析

目的 构建结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3原核表达载体,获得Hsp 16.3蛋白,并应用生物信息学软件,分析结核分枝杆菌小分子热休克蛋白16.3(Hsp16.3)的多种蛋白质性质,以及获取该基因的相关信息.方法 以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增Hsp 16.3基因,PET28a为载体,构建重组质粒PET28a-Hsp16.3并表达,利用Pmtparam、Protseale、HMMTOP、TMHMM、GOR4、ProtFun 等软件预测和分析结核分枝杆菌小分子热休克蛋白16.3的氨基酸组成、理论等电点、结构域、活性位点、疏水性、跨膜区、糖基化位点、磷酸化位点、二级结构及系统进化分析.结果 成功构建了Hsp16.3原核表达载体PET28a-Hsp16.3,并在宿主菌BL21(DE3)中表达.推测结核分枝杆菌小分子热休克蛋白16.3白分子式为C716H1131N197O225S4,分子量为16227.2,理论等电点为5.00.该蛋白氨基酸序列中含有α-螺旋(Alpha helix)46处,延伸链(Extended strand)25处,无规则卷曲(Random coil)73处及5个磷酸化位点;4个O-糖基化位点;1个前肽裂解预测位点.结论 Hsp16.3基因克隆入宿主菌中并成功表达;该蛋白推测是一个亲水性不稳定蛋白,无跨膜区,可能参与重要的能量代谢及免疫反应.     

卡介苗ERP基因置换型打靶载体的构建

目的：构建ERP基因打靶载体。方法：卡介前菌体外培养,扩增ERP基因两侧序列．连接载体与目的片段．筛选阳性克降并鉴定。结果：PCR扩增捕入片段大小与预期相符．鉴定证实PCR产物及插入片段为所需目的基因片段。结论：成功构建了用于卡介苗菌基因打靶的置换型载体,为今后构建ERP基因敲除株的卡介苗突变株的研究奠定基础。     

小鼠性激素结合球蛋白条件基因打靶载体的构建

目的构建小鼠性激素结合球蛋白(Shbg)条件基因打靶载体。方法运用ET克隆的方法构建Shbg基因第4-7号外显子两侧插入loxp位点的条件性剔除载体。首先以BAC DNA为模板克隆出Shbg及其上、下游基因并打靶质粒载体(p BR322-MKAB),利用该质粒和BAC克隆,通过同源重组方式,获得套取质粒(p BR322-Shbg-Re);再分别以PL452及PL451为模板扩增出含Neo片段,经过再一轮的Red/ET重组成功实现条件性基因敲除打靶载体(p BR322-MK-SHBG-cko)的构建。结果经多个限制性内切酶酶切鉴定和测序证实,构建的p BR322-MK-AB、p BR322-Shbg-Re、SHBG-Ln重组质粒和Shbg条件基因打靶载体(p BR322-MK-SHBG-cko)结构正确,与设计相符。结论成功构建了小鼠Shbg条件基因打靶载体,为后续Shbg基因条件敲除小鼠模型的构建奠定了基础。     

弓形虫膜抗原SAG3基因打靶载体构建方法探讨

目的 探讨构建弓形虫膜抗原SAG3基因打靶载体的方法，为建立基因敲除弓形虫基因突变株打下基础。方法 用PCR方法扩增弓形虫SAG3基因同源序列，将所获得的1．53kb和2．81kb序列连接克隆插入TUB5／CAT质粒中，构建置换型打靶载体，采用PCR扩增、酶切分析鉴定。结果 将SAG3基因中1．53kb和2．81kb两个同源序列分别插入TUB5／CAT质粒中，构建了弓形虫RH株5’SAG3-TUB5／CAT-3’SAG3置换型载体，经鉴定所获得的打靶载体结构准确。结论 建立了弓形虫膜抗原SAG3基因打靶载体，并获得了弓形虫RH株SAG3基因置换型打靶载体，为分析弓形虫基因功能提供了可行的方法。     

小鼠β2m基因打靶载体的构建及序列分析

目的 采用分子生物学技术，构建小鼠β2m基因打靶载体，为进一步进行胚胎干细胞基因敲除、建立β2m基因缺陷型干细胞奠定基础。方法 通过设计和合成引物，经PCR从小鼠β2m-pSV2ΔHXgpt基因组克隆分别扩增小鼠β2m的4.2kb和0.8kb片段作为同源臂，将其分别插入载体pPNT的neo基因两侧，构建小鼠β2m基因替换型打靶载体pPNT-β2m。结果 经过PCR、限制性酶酶切鉴定，以及DNA序列分析，证实此两条同源臂为包含小鼠β2m前三个外显子在内的基因片段，证明载体构建成功。结论 PCR法构建基因打靶载体是新颖、简便而可靠的方法。     

基因打靶置换型载体的构建和应用研究

目的：构建针对小鼠凝血因子Ⅸ基因的基因打靶置换型载体，并用于小鼠胚胎干细胞基因打靶研究。方法：在用噬斑原位杂交法克隆ｍＦⅨ基因组ＤＮＡ并完成结构分析的基础上，利用常规的分子克隆技术，设计并构建置换型载体，经过限制性内切酶酶切鉴定和ＰＣＲ鉴定其正确后，用电穿孔法对体外培养的小鼠胚胎干细胞Ｒ１株进行基因转移，经Ｇ４１８／ＧＡＮＣ分组药物选择，进行ｐＭＦⅨＤＥＬ载体的应用研究。结果：构建获得包括正负双向     

青蒿鲨烯合酶基因打靶研究

目的通过代谢途径工程调整代谢流向,试图增大转基因青蒿Artemisia annua植株中的青蒿素产量。方法利用青蒿鲨烯合酶(SS)基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因和胞嘧啶脱氨酶(CodA)基因构建基因打靶载体,并通过冻融法将载体导入根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens。以叶盘法转化青蒿,采用"分段选择法"筛选转基因再生植株。结果对表达GFP基因后发出绿色荧光的转基因植株,采用PCR及PCR产物杂交法,在1棵转基因植株中检测到外源GFP基因,而未检测到内源SS基因。初步证据显示,在转基因青蒿植株中,突变型SS基因已取代野生型SS基因。结论青蒿鲨烯合酶基因打靶已取得初步成功。     

小鼠Pkhd1条件性基因打靶载体的构建

目的构建小鼠Pkhd1条件性基因打靶载体,为建立Pkhd1条件性敲除小鼠模型奠定基础。方法以正常小鼠(129xl/SvJ)基因组DNA为模板,扩增小鼠包括第6号外显子的Pkhd1基因部分序列,通过引入LoxP和Neo基因等步骤,建立条件性敲除Pkhd1第6号外显子的条件性基因打靶载体。结果经多个限制性核酸内切酶酶切鉴定和测序证实,构建的小鼠Pkhd1基因条件性打靶载体符合设计要求。结论成功构建了小鼠Pkhd1条件性基因打靶载体,为建立Pkhd1基因条件性敲除小鼠打下了基础。     

卡介苗热休克蛋白16.3基因的克隆与原核表达

目的 克隆卡介苗(BCG)的热休克蛋白16.3基因(hsp16.3),并在大肠杆菌中表达.方法 利用PCR技术从BCG中扩增hsp16.3基因,并将其克隆到质粒pProEX HTb中,进行测序.将得到的重组表达质粒pProEX HTb-hsp16.3在大肠杆菌BL21中进行表达.结果 成功地克隆了BCG hsp16.3基因.经DNA测序证实,与Gen Bank公布的序列一致.含pProEX HTb- hsp16.3重组质粒的大肠杆菌BL21经诱导后,能够表达相对分子质量约为16KDa的融合蛋白.结论 获得了BCG hsp16.3基因,成功构建原核表达质粒pProEX HTb- hsp16.3,并在大肠杆菌得到高效表达.     

人热休克蛋白90β基因沉默质粒的构建及转染效率的观察

目的:构建能表达小发夹RNA,从而特异、有效抑制人Hsp90βmRNA水平的质粒,比较该质粒对不同细胞株的转染效率。方法:合成3条对应于靶基因3个区域的64nt寡聚核苷酸,插入pSUPEREGFP1质粒,用DH5α细菌扩增,用酶切和测序法鉴定。以绿色荧光蛋白表达为标记,比较不同比例脂质体和质粒条件下,HepG2、HUVEC、HeK2933种细胞株的转染效率。结果:构建的pSuper-Hsp90β1、pSuper-Hsp90β2、pSuper-Hsp90β33个重组沉默质粒,插入片段碱基完全正确。在相同条件下,所构建的质粒对HeK293细胞转染效率最高,HepG2细胞最低。结论:利用pSUPER质粒可成功构建人Hsp90β基因沉默质粒,该质粒对细胞株的转染效率可因细胞的不同而有显著差异。     

Construction and application of gene targeting replacement vector for mouse coagulation factor IX gene

Embryonicstem(ES)cellgenetargetingisoneofthemostwidelyusedbiotechniquesinmodernbiology.BasedonthehomologousrecombinationbetweentheendogenoushomologoussequencesandthegenomicDNAfragmentsinthevectorintroducedintoEScells,genetargetingallowsprecise,predeterminedchangesormodificationofthestructureorcontentsofthehostgenometobemade[IJ.ThephenotypiceffectsofthetargetedmodificationalsocanbeexpressedonwholeanimalbyES--blastocysttransferringandchimericbreedingprocedures.Theconstructsoftargetingvectori…     

GM-CSF与BZLF1融合基因修饰的重组BCG的构建与表达

目的将人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因(GM-CSF)与EB病毒即刻早期基因(BZLF1)重组为融合基因GCBF,并转化入卡介苗(BCG)中进行表达。方法用随机引物Oligo(d T)15进行RT-PCR,分别获得人GM-CSF和BZLF1编码序列的c DNA。将纯化GM-CSF和BZLF1 PCR扩增产物插入分泌表达载体p MV261,并转化入感受态细胞Escherichia coli DH5α(E.coli DH5α),在LB培养基上进行卡那霉素抗性选择,测序正确的序列进行剪接式重叠延伸,将目的基因GM-CSF和BZLF1编码经多肽接头(Gly4Ser)3序列连接,构建融合基因GCBF,将GCBF克隆至p MV261,转化感受态细胞E.coli DH5α,在LB培养基平板上进行卡那霉素抗性选择,阳性克隆提取质粒后转化感受态BCG,western-blot检测GCBF在r BCG中的表达。结果目的基因GM-CSF和BZLF1 RT-PCR产物大小分别为461 bp和788bp,与预期值一致。构建的重组质粒经双酶切、扩增及测序鉴定证实,融合基因GCBF(1209bp)正确插入载体,成功转化入BCG感受态细胞,且被正确表达。结论融合基因GCBF修饰的r BCG构建及表达成功,为进一步探讨r BCG杀伤EB病毒阳性肿瘤的免疫活性研究奠定了实验基础。     

携带人脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶( APE1)基因重组慢病毒载体的构建及体外表达检测

目的:构建携带人脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶-1 (Apurinic/apyrimidinic endonuclease-1,APE1)基因重组慢病毒载体内英文摘要中,并检测其体外表达目的基因的水平.方法:应用基因克隆技术将人APE1基因克隆入慢病毒载体LV中,经过PCR、酶切和测序鉴定后,与包装四质粒系统共转染293T细...     

Construction, Expression and Identification of a Recombinant BCG Vaccine Encoding Human Mycobacterium Tuberculosis Heat Shock Protein 65

Heat shock protein 65 (HSP65) is one of the most important protective immunogens against the tuberculosis infection. The signal sequence of antigen 85B and the whole HSP65 DNA se-quence of human Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) were amplified from BCG genome and plasmid pCMV-MTHSP65 respectively by polymerase chain reactions (PCR). These two se-quences were cloned into the plasmid pBCG-2100 under the control of the promoter of heat shock protein 70 (HSP70) from human M. tuberculosis, yielding the prokaryotic shuttle expression plas-mid pBCG-SP-HSP65. Results of restriction endonuclease analysis, PCR detection and DNA se-quencing analysis showed that the two cloned DNA sequences were consistent with those previously reported, and the direction of their inserting into the recombinant was correct and the reading frame had been maintained. The recombinants were electroporated into BCG to construct the recombinant BCG vaccine and induced by heating. The induced expression detected by SDS-PAGE showed that the content of 65 kD protein expressed in recombinant BCG was 35.69% in total bacterial protein and 74.09% in the cell lysate supernatants, suggesting that the recombinant HSP65 gene could express in BCG with high efficiency and the expressed proteins were mainly soluble. Western-blot showed that the secretive recombinant proteins could specifically combine with antibody against M.tuberculosis HSP65, indicating that the recombinant proteins possess the biological activity of HSP65.     

核干细胞因子基因siRNA表达载体的构建及鉴定

目的 构建针对核干细胞因子(NS)基因的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体.方法 根据GenBartk提供的NS基因AY825265 mRNA序列及siRNA设计原则设计siRNA,筛选得到126-144 nt,199-217 nt和487-505 nt 3个19 bp片段为靶序列;合成带有BamHI、XhoI酶切位点的发夹结构寡核苷酸序列,经过退火,将此序列克隆至载体pRNAT-U6.1中构建重组表达载体;转化DH5α,提取质粒,应用PCR技术和测序方法鉴定重组克隆.转染入食管癌EC9706细胞,检测NS基因沉默情况.结果 PCR筛选得到3个目的片段的阳性重组克隆,测序证实重组表达载体中插入序列与设计一致.RT-PCR和Western blot检测显示构建的siRNA表达载体可显著降低EC9706细胞中NS mRNA和蛋白水平的表达.结论 成功构建出一组针对NS基因的siRNA表达载体,为下一步NS基因的RNA干扰研究鉴定了基础.