人结直肠肿瘤干细胞的分离培养与生物学特性

目的 从人结直肠肿瘤细胞中分离培养结直肠肿瘤干细胞(Colon cancer stem cells)并研究其生物学特性。方法 采用有限稀释法筛选分离具有连续克隆能力的单细胞,通过MTT比色法对其体外增殖能力进行鉴定,流式细胞仪分析细胞表面标记CD133、CD166、CD24、CD47、CD200、CD90、CD44、EPCAM的表达情况;PCR检测Oct4、Sox2、Nanog、C-myc等相关基因的表达,实时荧光定量PCR检测其表达量。结果 三例能够形成肿瘤球的原代培养细胞CD166阳性细胞所占比例分别为61.9%、52.4%、47.8%,CD47阳性细胞所占比例分别为99.8%、97.2%、99.9%;不能形成肿瘤球的原代培养细胞中CD166阳性细胞为10.8%,CD47阳性细胞为0.1%;CD133、EPCAM、CD24、CD200四个表面标记在两种细胞中的表达均低于0.5%,CD44、CD90在两种细胞中的表达均高于95%;与原代细胞相比,克隆细胞具有较强的体外增殖能力并且高表达Oct4(P<0.05)、C-myc (P<0.01)及Sox2基因,不表达Nanog基因。结论 人结直肠肿瘤中存在具有自我更新和增殖潜能的结直肠肿瘤干细胞,在体外可将其分离、培养和纯化。     

喉癌细胞CD44+CD133+高致瘤亚群的生物学特性

目的 筛选喉癌细胞中的高致瘤亚群,探讨其作为肿瘤干细胞的生物学特性.方法 原代培养喉癌细胞,采用流式细胞仪分选CD44+、CD133+、CD44+CD133+、CD44+CD133-细胞,并分别以1×106、1×105、1×104、1×102个/只接种于裸小鼠左腋皮下,观察各亚群成瘤时间、成瘤率、平均瘤重及肿瘤体积,筛选出在极低细胞浓度下的高致瘤亚群.采用Boyden小室体外侵袭实验,检测各亚群细胞的侵袭能力.采用免疫细胞化学染色检测各亚群细胞中干细胞抗原-1(SCA-1)及整合素β1的表达.采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Westem blot法,检测各亚群细胞中Bmi-1基因的表达.结果 CD44+CD133+细胞以1×103个/只接种于裸小鼠,可以成瘤.当各亚群细胞以1×106个/只接种于裸小鼠4周后,CD44+CD133+细胞接种组棵小鼠的肿瘤体积和重量分别为(7726.81±196.93)mm3和(5.51±0.12)g,均大于CD44+、CD44+CD133-及未分选细胞接种组(均P<0.05),而与CD133+细胞接种组裸小鼠的肿瘤体积和重量差异无统计学意义(P>0.05).CD44+CD133+细胞24 h的侵袭细胞数为83.62±1.61,显著高于其他各亚群喉癌细胞.CD44+CD133+细胞高表达整合素β1和SCA-1.Bmi-1 mRNA在CD44+CD133+细胞中的表达水平为0.951±0.112,显著高于CD44+CD133-细胞和未分选的喉癌细胞(0.532±0.214和0.268±0.193,均P<0.01);Bmi-1蛋白在CD133+和CD44+CD133+细胞中高表达,而在CD44+、CD44+CDi33-和未分选的喉癌细胞中仅有少量表达.结论 CD44+CD133+喉癌细胞具有高致瘤性及肿瘤干细胞的生物学特性,可能是喉癌恶性增殖的根源,并有望成为喉癌治疗的新靶点.     

程序性死亡蛋白配体1在CD133+人肝癌干样细胞中的表达及功能研究

目的探讨肝癌干样细胞(LCSLC)中程序性死亡蛋白配体1(PD-L1)的表达及其对LCSLC肿瘤干细胞特性和肿瘤生物学功能的影响, 探索LCSLC中调控PD-L1表达变化的上游信号通路和PD-L1调控干细胞特性和肿瘤生物学功能的下游分子机制。方法采用无血清球培养法培养肝癌细胞HepG2, 获得LCSLC。采用流式细胞术检测LCSLC中CD133等干性标志物分子的表达, Western blot和实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测其干性特征分子和PD-L1的表达, 细胞功能实验检测其肿瘤生物学功能, 确认所获得的LCSLC具备肿瘤干细胞特性。以细胞信号通路抑制剂处理LCSLC, 明确介导PD-L1表达变化的相关上游信号通路。利用小干扰RNA(siRNA)下调LCSLC中PD-L1的表达, 检测干性特征分子的表达变化、LCSLC体内外肿瘤生物学功能变化以及下游细胞信号通路的变化。结果与普通HepG2细胞比较, LCSLC中CD133的表达率升高[分别为(92.78±6.91)%和(1.40±1.77)%, P<0.001], 干性特征分子CD133、Nanog、Oct4A...     

CD44+鼻咽癌细胞的干细胞生物学特性

目的从人鼻咽癌SUNE-1 5-8F细胞株中分离出CD44⁺细胞并探讨其生物学特性。方法常规培养SUNE-1 5-8F细胞,采用流式细胞学技术检测SUNE-1 5-8F细胞中CD44⁺的表达并用流式细胞仪分选CD44⁺细胞;采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法、克隆形成实验等检测并比较CD44⁺、CD44^-细胞在体外增殖、分化等方面的差异;并用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测干细胞基因Oct4、Bmi-1的表达。结果CD44⁺细胞在鼻咽癌细胞中SUNE-1株所占的比率约为52.5%;新分选的CD44+细胞在无血清培养液和完全培养液中较CD44^-及未分选细胞均显示出较强增殖能力;RT-PCR示Bmi-1和Oct4 mRNA在CD44+细胞中的表达水平明显高于CD44^-细胞。CD44⁺和CD44-细胞在接受2Gy放射处理后,其平均克隆生成效率分别为(23.44±1.90)%和(7.78±1.17)%（P＜0.001）;CD44⁺细胞较CD44^-细胞在相同顺铂和多西他赛药物浓度下显示出更高的细胞存活率。结论CD44⁺细胞具有类肿瘤干细胞特性,可能是鼻咽癌的重要肿瘤干细胞标志之一。     

外阴鳞状细胞癌肿瘤干细胞的分选和鉴定

目的:分离外阴鳞状细胞癌A-431细胞系中CD44+的细胞亚群,鉴定其具有肿瘤干细胞特性。方法:采用流式细胞术分选出CD44免疫荧光抗体标记的CD44+细胞亚群,检测CD133、CD34蛋白在CD44+和CD44-中表达的差异,检测CD44+及CD44-细胞亚群的细胞周期。结果:A-431细胞系中CD44+细胞亚群约占4%,胚胎干细胞因子CD133、CD34在CD44+和CD44-的VSCC中表达存在显著性差异,主要在细胞膜上表达,CD44+的肿瘤细胞亚群97.69%处于G1期,CD44-的肿瘤细胞亚群61.12%处于S期。结论:在 A-431细胞系中 CD44 可以作为分选肿瘤干细胞的特异性表面标志物,CD133、CD34 在 CD44+的肿瘤细胞高表达,可能成为分选外阴鳞癌肿瘤干细胞的特异性表面标志物,CD44+肿瘤细胞具有典型的干细胞增殖特点。     

CD133+与CD133-胶质瘤体内再移植性征比较

目的:比较CD133+和CD133-胶质母细胞瘤体内再移植的细胞性征.方法:剥离26只CD133+和2只CD133-胶质母细胞瘤细胞致瘤裸鼠皮下肿瘤组织,分成4份,第1部分肿瘤块制作成冰冻切片,原位凋亡试剂盒检测细胞凋亡率;从第2部分组织块中提取细胞总蛋白,蛋白质印迹法检测转录因子Oct4和Sox2、细胞核增殖抗原(PCNA)、表皮生长因子受体(EGFR)、血管生成因子2(Ang-2)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)和MMP-9的表达水平;第3部分组织块剪碎消化成单细胞悬液,流式细胞术检测CD133+肿瘤细胞百分率;取第4部分肿瘤组织进行去胸腺裸鼠皮下再移植,检测成瘤率.结果:CD133+胶质母细胞瘤细胞所致肿瘤组织细胞凋亡率(4.37±0.74)％,低于CD133-胶质母细胞瘤细胞所致肿瘤组织细胞凋亡率(11.14±2.15)％,差异有统计学意义,P＜0.05;CD133+胶质母细胞瘤组织Oct4、Sox2、PCNA、EGFR、Ang2、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平相对较高;CD133+和CD133-胶质母细胞瘤细胞所致肿瘤中CD133+细胞百分率分别为(2.47±0.67)％和(0.44±0.14)％,两者致裸鼠皮下成瘤率分别为10/10和4/10.结论:CD133+胶质母细胞瘤细胞所致肿瘤较CD133-胶质母细胞瘤细胞所致肿瘤具有更高的恶性表型,两者体内再移植后成瘤率提高.     

人胆囊癌CD133+细胞亚群致瘤性的实验研究

目的:研究CD133在人胆囊癌细胞中的表达,初步探讨胆囊癌CD133+亚群的致瘤能力.方法:将人原代胆囊癌组织植入裸鼠皮下形成移植瘤,并同人原代胆囊癌组织分别制成单细胞悬液;FCM法检测CD133的表达情况,并分选出CD133+和CD133-亚群;对不同亚群细胞进行体外克隆形成实验和裸鼠体内移植瘤形成实验,免疫组织化学法验证移植瘤的组织表型.结果:FCM法检测显示,胆囊癌细胞中1.95%～3.24%的细胞CD133呈阳性表达;体外培养显示CD133+亚群比CD133-亚群具有更强的克隆球形成能力,在裸鼠体内也具有更强的肿瘤形成能力(P<0.05);免疫组织化学检测结果提示,胆囊癌CD133+细胞形成的移植瘤同人原代胆囊癌具有相同的组织表型,均表达CA19-9和CD44s.结论:人胆囊癌CD133+细胞亚群具有高致瘤性,其中可能富含有肿瘤干细胞.     

rhPDCD5促进子宫内膜癌KLE细胞对紫杉醇的药物敏感性

目的:探讨在子宫内膜癌细胞中重组人程序性细胞死亡蛋白5 (recombinant human programmed cell death protein 5, rhPDCD5)对紫杉醇化疗的促进作用.方法:子宫内膜癌KLE细胞培养完成后,通过重组人rhPDCD5 (20 μg/ml)处理KLE细胞,再分别以0、1.0、5.0、10.0、50 μmol/L紫杉醇(paclitaxel,PTX)处理24 h或以10 μmol/L PTX处理0、12、24、48 h,提取细胞总RNA及蛋白后,CCK法检测KLE细胞的增殖情况,流式细胞术检测KLE细胞凋亡情况,实时定量PCR检测KLE细胞中PDCD5mRNA的表达量,实时定量PCR或Western blotting测定凋亡相关基因的Bax、Bcl2、caspase-3 mRNA或蛋白水平的变化.结果:PTX对PDCD5表达的促进作用具有剂量依赖性和时间依赖性;PTX的最佳作用浓度为10 μmol/L,最佳作用时间为24 h.rhPDCD5明显增强紫杉醇对KLE细胞的抑制作用.CCK实验、流式细胞术及Westem blotting检测显示:PTX+rhPDCD5联合处理组KLE细胞的增殖抑制率和凋亡率均较PTX组明显增加、pro-caspase 3的表达量明显增加(均P＜0.01).促进凋亡蛋白Bax和抑制凋亡蛋白Bcl2的比值亦较明显增加(P＜0.01).结论:rhPDCD5可协同PTX抑制子宫内膜癌KLE细胞的增殖、促进细胞的凋亡,可明显增强KLE细胞对PTX的药物敏感性.     

CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞分选鉴定及其多药耐药性研究

目的:观察MACS免疫磁珠法分选CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞活性,并检测其与多药耐药的关系。方法:运用MACS免疫磁珠法从多药耐药乳腺癌细胞株MCF-7/ADR中分选CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞,流式细胞术测定分选前后CD44+CD24-/low细胞比例,微球体培养法检测分选细胞自我更新能力,流式检测CD44+CD24-/low细胞表面P-糖蛋白(P-gp)表达水平,Real-time PCR检测多药耐药相关基因MDR1表达水平。结果:MACS免疫磁珠法分选后,CD44+CD24-/low细胞比例为93.85%,其成球能力明显强于non-CD44+CD24-/low细胞亚群。MCF-7/ADR细胞株和CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞P-gp表达强度分别为101 177.10±2 171.86和114 906.70±2 560.19,P<0.05。CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞MDR1基因表达水平为MCF-7/ADR细胞株的(1.07±0.02)倍,P<0.05。结论:经MACS免疫磁珠法分选所得CD44+CD24-/low细胞亚群有更强的自我更新能力,高表达P-gp蛋白和MDR1基因可能是引起乳腺癌多药耐药的重要原因。     

USP7-MDM2-p53信号轴对子宫内膜癌细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响

目的:探讨泛素特异性蛋白酶7(USP7)调节Mdm2 p53结合蛋白同源物(MDM2)-p53轴对子宫内膜癌细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。方法:Western blot检测人子宫内膜癌组织、癌旁组织、人子宫内膜上皮细胞hEEC及人子宫内膜癌细胞系Ishikawa、HEC-1-A、KLE中USP7蛋白表达。将Ishikawa细胞分为NC组、P22077(USP7抑制剂)组、pcDNA组、pcDNA-MDM2组、P22077+pcDNA组、P22077+pcDNA-MDM2组,CCK-8法和克隆形成实验检测Ishikawa细胞增殖;流式细胞术检测Ishikawa细胞凋亡与细胞周期变化;Western blot检测Ishikawa细胞中USP7、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、周期素依赖性激酶2(CDK2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、MDM2、p53蛋白表达。以RG7388(MDM2抑制剂)或PFT-α(p53抑制剂)与20μmol/L P22077共处理Ishikawa细胞48 h以验证USP7-MDM2-p53信号轴上下游关系。结果:USP7蛋白在子宫内膜癌组织和细胞中高表...     

ENO1在胃癌干细胞中表达及其与胃癌侵袭转移的相关性研究

摘 要：［目的］ 探讨ENO1在胃癌干细胞中的表达及其对胃癌侵袭转移的影响。［方法］ 以胃癌SNU-5模型,实时荧光定量PCR和双色细胞免疫荧光检测ENO1在其分选的CD44+细胞中的表达情况。运用慢病毒载体稳定干扰SUN-5中ENO1的表达,并用实时荧光定量PCR和Western blot检验干扰效率。流式细胞术分选稳定干扰ENO1的SNU-5中CD44+细胞后（shRNA-ENO1）,实时荧光定量PCR检测其Oct-4、Sox 2以及干性相关基因Nanog的表达,同时分别进行细胞成球实验、体外侵袭与体内致瘤的胃癌干细胞生物学特性研究,Western blot检测ENO1对胃癌干细胞侵袭转移影响的相关分子机制。［结果］ SNU-5的CD44+细胞中ENO1基因和蛋白表达明显高于CD44-细胞,并建立稳定干扰ENO1的SUN-5。shRNA-ENO1细胞中干性基因Oct-4、Sox 2和Nanog中mRNA的表达显著低于PLV-Ctr细胞（P<0.05）。与PLV-Ctr细胞相比较,shRNA-ENO1细胞的自我更新能力、侵袭能力和肿瘤重量显著降低。Western blot检测shRNA-ENO1细胞中Vimentin、Snail和N-cadherin下调表达,同时E-cadherin上调表达,并伴随AKT和PI3K的磷酸化水平降低,提示ENO1的作用可能通过PI3K/AKT信号通路激活。［结论］ ENO1在胃癌干细胞中高表达,其在调控胃癌侵袭转移能力中发挥重要作用。     

沉默ZIC1基因联合氧化苦参碱对子宫内膜癌KLE细胞生物学行为的影响

目的:探讨沉默ZIC1基因转染联合氧化苦参碱对人子宫内膜癌KLE细胞生物学行为的影响。方法:将慢病毒载体pLV-shZIC1-PGK-Puro稳定转染人子宫内膜癌KLE细胞,通过Western blot法检测转染后ZIC1蛋白的表达水平。通过MTT法筛选出氧化苦参碱的IC50浓度后,分为空载不加氧化苦参碱组（A组）、空载加氧化苦参碱（B组）、转染不加氧化苦参碱组（C组）及转染加氧化苦参碱组（D组）,分别采用MTT法检测对KLE细胞黏附的影响,划痕实验检测细胞的迁移能力,流式细胞术检测各组细胞的凋亡率。结果:子宫内膜癌细胞转染shZIC1后,ZIC1蛋白表达明显下调。氧化苦参碱或沉默ZIC1单独作用均可抑制KLE人子宫内膜癌细胞的黏附、迁移及促进细胞凋亡（P<0.05）,且在抑制细胞迁移上存在时间依赖性。沉默ZIC1联合氧化苦参碱可影响子宫内膜癌KLE细胞的凋亡和侵袭,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:沉默ZIC1与氧化苦参碱对子宫内膜癌的抑制存在协同作用,联合应用可明显增强对人子宫内膜癌KLE细胞的抑癌效果。     

莱菔硫烷抑制肺癌干细胞增殖的体外实验

目的 研究莱菔硫烷（sulforaphane, SFN）对肺癌干细胞增殖的影响及其机制。方法 采用MTT法分析SFN对H460细胞增殖的影响;应用流式细胞术（FACS）检测SFN对细胞凋亡和侧群细胞比例的影响;肿瘤球培养法分析SFN对肿瘤球生长的影响;使用shRNA慢病毒载体构建β-catenin低表达细胞株,并应用蛋白电泳法检测在β-catenin正常或低表达情况下莱菔硫烷对β-catenin、Oct4、Sox2、c-Myc、Nanog等基因表达的影响。结果 SFN有效抑制H460细胞增殖,IC50为11.2 μmol/L。SFN处理72 h后,细胞凋亡呈剂量依赖性增高。SFN有效抑制原代肿瘤球和2代肿瘤球的生长,在较低浓度（1.0 μmol/L）下即有明显的抑制作用。FACS检测提示侧群细胞比例随SFN浓度增高而减少。SFN浓度依赖性地抑制β-catenin、Oct4、Sox2、c-Myc和Nanog等蛋白表达。在低表达β-catenin情况下,Oct4、Sox2、c-Myc、Nanog等基因表达水平与SFN浓度相关。结论 SFN通过β-catenin和干性相关基因（Sox2、c-Myc、Nanog和Oct4）特异地抑制肺癌干细胞的增殖。     

肺癌患者淋巴细胞亚群在外周血中的表达及其与预后的关系

背景与目的肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,本研究旨在探讨肺癌患者外周血中淋巴细胞亚群的表达及与预后的关系。方法采用流式细胞仪检测221例原发性肺癌首诊患者外周血淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD19+、CD25+、CD44+及NK细胞所占比例,并与96例健康人的血标本对比,结合临床及随访资料进行统计分析。结果与健康对照组对比,肺癌患者淋巴细胞亚群8项指标中CD3+及CD8+明显低于健康对照组,CD4+/CD8+、CD19+、CD25+、CD44+及NK细胞明显高于健康对照组(P<0.05)。与非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)相比,小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)的CD8+明显升高而CD4+和CD4+/CD8+明显下降(P<0.05)。化疗后与化疗前相比CD3+明显上升,NK细胞、CD19+及CD44+明显下降(P<0.05),其中CD44+在化疗后表达不升高者有生存优势(P=0.021),而其余3项指标与患者预期生存无关。结论肺癌患者外周血淋巴细胞亚群普遍发生改变,CD44+在化疗后的改变可能与预后相关。     

SUMO化和去SUMO化在肿瘤发生中的作用

 SUMO是一种小泛素相关修饰物,参与蛋白质的翻译后修饰,这一修饰过程即称为SUMO化。SUMO化修饰在加强蛋白质的稳定性、核质转运、DNA的修复和复制、染色体的有丝分裂、减数分裂等调节细胞活动中发挥重要作用。SUMO化是一动态过程,能被SUMO特异性蛋白酶(SENP)所逆转,形成SUMO化与去SUMO化的动态平衡。此平衡一旦被打破,将导致SUMO或者SENP在细胞中的异常表达,进而导致肿瘤的发生。     

人结肠癌SW620细胞表面抗原CD133的表达具有可塑性

目的:探讨CD133抗原在人结肠癌细胞SW620中表达是否具有可塑性。方法:对SW620细胞进行流式细胞活化荧光分析,分选出CD133-和CD133+细胞亚群。对这2种亚群细胞进行单层培养传代、悬吊法三维球培养及无糖或无血清培养液培养后,应用免疫染色与荧光定量PCR法检测CD133表达变化。结果:结肠癌SW620细胞中存在CD133-与CD133+两种亚群。分选后的CD133-与CD133+亚群细胞在单层培养时CD133表达无明显变化;在三维球培养时,CD133-亚群细胞中出现明显的CD133抗原及mRNA表达(P<0.05);而在无血清培养时,CD133-与CD133+两亚群细胞的CD133表达无变化;在无糖培养时,CD133-亚群细胞中出现CD133阳性表达。结论:人结肠癌SW620细胞中表面抗原CD133表达具有可塑性,可受不同培养条件的调节。     

PGRMC1抑制对子宫内膜癌细胞化疗敏感性影响的研究

目的:观察抑制孕激素膜受体1(PGRMC1)对子宫内膜癌细胞化疗敏感性的影响。方法:设计合成以PGRMC1为靶标的shRNA1、2质粒,对照质粒shRNA3,转染入瘤细胞。转染1周后,检测细胞绿色荧光蛋白(GFP)阳性率,RT-PCR检测转染shRNA后PGRMC1基因mRNA水平变化,蛋白质印迹法检测蛋白表达变化。CCK8法检测转染后第2代的瘤细胞对化疗药物ADM、5-FU及DDP的敏感性,流式细胞仪检测AnnexinⅤ标记的转染组与对照组细胞加化疗后细胞凋亡率的差异;双氢二氯荧光染色阳性率判定细胞内活性氧簇(ROS)水平的差异。结果:shRNA可在细胞稳定表达>1周,并可传代。shRNA1、2可显著抑制PGRMC1基因mRNA及蛋白表达,提高子宫内膜癌细胞化疗敏感性。相同化疗压力下,PGRMC1抑制的子宫内膜细胞凋亡率及细胞内ROS水平明显高于对照组。结论:抑制PGRMC1基因表达能够增加子宫内膜癌细胞对化疗的敏感性。     

SUMO蛋白酶与肿瘤关系的研究进展

<正>SUMO(small ubiquitin-related modifier protein)是一种类泛素蛋白,它通过与底物蛋白的共价连接,调节靶蛋白的定位与功能。SUMO修饰的逆反应即去SUMO化,是由一组SUMO特异性蛋白酶(SUMO-specific proteases,SENPs)家族来完成的[1]。哺乳动物细胞中的SENPs家族共有6个成员,根据其序列同源性、细胞内定位和底物特异性可分为3组。其中SENP1和SENP2为第一组,第二组为SENP3和SENP5,第三组为SENP6和SENP7。有研究表明,多种肿瘤中SENPs