HSV-1载体中介IacZ基因导入大鼠中枢神经系统及其表达的研究

目的研究用HSV-1载体将外源基因导入大鼠中枢神经系统的方法.方法将HSV-1载体接种于大鼠嗅神经末梢,在不同时间取各部位脑组织检测lacZ基因表达产物β-半乳糖苷酶活性,并观察大鼠脑组织局部及全身的病理学和免疫学变化.结果接种HSV-l载体后2 d在嗅球中检测到β-半乳糖苷酶活性,接种后4 d在嗅球、嗅前神经核、蓝斑、杏仁核、海马、颞叶皮质、间脑以及最后区均检测到β-半乳糖苷酶活性,并持续10周以上;脑组织及全身各脏器未见病理学及免疫学改变.结论 HSV-1载体可通过大鼠嗅神经通路将外源基因导入中枢神经系统并在其中表达.     

单纯疱疹病毒Ⅰ型载体中介lacZ基因导入猴嗅中枢皮质及其表达的研究

目的：研究用ＨＳＶ－１载体经猴嗅神经通路将外源基因导入中枢神经系统的方法。方法：将ＨＳＶ－１载体接种于猴嗅神经末梢，在不同时间取各部位脑组织检测ｌａｃＺ基因表达产物β－半乳糖苷酶活性，并观察猴脑组织局部及全身的病理学和免疫学变化。结果：接种ＨＳＶ－１载体后４ｄ在嗅中枢皮质神经元内检测到β－半乳糖苷酶活性，并持续１个月以上；脑组织及全身脏器未见病理学及免疫学改变。结论：ＨＳＶ－１载体可通过嗅神经通路将外源基因导入中枢神经系统并在其中表达，     

单纯疱疹病毒I型载体中介lacZ基因导入猴嗅中枢皮质及其表达 …

目的：研究用ＨＳＶ－１载体经猴嗅神经通路将外源基因导入中枢神经系统的方法，方法：将ＨＳＶ－１载体接种于喉嗅神经末梢，在不同时间取各部位脑组织检测ｌａｃＺ基因表达产物β－半乳糖苷酶活性，并观察猴细胞组织局部及全身的病理学和免疫学变化，结果：接种ＨＳＶ－１载体后４ｄ在嗅中枢皮质神经元内检测到β－半糖苷酶活性，并持续１个月以上，脑组织及全身脏器术未见病理学及免疫学改变，结论：ＨＳＶ－１载体可通过嗅神经通     

基因导入途径与脑内表达的关系研究

目的比较不同途径(股静脉、颈内动脉、侧脑室及鞘内)导入转铁蛋白靶向脂质体介导的LacZ基因(transferrintargeted LacZ gene pegylated liposomes,Tf-PLs)在大鼠脑内的表达,寻找出适合临床的安全有效的基因导入方法。方法 120只雄性SD大鼠随机分为静脉导入组、动脉导入组、侧脑室导入组、鞘内注射组和治疗组,其中治疗组分别将Tf-LacZ通过股静脉、颈内动脉、侧脑室立体定向及鞘内的方式注射入大鼠体内。术后24和48h分别取脑(每项检测指标每组随机选取8只大鼠),光学显微镜下观察LacZ基因编码的β-半乳糖苷酶(beta-gal)的表达,Real time-PCR比较不同组别LacZ mRNA的表达,试剂盒检测β-半乳糖苷酶的活性。结果免疫组化提示动脉导入组及静脉导入组可以实现β-半乳糖苷酶在脑内的广泛性表达,并且动脉导入组LacZ mRNA及β-半乳糖苷酶的表达高于静脉组(P<0.05)。侧脑室及鞘内注射组只能实现β-半乳糖苷酶的局限性表达,且LacZ mRNA及β-半乳糖苷酶的表达要低于动脉及静脉导入组(P<0.05)。结论动脉导入将外源基因转入大鼠脑内的效果最好,静脉导入的效果优于侧脑室注射和鞘内注射的方式。在可行性方面,经过静脉导入途径是较为方便、易行、有效。     

利用蛋白转导技术将α-烯醇化酶导入心肌细胞的实验研究

目的探讨将外源α-烯醇化酶导入心肌细胞的可行性,为后续的蛋白功能研究奠定基础。方法原代培养WKY乳鼠心肌细胞,将纯化的α-烯醇化酶与蛋白转导载体Charoit共孵育后转染心肌细胞,同时设置阳性对照β-半乳糖苷酶转染组,光镜下计数转染阳性细胞的百分率;蛋白免疫印迹检测细胞总蛋白中α-烯醇化酶的表达;荧光共聚焦显微镜下观察α-烯醇化酶的亚细胞定位。结果Charoit能够将外源蛋白成功导入原代培养的心肌细胞中,光镜下可见β-半乳糖苷酶的导入效率约为81%,Western blot结果表明外源α-烯醇化酶成功导入了心肌细胞,免疫荧光显示导入的外源α-烯醇化酶与内源α-烯醇化酶相似,主要定位于胞浆。结论利用Charoit介导的蛋白转导技术能够成功将外源α-烯醇化酶导入心肌细胞。     

利用蛋白转导技术将α-烯醇化酶导入心肌细胞的实验研究

目的 探讨将外源α-烯醇化酶导入心肌细胞的可行性,为后续的蛋白功能研究奠定基础.方法 原代培养WKY乳鼠心肌细胞,将纯化的α-烯醇化酶与蛋白转导载体Charoit共孵育后转染心肌细胞,同时设置阳性对照β-半乳糖苷酶转染组,光镜下计数转染阳性细胞的百分率;蛋白免疫印迹检测细胞总蛋白中α-烯醇化酶的表达;荧光共聚焦显微镜下观察α-烯醇化酶的亚细胞定位.结果 Charoit能够将外源蛋白成功导入原代培养的心肌细胞中,光镜下可见β-半乳糖苷酶的导入效率约为81%,Western blot结果表明外源α-烯醇化酶成功导入了心肌细胞,免疫荧光显示导入的外源α-烯醇化酶与内源α-烯醇化酶相似,主要定位于胞浆.结论 利用Charoit介导的蛋白转导技术能够成功将外源α-烯醇化酶导入心肌细胞.     

四环素基因表达调控系统调控β-半乳糖苷酶基因在肝癌细胞中的表达

目的：构建调控β-半乳糖苷酶（β-gal）基因表达的四环素基因表达调控载体,验证其在肝癌细胞内调控β-半乳糖苷酶基因的表达,为进一步利用该调控系统调控治疗基因治疗肝癌奠定实验基础。方法：根据2个四环素调控子结合位点（TetO2）基因与pcDNA3.1载体的基因核苷酸序列,设计引物,以pcDNA3.1载体为模板进行PCR。将具有串联2个四环素调控子结合位点（TetO2）基因的PCR产物连接入pcDNA3.1载体CMV启动子下游,构建成pcDNA3.1-TetO2载体,应用ABI 3130 测序仪利用pcDNA3.1-TetO2载体对TetO2 PCR产物进行测序分析。再将β-gal克隆入pcDNA3.1-TetO2载体,构建成受四环素调控表达的β-半乳糖苷酶基因的表达载体pcDNA3.1-TetO2-β-gal。利用脂质体将携带四环素调控子基因（TR）的pcDNA6/TR载体转染到肝癌细胞HepG2中,利用杀稻瘟菌素进行细胞转染的稳定筛选,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测TR基因在HepG2细胞内的表达。将pcDNA3.1-TetO2-β-gal载体转染到稳定表达pcDNA6/TR的HepG2细胞中,转染3～4 d后,给予强力霉素（4 mg•L^-1）,利用β半乳糖苷酶原位染色试剂盒染色,检测β-半乳糖苷酶基因的表达。结果：构建的pcDNA3.1-TetO2载体测序结果表明,串联2个四环素调控子结合位点（TetO2）基因片段插入到pcDNA3.1载体CMV启动子基因下游。pcDNA3.1-TetO2-β-gal载体酶切鉴定结果表明,β-gal成功地克隆入pcDNA3.1-TetO2载体。RT-PCR结果显示,TR基因在pcDNA6/TR转染的经杀稻瘟菌素筛选的HepG2细胞内得到稳定表达。给予强力霉素后,β-半乳糖苷酶基因在稳定转染TR 基因的HepG2 细胞 内得以表达;而未给予强力霉素,β-半乳糖苷酶基因在稳定转染TR 基因的HepG2 细胞内表达受到抑制。结论：成功地构建了调控β-半乳糖苷酶基因表达的四环素基因表达调控载体,利用该载体成功地调控了β-半乳糖苷酶基因在HepG2细胞内的表达。     

三七总皂甙增强人内皮源性一氧化氮合酶基因启动子活性

目的:探讨三七总皂甙(tPNS)对人内皮源性一氧化氮合酶(eNOS)基因启动子转录活性的词控机制。方法:以基因重组技术构建人eNOS基因启动子区(-1--1600bp)驱动的萤火虫荧光素酶报告基因载体peNOS-Luc，采用脂质体介导的细胞基因共转染技术将peNOS—Luc、空载体pGL2-Basic和β-半乳糖苷酶表达质粒pCMV-β共转染NIH3T3细胞，用细菌脂多糖(LPS)、tPNS和转移生长因子β1(TGFβ1)等因子分别刺激转染后的NIH3T3细胞，检测并比较荧光素酶／β-半乳糖苷酶活性，以确定LPS、tPNS和TGFβ1对人eNOS基因启动子转录活性的影响。结果：(1)酶切和测序结果均证实重组载体peNOS-Luc构建正确；(2)重组载体peNOS-Luc在NIH3T3细胞中有效表达；(3)在LPS刺激下．人eNOS启动子的转录活性降低，而在tPNS和TGFβ1刺激下，其启动子的转录活性增强，其中，TGFβ1较tPNS所致的转录活性更强。结论：正确构建了人eNOS基因启动子区(-1-1600bp)驱动的萤火虫荧光素酶报告基因载体peNOS—Luc；tPNS在NIH3T3细胞中增强人eNOS基因启动子的转录活性。     

腺病毒携带的LacZ基因静脉注射后在大鼠体内的表达

目的 :探讨周围静脉注射的腺病毒载体介导的外源基因在体内不同组织的表达。方法 :将重组LacZ腺病毒经尾静脉注射导入Wistar大鼠体内 ,以X -gal染色法明确腺病毒载体介导的标识基因 (LacZ)在大鼠体内的表达部位和时间。结果 :β- gal表达具有剂量依赖性 ,而且存在器官、组织和细胞三种水平的表达差异。剂量较小时 ,肺、肾、肝、脾优先表达 ,而心肌在 1× 1 0 1 1 pfu/kg剂量组才有少量表达 ,大血管和脑组织始终未见表达。注射后 1～ 2周 ,大鼠的肾、肺、肝、脾、肾上腺高表达 β -半乳糖苷酶 ,3～ 4周表达量减少 ,5周基本消失。 结论 :腺病毒介导的外源基因经静脉途径转移 ,可能是肾、肺、肝的部分疾病基因治疗的有效基因转移途径 ,而对心脑血管疾病不适合。     

将含有报告基因LacZ的重组腺病毒载体从大鼠鼻腔转移至脑的实验研究

目的探讨将携带有报告基因的腺病毒载体由鼻腔转移至脑途径的可行性。方法将携带半乳糖苷酶报告基因（LacZ）的5型重组腺病毒载体（Ad5 CMV LacZ）注入SD大鼠鼻腔黏膜,分别在注射3d、7d、14d、21d及28d切取大鼠鼻腔黏膜以及与嗅觉信息传导途径相关的脑组织,进行冰冻切片和β-半乳糖苷酶（β-gal）免疫组织化学反应显色,判断该载体是否转染和表达蛋白质产物。结果β-gal免疫组化染色反应显示,该病毒载体从第3天起即可在鼻腔黏膜与嗅球内的细胞转染和表达,在第7天至第21天病毒载体逐渐向颅内深部的室管膜下区、杏仁核及齿状回细胞转移和表达,持续性表达蛋白质产物达28d之久。结论经鼻腔黏膜注入腺病毒载体不仅可将外源性基因转移到脑实质内,还可确保外源性基因转染和表达成功。