Grp78基因转染肝细胞癌SMMC-7721克隆筛选及鉴定

目的 用Grp78基因转染人肝细胞癌SMMC-7721,筛选阳性克隆并鉴定.方法 利用真核表达载体pcDNA3.1+Grp78转染SMMC-7721,pcDNA3.1+Grp78与转染试剂的比例(μg/μL)分别为2:3、2:4、2:5、2:6、2:7、2:8、2:9,400 μg/mL G418筛选阳性克隆后,传代扩增,Western Blot鉴定克隆的Grp78表达情况.应用pcDNA3.1空载体作为阴性对照.结果 Western Blot显示,转染后的SMMC-7721经G418筛选,除一个克隆不高表达外,其余克隆均高表达Grp78.结论 Crp78转染SMMC-7721的最佳转染效率是8:2(转染试剂/DNA),由于假阳性克隆的存在,筛选后的克隆需要鉴定.     

稳定表达绿色荧光蛋白的COS7细胞系的筛选和鉴定

目的 构建稳定表达绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)的COS-7细胞系,为相关实验对照提供方便. 方法 常规方法培养COS-7细胞,将含pEGFP-N3基因的质粒转染COS-7细胞,G418抗性筛选,并用荧光显微镜进行跟踪检测,挑选耐药单细胞克隆并扩大培养至稳定细胞株. 结果 G418筛选的最适浓度为500 μg/mL.筛选到的COS7 -GFP克隆荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光,细胞的生物学性状保持稳定,通过Western blot能检测到GFP蛋白. 结论 成功筛选并建立了稳定表达的COS7 -GFP细胞系.     

胃癌高表达基因erk的PCR扩增,克隆和鉴定

对在胃癌高表达的EPH家族基因erk胞外的配体结合区基因扩增及克隆．方法：从胃癌患者手术切除标本中提取RNA，反转录为cDNA，以计算机辅助分析设计并合成引物进行RT－PCR，并将扩增片段克隆入pUC19质粒，用酶切及PCR方法筛选鉴定阳性克隆．结果：RT－PCR扩增片段与设计相符，且特异性好，无非特异产物出现，表明所设计引物符合要求．酶切及巢式PCR、PCR－RFLP方法证明克隆片段正确插入pUC19的HindIII和BamHI位点，并将重组克隆命名为pGE42．结论；克隆的完成为进一步研究该基因在胃癌的发生中的作用，寻找其胞外配体及进行表达产物的细胞定位等工作打下基础．     

稳定表达细胞内病原体抗性基因1的RAW264．7细胞克隆的建立

目的：构建携带细胞内病原体抗性基因1（1pr1）,以绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因的重组真核表达载体,并导人鼠巨噬细胞RAW264．7中表达．方法：KpnⅠ和BamHⅠ双酶切重组质粒pET32a（＋）-Ipr1及真核表达载体pEGFP-C1,Ipr1基因定向克隆人pEGFP-C1载体,构建重组质粒载体pEGFP-C1-Ipr1．脂质法转染体培养的RAW264．7细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察pEGFP-C1-Ipr1融合蛋白在细胞中的表达;PCR检测Ipr1基因转录水平的表达;West-ernBlot方法验证Ipr1蛋白水平的表达．结果：酶切鉴定获得一条约4700bp空载体条带及一条约1338bp目的片段,证明pEGFP-C1-Iprl真核表达载体构建成功．pEGFP-C1-Ipr1转染RAW264．7细胞后,WesternBlot可以检测到约Mr77×10^3的融合蛋白在RAW264．7细胞中表达,荧光显微镜下可观察到转染细胞中有绿色荧光蛋白表达．结论：成功构建真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1-Ipr1,获得稳定的RAW264．7-Ipr1细胞克隆可表达Ipr1,为进一步研究Ipr1的功能奠定了基础．     

真核细胞阳性细胞克隆的筛选与鉴定

大多数真核蛋白在真核细胞中翻译后,需经过加工、修饰才具有生物学活性,是真核蛋白在原核细胞中表达后没有生物学活性的主要原因之一.     

稳定表达肌肉型乙酰胆碱受体的细胞株建立和鉴定

目的:建立稳定表达骨骼肌细胞乙酰胆碱受体(AChR)的人胚肾(HEK293)细胞系,进行各种药理学研究.方法:将编码小鼠m-nAChR的α、β、γ、δ和ε亚基的cDNA分别重组于真核细胞表达质粒pcDNA3.1,用脂质体转染技术将重组质粒导入HEK293细胞,使其细胞膜上分别表达胚胎型乙酰胆碱受体(γ-nAChR)和成年型乙酰胆碱受体(ε-nAChR).用G418和免疫荧光技术筛选出稳定表达两种受体亚型的细胞株. 结果:在G418反复筛选后的HEK293细胞系中,有14株明显表达ε-nAchR;4株明显表达γ-nAchR,受体大部分表达于细胞膜上. 结论:用重组后的pcDNA3.1转染HEK293细胞,经筛选后可以稳定表达m-nAChR.     

稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆的建立

目的构建针对HPV16 E6基因的逆转录病毒载体,感染HPV16阳性宫颈癌细胞,筛选稳定表达HPV16 E6 siRNA的细胞克隆。方法采用DNA重组技术构建表达靶向HPV16E6基因的pSUPER．retro RNAi逆转录病毒载体,脂质体法将逆转录病毒载体转染人包装细胞PA317,G418筛选稳定产生逆转录病毒的细胞克隆,收集病毒上清,感染靶细胞SiHa,G418筛选出稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆,RTPCR检测细胞中E6 mRNA表达,细胞增殖实验检测细胞增殖力。结果获及稳定产生逆转录病毒的细胞克隆,病毒感染靶细胞SiHa后,筛选出稳定表达HPV16 E6 siRNA的细胞克隆,RTPCR示HPV16 E6 mRNA表达受到抑制。细胞增殖实验示克隆细胞增殖率明显下降。结论成功建立稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆,特异性的siRNA能抑制细胞生长、HPV16 E6 mRNA表达,HPV16 E6 siRNA可能成为治疗宫颈癌的一种新方法。     

稳定表达核仁素的H9C2细胞株的建立和鉴定

目的:建立稳定表达核仁素的H9C2大鼠心肌细胞株,为进一步研究核仁素在心肌细胞凋亡中的作用提供细胞模型.方法:将含有核仁素全长的质粒pCMV-Tag2B-Nuc用脂质体转染技术导入H9C2细胞,使核仁素在细胞内表达,用G418筛选出稳定表达核仁素的细胞株;用双酶切、DNA测序鉴定质粒,用RT-PCR及Western blot检测核仁素基因在靶细胞中的整合与表达.结果:经G418反复筛选的H9C2细胞株中,核仁素基因在mRNA及蛋白质水平表达均较野生型细胞及转空载体细胞升高.结论:用含核仁素全长的质粒转染H9C2大鼠心肌细胞,经筛选后可稳定表达核仁素.     

大鼠心房肌细胞Kir3.1基因siRNA的筛选与鉴定

目的 应用特异性siRNA抑制新生SD大鼠心房肌细胞Kit3.1基因表达;筛选出干扰效率最高的siRNA,并应用分子生物学方法进行鉴定.方法 设计并化学合成3条针对Kir3.1基因的siRNA,脂质体法转染原代培养的新生SD大鼠心房肌细胞.应用Real-time PCR筛选出抑制效率最高的siRNA,将其转染入细胞;于转染后24 h、48 h、72 h提取细胞总RNA及蛋白质,分别采用Real-time PCR和Westem blot检测Kir3.1 mRNA及蛋白质表达情况.,结果 Real-time PCR显示siRNA-3干扰效率强于siRNA-1,2,能够显著下调心房肌细胞Kir3.1 mRNA的表达;siRNA-3转染心房肌细胞后,发现其在24,48,72 h均能使Kir3.1 mRNA及蛋白表达下降.结论 针对Kir3.1 mRNA合成的siRNA能够特异性干扰Kir3.1基因表达和蛋白质的合成,这可能为心律失常性疾病的治疗提供新的实验性依据.     

ABCE1基因siRNA 稳定转染小细胞肺癌细胞株阳性克隆的筛选

 目的构建携带绿色荧光蛋白的ABCE1基因的siRNA 表达载体,通过将载体转染入小细胞肺癌细胞株NCI-H446,筛选稳定转染细胞株。方法根据的DNA 序列设计3 对siRNA 引物,构建可用于筛选阳性克隆且带有绿色荧光的基因siRNA 表达载体ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA-1、ABCE1-PRNAT-U6.1/Neo-siRNA-2 及ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA-N,采用FUGENE-HD法将载体转染入NCI-H446 细胞中,并以G418 进行阳性克隆筛选,筛选ABCE1基因沉默的稳定转染细胞系。结果经酶切和DNA测序验证,证实ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA 表达载体构建成功。将基因siRNA表达载体成功转染小细胞肺癌细胞NCI-H446 后,小细胞肺癌细胞内可见绿色荧光,通过G418 筛选,获得了基因沉默的小细胞肺癌细胞系,该细胞系的ABCE1水平明显低于未转染siRNA 的小细胞肺癌细胞。结论成功的构建了基因siRNA 表达载体ABCE1-pRNAT-U6.1 /Neo-siRNA。筛选出ABCE1基因沉默的稳定转染小细胞肺癌细胞系,为今后应用ABCE1基因siRNA 表达载体研究基因的作用机制提供实验基础。     

Nucleostemin基因特异性RNA干扰对HeLa细胞体外增殖能力的影响

目的:研究nucleostemin (简称NS)基因特异性RNA干扰对HeLa细胞的增殖和细胞周期的影响.方法:①将NS特异性siRNA真核表达质粒经脂质体转染导入HeLa细胞,筛选NS阳性转染HeLa细胞克隆,作为silencer组用于实验,对照组为HeLa细胞组,②检测silencer组和对照组细胞生长曲线、细胞增殖率和细胞周期.结果:与对照组相比,Silencer组HeLa细胞增殖速率明显降低,细胞处于G0/G1期明显增多,S期则明显减少,DNA异倍体数量明显降低.结论:NS特异性siRNA真核表达质粒转染的HeLa细胞,其细胞增殖速率受到明显抑制.     

INVESTIGATION OF SGC-7901 CELL LINE ESTABLISHED FROM HUMAN GASTRIC CARCINOMA CELLS

The SGC-7901 gastric adenocarcinoma cell line is established. It is cultured from material obtained from metastasized lymph nodes on the gastric lesser curvature in a female patient. The cell line re produces continuously every 7 days. Polygonal and epithelioid cells account for 95.2To of the cell popula tion. There is marked poikilocytosis. The chromo- some modal number is 67, constituting 42To of the karyotyped cells. Chromosome aberration is observed in 6'70 0f the cases. Percentage of secondary tumor growth is high by animal inoculation. Both the cul tured cells and those of the primary tumor were PAS positive and Accian blue negative. Transmission elec tron microscopy (TEM) revealed microvilli over the cell surface and intracellular secretory granules; mul tiple intercellular junctional and inlay structures were also demonstrated.     

Nucleostemin 特异性RNA干扰对肿瘤细胞增殖能力的影响

目的：检测肿瘤细胞Nucleostemin(NS)的表达，研究NS特异性RNA干扰对Hela细胞体内外增殖的影响。方法：提取6种肿瘤细胞总RNA，用RT-PCR和Northern blot方法检测NS的表达。用NS特异性siRNA表达载体转染Hela细胞，观察转染的Hela细胞(简称NS-SiRNA-Hela细胞)体内外增殖的变化。结果：6种肿瘤细胞中NS显高表达。体外培养的NS-siRNA-Hela细胞中NS表达显降低，Gn／G，期细胞百分率显升高。体内致瘤实验显示，NS-siRNA-Hela细胞在裸鼠体内增殖显降低。结论：NS在肿瘤细胞中高表达具有普遍性。NS特异性RNA干扰使Hela细胞进入S期受阻，并可明显降低Hela细胞体内外的增殖能力。     

siRNA对胃腺癌细胞株SGC-7901血管内皮生长因子基因表达的作用

目的 研究siRNA对人胃腺癌细胞株SGC-7901血管内皮生长因子（VEGF）基因表达的影响。方法 利用体外合成带有T7启动子的VEGF基因DNA片段,转录针对VE F mRNA的siRNA．通过脂质体2000将合成的siRNA转染入SGC7901细胞,设置转染VEGF错义序列组、脂质体组、空白对照组作为对照．用MTT法检测细胞抑制率,流式细胞仪检测细胞周期的改变,RT—PCR检测转染后VEGF mRNA表达水平的变化．ELISA法检测细胞培养液中VEGF蛋白分泌量的变化。结果 所设计的两个靶位点siRNA均能有效抑制胃腺癌细胞的生长,并使细胞周期阻滞于G0／G1期;VEGF mRNA的表达也受到有效抑制,明显减少;同时,对应的VEGF蛋白水平也显著降低,作为阴性对照的错义序列组siRNA则没有出现这种变化。结论 体外转录合成的siRNA可抑制胃腺癌SGC-7901细胞VEGF基因的表达。     

人胃癌细胞株Rb抗癌基因缺失的研究

以Ｒｂ基因ｃＤＮＡ３．８Ｋｂ片段做探针，经非放射性地高辛—ｄＵＴＰ及放射性同位素α－３２Ｐ－ｄｃＴＰ两种标记方法标记，对６株人胃癌细胞株的ＤＮＡ进行点杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，显示５株细胞Ｒｂ基因完全缺失，１株不全缺失伴突变。     

NS基因克隆及人成骨肉瘤细胞和人胚胎肾细胞NS基因的表达

目的：研究nucleostemin(核干细胞因子，NS)基因在人成骨肉瘤细胞(0S-732)和人胚胎肾细胞(HEK-293)的表达情况，井克隆该基因的部分片段。方法：以0S-732细胞和HEK-293细胞为实验材料，进行细胞总RNA的提取、反转录反应、PCR反应、NS基因片段的克隆及测序等。结果：(1)提取的总RNA质量很高，基本上无降解；(2)0S-732细胞和HEK-293细胞中均有NS基因的表达，并且在相同量底物的情况下，0S-732细胞NS基因的表达量明显高于HEK-293细胞；(3)将PCR产物成功地与pGEM-T克隆载体连接，构建为FGEM-T-NS质粒，测序结果表明NS基因片段序列与基因库中登陆的序列完全一致。结论：本成功地从0S-732细胞和HEK-293细胞克隆到NS基因片段，0S-732细胞NS基因的表达量明显高于HEK-293细胞。     

胃癌细胞凋亡相关基因研究进展

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,死亡率很高。胃癌的发生是细胞凋亡与增殖调控失衡的结果。现综述细胞凋亡相关基因在胃癌的发生、发展、转归和治疗中的地位及其应用前景。     

蝙蝠葛酚性碱对胃癌细胞株 SGC -7901 Fas 基因表达的影响

目的：探讨蝙蝠葛酚性碱（PAMD）抗胃癌的作用机理。方法：通过实时定量PCR的方法观察PAMD对胃癌细胞株SGC-7901FasmRNA表达的影响，以此探讨PAMD抗肿瘤作用机理。结果：PAMD各剂量组均能上调FasmRNA的表达，较阳性对照组明显，但差异与空白组比较均不具有统计学意义（P〉0．05）。结论：PAMD抗胃癌的作用机理可能与其上调Fas基因表达有关。     

细胞凋亡相关基因bcl-2与bax在胃癌组织中表达探讨

目的:探讨凋亡相关基因bcl-2和bax在人胃癌组织中蛋白的表达情况及其与胃癌的各种临床病理特征和预后的关系。方法:用免疫组织化学SABC法检测经手术治疗的72例胃癌患者的病理标本,用TUNEL法检测其中的细胞凋亡情况。同时检测13例正常胃组织作为对照。结果:bcl-2蛋白在胃癌组织中的阳性表达率为36.11%,bax为52.78%,两者与正常胃组织比较差异均有统计学意义(P<0.05和<0.01)。结论:bcl-2和bax蛋白的表达与胃癌的lauren分型、分化程度及淋巴结转移相关,并通过对细胞凋亡的调控参与了胃癌的发生、发展,和预后密切相关。     

熊果酸对胃癌细胞株SGC-7901的抑制作用

目的：本文通过不同浓度的熊果酸（ursolic acid,UA）作用于人胃癌SGC-7901细胞,探讨UA对其生长的影响。方法：采用体外培养人胃癌细胞株SGC-7901,MIT法观察不同浓度UA对细胞生长的影响;用10μmoL／L,20μmoL／L,40μmoL／L和80μmoL／L不同浓度UA处理SGC-7901细胞12h后,倒置显微镜观察细胞形态变化以及MTT检测细胞的生长情况。结果：在细胞抑制实验中20～40μmoL／L UA可使SGC-7901细胞发生皱缩,40—80μmoL／LuA作用12h后,SGC-7901细胞形态明显变圆,出现不同程度的漂浮;同时MTT实验结果表明,不同浓度的UA能抑制SGC-7901细胞的生长并呈浓度依赖性。结论：UA能够抑制SGC-7901细胞的生长,具有较强的抗肿瘤活性。