阻断氯通道对人喉癌裸鼠移植瘤ERK1/2和AKT1的影响

目的研究氯通道阻断剂5-硝基-2-(3-苯丙氨基)苯甲酸[5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)benzoicacid,NPPB],对人喉癌细胞系Hep-2细胞裸鼠移植瘤细胞外调节激酶(extracellulat regulated kinase,ERK)ERK1/2和AKT1蛋白磷酸化的影响,探讨阻断氯通道对喉癌移植瘤抑制作用的可能机制。方法以人喉癌Hep-2细胞建立裸鼠皮下移植瘤模型,应用不同浓度的NPPB分组进行治疗实验,研究移植瘤生长变化,Westernblot法检测移植瘤ERK1/2和AKT1蛋白磷酸化水平的变化。结果与对照组比较,各治疗组移植瘤ERK1/2和AKT1总蛋白水平无显著性差异,50、100、150μmol NPPB组ERK1/2和AKT1蛋白磷酸化水平明显降低,差异均有显著性,NPPB浓度依赖性地抑制ERK1/2和AKT1蛋白磷酸化。结论体内阻断氯通道可以抑制人喉癌裸鼠移植瘤的生长,其机制可能与抑制移植瘤细胞ERK1/2和AKT1蛋白磷酸化有关。     

抑制水通道蛋白1对Hep-2细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察水通道蛋白1(AQP-1)对喉癌Hep-2细胞增殖和凋亡的影响。方法:应用MTT法、流式细胞仪及原位末端标记(TUNEL)法、免疫组织化学SABC方法多种技术分别检测AQP-1的抑制剂乙酰唑胺对细胞生长抑制率、凋亡率和细胞内AQP-1蛋白表达的影响。结果:乙酰唑胺在5×10-5mol/L浓度下对Hep-2细胞内AQP-1蛋白表达有明显的抑制作用,细胞生长抑制率和细胞凋亡率均随时间延长而增大,呈时间依赖性。并且TUNEL法检测的细胞凋亡率与免疫组织化学SABC方法检测的AQP-1蛋白抑制率呈明显正相关(r=0.784,P<0.05)。结论:乙酰唑胺在一定浓度下对AQP-1的抑制可显著诱导喉癌Hep-2细胞凋亡,提示AQP-1可能成为治疗喉癌新的靶点。     

RNAi沉默miRNA-224-5p对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响

目的通过慢病毒载体介导的RNA干扰技术,来探讨沉默miRNA-224-5p对人喉鳞状细胞癌（简称喉鳞癌）Hep-2细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。方法针对目标序列合成特异性siRNA干扰片段并克隆入慢病毒载体,将重组miRNA-224-5p-RNAi-LV3转染喉鳞癌Hep-2。设为干扰组（miRNA-224-5p-siRNA,SI组）、阴性对照组（NC组）和空白对照组（BC组）,分别采用聚合酶链反应方法检测miRNA-224-5p的表达情况,用CCK8法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况、Transwell侵袭实验检测细胞侵袭情况。结果 miRNA-224-5p-RNAi-LV3可显著降低miRNA-224-5p的表达,转染后Hep-2细胞增殖能力显著降低,细胞侵袭能力明显减弱,细胞周期及细胞凋亡均未见明显影响。结论 RNAi沉默miRNA-224-5p可以抑制Hep-2细胞增殖,并降低其侵袭能力。     

三氧化二砷诱导喉癌Hep-2耐药细胞凋亡的研究

目的观察三氧化二砷(As2O3)对喉癌Hep-2细胞株和长春新碱诱导的多药耐药Hep-2r细胞的作用和对细胞周期的影响.方法用长春新碱(VCR)递增药物浓度法筛选耐药细胞Hep-2r,体外培养的细胞与不同浓度的As2O3作用24、48、72h,通过MTT还原法检测细胞的生长抑制率,用光学显微镜、流式细胞仪、荧光显微镜研究细胞凋亡的形态学改变,检测细胞凋亡率并进行细胞周期分析.结果As2O3可有效抑制Hep-2细胞和Hep-2r细胞的生长,呈时间和浓度依赖性特点.形态学观察发现,As2O3诱导Hep-2和Hep-2r细胞凋亡,Hep-2和Hep-2r细胞对As2O3的敏感性无显著差异.2μmol/L As2O3作用24h时,S期细胞比例增高,72h后,S期细胞明显下降,细胞大量凋亡.As2O3在作用早期,阻滞细胞通过S期,随着时间的延长,诱导S期细胞凋亡.结论As2O3可诱导Hep-2细胞和Hep-2r细胞凋亡,与细胞周期阻滞有关.     

Beclin1对喉鳞癌细胞Hep-2紫杉醇敏感性影响的体外研究

目的:通过检测不同Beclin1表达水平对喉癌细胞紫杉醇敏感性的影响。方法:本研究利用以喉癌细胞株Hep-2、稳定转染pcDNA3.1-Beclin1质粒的喉癌细胞株Hep-2-Beclin1、稳定转染pcDNA3.1质粒载体的喉癌细胞株Hep-2-pcDNA3.1为研究对象,对3组细胞施加不同浓度的化疗药物紫杉醇(1、2、5、10、20μg/L)干预24h,利用MTT法及流式细胞术检测紫杉醇对3组细胞增殖和凋亡的影响。利用Western blot检测3组细胞Akt和p-Akt蛋白表达水平。结果:不同浓度的紫杉醇处理后的3组喉癌细胞与药物终浓度正相关地出现生长抑制率提高。当紫杉醇浓度大于5μg/L时,紫杉醇对Hep-2-Beclin1的生长抑制率高于对另两株细胞的生长抑制率。以终浓度为10、20μg/L的紫杉醇处理3株喉癌细胞24h后,流式细胞术检测结果显示:各组细胞20μg/L紫杉醇处理后细胞的凋亡率均高于10μg/L紫杉醇处理后细胞的凋亡率(P<0.05)。紫杉醇处理后Hep-2-Beclin1组细胞凋亡率均高于Hep-2组和Hep-2-pcDNA3.1组(P<0.05)。Western blot结果显示:Hep-2、Hep-2-pcDNA3.1、Hep-2-Beclin1细胞Akt相对蛋白表达量分别为:1.24±0.03、1.25±0.05、1.27±0.09,3组细胞间Akt相对蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05);Hep-2、Hep-2-pcDNA3.1、Hep-2-Beclin1细胞p-Akt即活化型Akt相对蛋白表达量分别为:0.98±0.09、1.03±0.04、0.54±0.03,Hep-2-Beclin1细胞p-Akt相对蛋白表达量低于Hep-2、Hep-2-pcDNA3.1组细胞(P<0.05)。结论:Beclin1可能通过抑制PI3K/Akt信号通路的活化上调喉癌细胞对紫杉醇的敏感性。     

塞来昔布诱导喉癌Hep-2细胞凋亡的实验研究

目的 探讨环氧化酶-2特异抑制剂--塞来昔布对喉癌Hep-2细胞增殖抑制和凋亡诱导作用及可能机制。方法 以不同浓度的塞来昔布处理喉癌Hep-2细胞,以四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测对细胞增殖的影响, Hoechst33342染色荧光显微镜下观察细胞核的形态改变,以Annexin V/PI双染法检测细胞的凋亡率,Western blot检测Bcl-2、Bax及COX-2的表达, Western blot分析Caspase-3裂解激活。结果 MTT结果表明塞来昔布抑制Hep-2细胞的增殖呈时间和浓度依赖;Hoechst33342 荧光染色见随塞来昔布处理时间延长,细胞核逐渐出现凝集、碎裂等凋亡表现;流式细胞术检测细胞凋亡率见塞来昔布处理细胞24h, 70、100μmol/L组凋亡率分别为(28.9±2.74)%、(32.7±3.96)%;Western blot分析蛋白表达,见随药物处理浓度增加,COX-2、Bcl-2表达降低,Bax表达增加,随药物处理时间延长Caspase-3出现裂解片段。结论 塞来昔布能够有效地抑制Hep-2细胞增殖和诱导Hep-2细胞凋亡,其诱导凋亡作用机制可能与Bax／Bcl-2比值升高,Caspase-3蛋白裂解激活有关。     

DRB对人喉癌Hep-2细胞系中PK-CK2 mRNA表达的影响及其与细胞凋亡的关系

目的探讨5,6-二氯-1--βD-呋喃核糖苯并咪唑(DRB)对人喉癌Hep-2细胞系中蛋白激酶CK2(PK-CK2)mRNA表达的影响及其与细胞凋亡的关系。方法不同浓度的DRB作用于人喉癌Hep-2细胞后,采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Hep-2细胞PK-CK2 mRNA表达水平的变化,采用流式细胞术检测Hep-2细胞凋亡率的变化。结果随着DRB浓度的增加或作用时间的延长,Hep-2细胞PK-CK2 mRNA表达水平呈下降趋势,实验组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),流式细胞术检测二倍体峰前出现凋亡峰,5、10、20、40、80μmmol/L DRB与Hep-2细胞共育2h后的细胞凋亡率分别为0.68%、1.17%、7.25%、10.40%、22.66%。结论DRB可下调Hep-2细胞PK-CK2 mRNA表达水平,诱导细胞凋亡,这些可能是DRB抗癌作用的重要机制之一。     

榄香烯联合热疗对Hep-2细胞周期进程及凋亡率的实验观察

目的观察榄香烯联合热疗对体外培养的Hep-2细胞株（人喉癌细胞株）增殖抑制作用。方法应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测不同组别对Hep-2细胞增殖抑制率,流式细胞仪检测Hep-2细胞周期进程的变化及凋亡率,透射电子显微镜观察Hep-2细胞亚细胞水平变化。结果单纯榄香烯组、单纯热疗组及榄香烯联合热疗组,对Hep-2细胞增殖抑制率分别为28.8%、25.7%和47.1%,榄香烯联合热疗组能显著提高Hep-2细胞增殖抑制率。细胞周期进程发生明显改变：G1期细胞增多,S期细胞减少,G2/M期细胞相对增多,凋亡率上升。透射电子显微镜下可见线粒体肿胀,核染色质趋边凝集及凋亡小体。结论榄香烯联合热疗能够抑制Hep-2细胞增殖,抑制Hep-2细胞G1期向S期转化进程,诱导Hep-2细胞凋亡。     

靶向阻断COX-2信号通路对喉癌细胞生长的影响

目的观察赛来昔布靶向阻断COX-2信号通路对喉癌细胞生长的影响。方法用不同浓度的赛来昔布处理喉癌细胞Hep-2,通过MTT法检测赛来昔布对喉癌细胞的生长抑制率的影响。用浓度为15μmol/L的赛来昔布处理Hep-2细胞,通过流式细胞学检测药物处理前后细胞周期、凋亡率的差异,运用Western blot检测药物处理前后相关蛋白EGFR和COX-2表达的差异。结果赛来昔布处理后的Hep-2细胞与药物浓度成比例地出现生长抑制率增高;赛来昔布干预组细胞G1期比例大于对照组（P〈0.01）,凋亡率明显升高（P〈0.05）;与对照组相比,赛来昔布干预组出现明显的p-EGFR,COX-2表达降低（P〈0.05）。结论赛来昔布能抑制喉癌细胞株Hep-2生长,增加Hep-2细胞G1期阻滞,降低肿瘤细胞增殖能力和诱导细胞凋亡;赛来昔布可抑制喉癌细胞COX-2的表达和EGFR的磷酸化。提示COX-2抑制剂可能作为喉癌靶向治疗的新方法。     

反义Stat3基因诱导喉癌细胞凋亡的线粒体机制探讨

目的:探讨Stat3反义寡脱氧核苷酸转染人喉癌Hep-2细胞株后,细胞内线粒体的改变,为阐明喉癌细胞凋亡的机制奠定一定的理论基础,为临床上喉癌的治疗开辟一条新思路。方法:将设计好的Stat3反义寡核苷酸序列(ASODN),应用脂质体转染法以不同浓度转染人喉癌Hep-2细胞,并设空白组(MOCK)及正义对照组(SODN)作为比较,检测各转染组Hep-2细胞中线粒体膜电势、电压依赖性阴离子通道(VDAC)以及Cyt-c,以判断线粒体的变化。结果:随着ASODN浓度的增加,线粒体膜电势降低,VDAC逐渐增加,Cyt-c释放逐渐增多。结论:在Stat3影响人喉癌Hep-2细胞凋亡的机制中,线粒体途径发挥了作用。初步阐明Stat3影响喉癌细胞增殖的调控机制,为临床治疗提供了新的研究靶点。     

染料木黄酮对喉癌Hep-2细胞系增殖和凋亡的影响

目的　探讨染料木黄酮（genistein,Gen）对人鳞状细胞喉癌Hep-2细胞系增殖和凋亡的影响。方法　用CCK-8法检测不同浓度Gen对Hep-2细胞系增殖的影响;用实时荧光定量聚合酶链反应（Real-Time PCR）检测Gen对Hep-2细胞系血管内皮生长因子受体-3（vascular endothelial growth factor receptor-3,VEGFR-3）mRNA表达的影响;用流式细胞术检测Gen单独及联合VEGFR-3特异性阻滞剂MAZ51对Hep-2细胞系凋亡的影响;Western blot检测各组AKT蛋白表达及其磷酸化水平。结果　Gen可抑制Hep-2细胞系增殖,且抑制作用呈剂量依赖性;Gen能抑制Hep-2细胞系的VEGFR-3 mRNA表达,抑制率为32%;单用Gen和MAZ51均能诱导Hep-2细胞系凋亡,二者联合应用对Hep-2细胞系的凋亡诱导作用明显增强;Gen与MAZ51均能抑制AKT第308位苏氨酸（Thr308）及第473位丝氨酸（Ser473）磷酸化激活,使p-AKT-Thr308和p-AKT-Ser473减少,两种药物合用抑制率更高。结论　Gen可通过抑制VEGFR-3表达阻止AKT磷酸化激活,并发挥抑制喉癌细胞增殖和诱导其凋亡的抗癌作用。     

白细胞介素-24对喉癌细胞的增殖抑制效应及机制

目的：研究腺病毒介导的人白细胞介素-24（Ad—mda-7／IL-24）基因对喉癌细胞Hep-2增殖抑制效应及机制。方法：将携带有hIL-24基因的重组复制缺陷型腺病毒（Ad-hIL-24）感染喉癌细胞Hep-2,并以正常人脐静脉内皮细胞HUVEC为对照,采用RT-PCR方法检测Hep-2、HUVEC细胞中外源性hIL-24表达,以及Bcl-2和Bax的变化;采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测细胞的生长和凋亡情况。结果：腺病毒介导的hIL-24mRNA能在Hep-2细胞和HuVEC细胞中表达;在Hep-2细胞中,抗凋亡分子Bcl-2表达降低,而促凋亡分子Bax表达增强;在HUVEC细胞中Bcl-2表达没有变化,Bax表达有所增强。MTT法显示Ad—hIL-24能明显抑制喉癌细胞Hep-2的生长。在Hep-2细胞中,显微镜下可见明显的细胞凋亡。结论：Ad—hIL-24能抑制喉癌细胞Hep-2生长和诱导Hep-2细胞凋亡,但对正常细胞无毒性作用。     

RNA干扰细胞周期蛋白D1对Hep-2周期和凋亡的影响

目的研究小干扰RNA(small interferingRNA,siRNA)抑制细胞周期蛋白D1(cyclin D1)对喉鳞状细胞癌(简称喉癌)细胞生长和凋亡的影响。方法通过脂质体转染试剂将针对cyclin D1的特异小干扰RNA转入喉癌细胞,利用MTT法检测喉癌细胞生长抑制情况,流式细胞技术检测喉癌细胞周期变化和细胞凋亡。结果MTT结果表明喉癌细胞生长受到抑制,并具有时间依赖性。同时实验组喉癌细胞周期受到影响,并检测到喉癌细胞的凋亡。结论Cyclin D1基因沉默后,喉癌细胞生长受到了抑制,细胞周期受到影响,并能够最终导致喉癌细胞凋亡。     

中药土贝母对Hep-2细胞株诱导分化的研究

目的：为了观察土贝母对Ｈｅｐ－２细胞株诱导调亡的机制。方法：应用ＭＴＴ比色法和流式细 胞仪测定细胞周期的变化，并应用电子显微镜技术观察诱导分化后亚细胞结构。结果：土贝母制剂对 Ｈｅｐ－２细胞株有明显的抑制作用，且呈剂量依赖性，流式细胞仪分析，不同的药物浓度和不同的作用时 间凋亡的发生差异均有显著意义，Ｇ１期细胞堆积，Ｓ期细胞减少，Ｇ２／Ｍ期细胞相对增多，亚细胞结构， 细胞线粒体肿胀变性，核固缩。结论：土贝母制剂能阻上Ｇ０／Ｇ１期细胞向Ｓ期转化进程，抑制Ｈｅｐ－２增 殖，促进Ｈｅｐ－２细胞凋亡。     

RNA干扰DJ-1基因抑制喉癌细胞的增殖

目的 探讨RNA干扰(RNAi)抑制喉癌Hep-2细胞DJ-1基因的表达及观察其细胞效应.方法 设计合成3对特异性针对人DJ-1基因的小干扰RNA(siRNA),脂质体法转染Hep-2细胞,实验分为4组:瞬时转染非特异性siRNA对照组及转染特异性siRNA 3组(siRNA1、siRNA2、siRNA3).采用RT-PCR检测DJ-1 mRNA,蛋白免疫印迹法检测DJ-1蛋白,流式细胞仪检测细胞凋亡及四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测特异性siRNA1组对Hep-2细胞效应.结果 本实验设计合成的3对特异性siRNA均不同程度地抑制DJ-1基因表达,其中特异性siRNA1组抑制效果最佳.M1Tr比色法结果显示特异性siRNAl组(终浓度50 nmo~L、100 nmolZL)对Hep-2细胞增殖具有抑制作用.流式细胞仪检测结果最示特异性siRNA1组能诱导Hep-2细胞凋亡,转染特异性siRNA1组凋亡率为(15.7±4.8)%,非特异性siRNA对照组凋亡率为(4.5±0.4)%,非特异性siRNA对照组与特异性siRNA1组凋亡率比较差异有统计学意义(t=4.736,P<0.01).结论 转染特异性siRNA组能有效抑制Hep-2细胞增殖,诱导Hep-2细胞凋亡.     

Inhibiting XIAP expression by RNAi to inhibit proliferation and enhance radiosensitivity in laryngeal cancer cell line

Objectives

X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) is a novel member of the inhibitors of apoptosis (IAPs) family. The overexpression of XIAP is asscociated with radioresistance of human malignancies. The purpose of the present study was to investigate the effect of shRNA-targeted XIAP on the proliferation, apoptosis and radiosensitivity of human laryngeal carcinoma cells (Hep-2).

Methods

A siRNA expression vector (pSilencer4.1-XIAPshRNA) was constructed and stably transfected into human laryngeal carcinoma cells (Hep-2). The downregulation of XIAP expression was evaluated by RT-PCR and Western blot analyses. Then, we investigated the effect of XIAP-shRNA on the proliferation, cell cycle changes and apoptosis in vitro of Hep-2 cells. Finally, the radiosensitivity of Hep-2 cells was investigated by clonogenic cell survival assay.

Results

We established stably transfected cell line (Hep-2/XIAPshRNA) in which the expression of XIAP gene was downregulated. The cell viability of Hep-2/XIAP-RNA cells was obviously decreased compared with that of untransfected Hep-2 cells. Morever, XIAP-shRNA induced cell arrest in the G₀/G₁ phase of cell cycle by flow cytometry analysis. Results of TUNEL assay indicated that Hep-2 cells stably transfected pSilencer4.1-XIAP-shRNA showed obvious apoptosis characters. Furthermore, the downregulation of XIAP expression could lead to significant radiosensitivity enhancement in laryngeal carcinoma cells.

Conclusions

RNAi-mediated downregulation of XIAP expression can inhibit proliferation, induce apoptosis and diminish the radioresistance of laryngeal carcinoma cells, so combined therapy with XIAP inhibition and radiation may be a potential strategy for the treatment of laryngeal carcinoma.     

吲哚美辛对人喉癌Hep-2细胞系的生长及侵袭作用的研究

目的：通过体外实验评价吲哚美辛对人喉癌Hep-2细胞系的抑制作用。方法：应用不同浓度的吲哚美辛作用于人喉癌Hep-2细胞系，进行细胞形态观察，锥虫蓝染色法检测细胞生长情况和流式细胞仪分析细胞DNA含量。Hep-2细胞经吲哚美辛作用后，撤药培养，绘制生长曲线，并用软琼脂集落形成实验检测肿瘤细胞非锚着生长能力，琼脂糖滴法检测肿瘤细胞移动能力，单层细胞侵袭实验计算肿瘤侵袭指数。结果：Hep-2细胞系在吲哚美辛作用下，细胞生长形态改变，细胞增殖缓慢，流式细胞仪分析形成明显的亚二倍体峰。细胞毒性与药物剂量及作用时间有依赖关系。吲哚美辛作用后的Hep-2细胞软琼脂集落形成数目减少，细胞移动能力下降，单层细胞侵袭指数降低，但生长曲线较对照组无明显差异。结论：吲哚美辛抑制人喉癌细胞系Hep-2生长，诱导凋亡，降低细胞的侵袭性。     

蛋白激酶CK2α特异性小干扰RNA对喉癌细胞生长的抑制作用

目的探讨蛋白激酶CK2α特异性小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）对人喉癌细胞系Hep-2增殖和凋亡的影响。方法构建蛋白激酶CK2α特异性siRNA表达质粒psiRNA-hHlneo-CK2及非特异性表达质粒psiRNA-hH1 neo-cont，分别用脂质体转染法转染Hep-2细胞。采用逆转录聚合酶链反应、Western Blot技术检测转染后蛋白激酶CK2αmRNA和蛋白表达，采用四甲基偶氮唑蓝法检测转染后Hep-2细胞的增殖情况，流式细胞术检测转染后对Hep-2细胞凋亡的影响。结果转染psiRNA-hH1 neo-CK2载体后，Hep-2细胞蛋白激酶CK2α mRNA和蛋白表达均较非特异干扰组和空白组明显下降（P〈0．05），Hep-2细胞生长缓慢（P〈0．05），其细胞周期出现明显亚二倍体峰（P〈0．05）。结论蛋白激酶CK2α特异性siRNA表达载体可以下调Hep-2细胞蛋白激酶CK2α的表达，抑制细胞增殖并诱导其凋亡。