人SYNOVIOLIN基因真核表达载体的构建及表达

目的：构建携EGFP的人SYNOVIOLIN基因真核表达载体。方法：应用基因重组技术,根据人SYNOVIOLIN基因序列和表达载体pIRES2-EGFP质粒上的多克隆位点设计引物,对含有SYNOVIOLIN基因的质粒pCDNA3-syno扩增,得到约1900 bp的目的片段,进行T-A克隆。SalⅠ/BamHⅠ双酶切测序正确的重组质粒,回收SYNOVIOLIN cDNA片段,将其亚克隆于pIRES2-EGFP载体的多克隆位点内得到质粒pIRES2-EGFP-syno。脂质体法转染HEK293细胞, 用激光共聚焦显微镜和Western blot检测EGFP和SYNOVIOLIN在HEK293细胞的表达。结果：PCR,酶切及测序结果表明pIRES2-EGFP-syno真核表达载体构建成功,激光共聚焦显微镜和Western blot显示EGFP和SYNOVIOLIN蛋白在HEK293细胞中成功表达。结论：成功构建pIRES2-EGFP-syno真核表达载体并在HEK293细胞表达,为抗肌腱粘连的　SYNOVIOLIN基因治疗研究奠定基础。     

人上皮细胞黏附分子融合蛋白真核表达载体的构建、表达及初步鉴定

目的 :构建pIg EpCAM及pEGFP EpCAM真核表达载体 ,并在COS7细胞中表达。方法 :用PCR扩增EpCAMcDNA ,酶切后分别与pIg及pEGFP两种载体连接 ,用脂质体法转染COS7细胞。用免疫沉淀法检测pIg EpCAM的表达产物 ;用荧光显微镜观察EpCAM GFP的表达。结果 :DNA序列测定的结果显示 ,pIg EpCAM及pEGFP EpCAM载体的构建正确。免疫沉淀的结果显示 ,转染pIg EpCAM的COS7细胞的培养上清中含有相对分子质量 (Mr)为 6 5 0 0 0的融合蛋白 ,该蛋白与抗人IgGFc段的mAb具有良好的免疫反应性。荧光显微镜观察可见 ,转染空载体pEGFP的COS7细胞中绿色荧光均匀地分布于胞质和胞核 ;而转染pEGFP EpCAM的COS7细胞中绿色荧光主要分布于细胞表面。结论 :成功地构建了两种EpCAM的真核表达载体 ,并在COS7细胞中表达 ,为EpCAM的功能研究创造了条件 ,并为制备抗EpCAM的mAb提供了免疫原     

小鼠TIM2基因真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建真核表达载体pIRES2-EGFP-TIM2,并在小鼠肝癌细胞系H22中进行表达。方法:用RT-PCR法扩增得到TIM2基因,构建重组真核表达载体pIRES2-EGFP-TIM2,并进行BamHI及BglⅡ双酶切鉴定和测序。通过脂质体法转染H22细胞,用RT-PCR法检测H22细胞中TIM2mRNA的表达。结果:构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-TIM2,用脂质体法转染H22细胞后,用荧光显微镜观察和RT-PCR法检测,可见细胞内有EGFP及TIM2mRNA的表达。结论:成功地构建重组真核表达载体pIRES2-EGFP-TIM2,并在小鼠H22细胞中表达,为进一步研究TIM2在肿瘤生物治疗中的应用奠定了基础。     

iNOS基因和iNOS-VP1融合基因真核表达载体的构建及初步表达

目的 构建pcDNA3．1介导的诱导性一氧化氮合成酶（iNOS）的基因表达载体和pcDNA3．1介导的iNOS与柯萨奇病毒B组3型（CVB3）结构蛋白VP1融和基因的表达载体。方法 应用PCR扩增和DNA重组技术构建pcDNA3．1-iNOS和pcDNA3．1-iNOS—VP1表达载体；应用真核细胞转染技术及间接免疫荧光技术进行所构建的真核表达载体的初步表达和鉴定。结果 经PCR扩增技术用特异引物从质粒pKSiNOS分离编码iNOS开放阅读框架的cDNA，TA克隆于pMD19-T载体，根据设计引物时加入的酶切位点将插入片断亚克隆于表达载体pcDNA3．1；经PCR扩增技术用特异引物从质粒pCR2．1-VP1分离编码CVB3VP1结构蛋白的cDNA，TA克隆于pMD19-T载体，根据设计引物时加入的酶切位点将VP1亚克隆于iNOS的表达载体pcDNA3．1-iNOS，从而构建含有iNOS和VP1融合基因的真核表达载体。限制性内切酶分析、PCR鉴定和测序证实重组体peDNA3．1-iNOS和peDNA3．1-iN—OS—VP1插入片断的大小和方向正确且开放阅读框架的读码框不变；重组质粒peDNA3．1-iNOS和peDNA3．1-iNOS．VP1在HeLa细胞中均有表达，但表达效率较低。结论 获得含iNOS基因和iNOS—VP1融合基因的真核表达载体，并将重组质粒进行了初步表达，为体外iNOS抗CVB3作用的研究奠定了物质基础。     

人重组pMAGE-A1/EGFP真核表达质粒的构建与表达

目的　特异克隆MAGE A1开放读码框基因,构建以绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的包含MAGE A1的真核表达载体并转染人PBMC来源DC细胞。方法　根据MAGE A1特征序列设计PCR扩增引物,从Mel 5 2 6中扩增MAGE A1基因开放读码框,并克隆至pIRES EGFP中,构建人重组pMAGE A1 EGFP真核表达质粒。利用电转染方法将该重组质粒转入人外周血来源DC细胞并检测MAGE A1和EGFP的表达情况。结果　成功构建真核表达质粒pMAGE A1 EGFP ,转染人PBMC来源DC细胞并检测到MAGE A1和EGFP表达,两者表达率分别为(8.8±0 .9) %和(8.4 7±0 .78) % ,无统计学差异。结论　成功构建人重组真核表达质粒pMAGE A1 EGFP ,为开展MAGE A1为基础的免疫治疗提供有利的分子生物学工具。     

人TRAM基因真核表达载体的构建

目的 构建TRAM基因真核表达载体,为研究TRAM的功能提供研究工具。方法 首先采用PCR方法扩增人TRAM蛋白相应的编码序列,将扩增的特定片段克隆至pCMV-N-Flag真核表达载体。然后,对重组载体进行DNA测序,确认序列正确后将重组载体转染至HEK-293T细胞,并用Western blot方法检测TRAM蛋白的表达以评价载体是否构建成功。结果 菌落PCR电泳可检测到800 bp附近出现目的条带,质粒DNA测序显示载体插入705 bp的核苷酸序列,其序列与TRAM完全一致。Western blot检测到HEK-293T细胞高表达带Flag标签的TRAM蛋白。结论 基于PCR扩增、双酶切、酶连接扩增片段和载体成功构建带Flag标签的TRAM真核表达载体。构建的质粒可为进一步研究干扰素的调控和抗病毒免疫治疗提供一种研究工具。     

小鼠H2B-GFP真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建小鼠H2B-绿色荧光蛋白（GFP）真核表达载体,为动态观察小鼠细胞中染色体的形态变化,进一步研究小鼠耐药细胞中双微体（DMs）的形成机制提供有效的分子工具。方法 利用RT-PCR的方法获得小鼠H2B cDNA,以羧基端插入pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO载体上,构建H2B-GFP真核表达载体,经菌液PCR、酶切及DNA测序鉴定插入片段大小、方向及序列的正确性,提取质粒转染小鼠胚胎成纤维细胞系NIH3T3进行鉴定。结果 经菌液PCR、酶切和测序,证明小鼠H2B-GFP真核表达载体含有大小、方向及序列正确的H2B cDNA片段,转染NIH3T3后在细胞核中表达。结论 作者成功构建了同时携带有G418筛选位点及多酶切位点的小鼠H2B-GFP真核表达载体,为其在小鼠体外培养细胞中的表达奠定了基础。     

含绿色荧光蛋白和小鼠T-bet基因双顺反子真核表达载体的构建及其在A549细胞中的表达

目的 构建一种带有绿色荧光蛋白(GFP)和小鼠T-bet基因双顺反子的新型真核表达载体pCI-mT-bet-IRES-GFP.方法 利用脑炎心肌炎病毒(EMCV)的内部核糖体进入位点(IRES),将GFP的cDNA与小鼠T-bet基因(mT-bet)连接到真核表达载体pCI中,构建含GFP和mT-bet基因双顺反子的重组质粒.结果 成功构建了含GFP和mT-bet基因双顺反子的真核表达载体.荧光显微镜下可观察到发绿色荧光的转基因细胞.结论 含绿色荧光蛋白和mT-bet基因双顺反子真核表达载体的构建为哮喘基因治疗研究提供了新的生物表达体系.     

带c-Myc标签的Mdfic基因真核表达载体构建及其在成肌细胞中的表达

目的构建新型转录因子Mdfic和c-Myc标签融合表达的真核表达载体pcDNA3.1-Mdfic-Myc,实现其在成肌细胞C2C12中的表达。方法 PCR方法扩增Mdfic的开放阅读框,酶切后的PCR扩增产物和退火后的人工合成的c-Myc标签共同克隆至pcDNA3.1（＋）真核表达载体中,构建pcDNA3.1-Mdfic-Myc融合表达质粒。重组质粒经过PCR、双酶切和测序鉴定后,脂质体法转染C2C12细胞。RT-PCR和Western blotting方法检测转染后细胞中Mdfic-Myc的表达。结果成功构建了pcDNA-Mdfic-Myc真核表达质粒;RT-PCR和Western blotting结果表明,Mdfic-Myc融合蛋白在成肌细胞C2C12中获得高效表达。结论 pcDNA3.1-Mdfic-Myc融合表达质粒的成功构建及其在成肌细胞中的表达为进一步体外研究Mdfic蛋白单独的功能及其与其他分子间功能性相互作用奠定了基础。     

大鼠CD36基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建大鼠CD36真核表达载体,并在293T细胞中表达.方法:应用RT-PCR技术,从大鼠肺泡巨噬细胞NR8383细胞提取的总RNA中,获得CD36基因编码序列片段,克隆至真核表达载体pEGFP-N1中,对重组质粒进行酶切和测序鉴定后,以脂质体介导法转染至293T细胞,通过荧光显微镜和Western blot检测其在293T细胞中的表达.结果:酶切和测序证明重组真核表达载体pEGFP-N1-CD36构建成功,荧光显微镜及Western blot确认目的基因序列在293T细胞中过表达.结论:成功构建大鼠CD36基因的重组真核表达载体pEGFP-N1-CD36,并在293T细胞中过表达.     

Salusin-a基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的:研究增强型绿色荧光蛋白真核表达载体Salusin-a(pEG-FP-Salusin-a)的构建及在人胚胎肾细胞系293细胞(HEK293)中的表达。方法:提取人单核细胞系THP-1细胞Salusin-a的mRNA,逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)扩增Salusin-a基因,克隆入pEGFP-N3载体,双酶切、菌落PCR及测序鉴定pEGFP-Salusin-a质粒。用脂质体转染pEGFP-Salusin-a入HEK293细胞,分为转染细胞组、质粒对照组和空白对照组,检测分析各组荧光蛋白和Salusin-a基因的表达。结果:成功构建pEGFP-Salusin-a质粒,并转染HEK293,细胞转染效率86%,转染细胞组和质粒对照组绿色荧光蛋白的表达明显高于空白对照组(P0.05);转染细胞组Salusin-amRNA的表达明显高于质粒对照组和空白对照组(P0.05)。结论:重组pEGFP-Salusin-a质粒能转染HEK293细胞并表达Salusin-a,为Salusin-a基因功能的进一步研究提供了实验基础。     

血管内皮细胞黏附分子胞外区基因真核表达载体构建及表达

目的构建并表达血管内皮细胞黏附分子(VCAM-1)胞外区基因真核表达载体。方法从小鼠NIH/3T3细胞提取总RNA,以其为模板通过RT-PCR扩增VCAM-1胞外区(D1-D4结构域)cDNA。利用PCR获得VCAM-1胞外区基因,连接pMD19-T载体,进行基因序列测序。将VCAM-1 D1-D4目的片段插入到真核表达载体pIRES2-AcGFP1-Nuc中,构建重组真核表达质粒pIRES2-AcGFP1-Nuc-VCAM-1。经双酶切鉴定VCAM-1胞外区基因真核表达载体构建的成功与否。利用脂质体把pIRES2-AcGFP1-Nuc-VCAM-1导入至人B淋巴性白血病细胞株(Raji)内。结果基因测序结果表明成功扩增出VCAM-1胞外区基因,双酶切鉴定表明重组的真核表达质粒pIRES2-AcGFP1-Nuc-VCAM-1构建成功。Western blot结果显示导入pIRES2-AcGFP1-Nuc-VCAM-1质粒的Raji细胞中VCAM-1高表达。细胞结合实验表明,表达的VCAM-1与前B细胞(70Z/3)表面的VLA-4特异性结合。结论 VCAM-1真核表达载体构建及表达成功,为前B细胞克隆形成机理以及为B细胞分化发育研究提供实验依据。     

HBV基因组各基因真核表达载体的构建及转染

目的 构建HBV基因组各基因真核表达载体,转染HepG2细胞,建立稳定转染的HepG2细胞系.方法 采用PCR方法,以HBV全基因组质粒为模板扩增HBV基因的各基因片段,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染HepG2细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的HepG2细胞系,用细胞流式技术及细胞免疫组化技术检测HBV各基因产物在细胞内的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1( )/HBs、pcDNA3.1( )/HBc、pcDNA3.1( )/HBe、pcDNA3.1( )/HBp、pcDNA3.1( )/HB-preS1、pcDNA3.1( )/HB-preS2、pcDNA3.1( )/HBx真核表达载体,并建立了稳定转染的HepG2细胞系,成功地表达目的 基因.结论 真核表达载体成功构建和稳定转染HepG2细胞系的建立为进一步研究各基因的功能奠定良好的实验基础.     

MAGE-3基因真核表达载体构建及在小鼠黑色素瘤细胞中的表达

目的　扩增人黑色素瘤抗原 3(Melanomaantigen 3,MAGE 3)基因 ,构建真核表达载体 ,并在小鼠黑色素细胞瘤B16中进行表达。方法　采用PCR扩增MAGE 3基因 ,连接到真核表达载体pIRES2 EGFP中 ,构建真核表达载体pIRES2 EGFP MAGE 3,脂质体法转染小鼠黑色素瘤B16细胞。G4 18筛选阳性克隆 ,荧光显微镜和RT PCR分别检测阳性克隆中增强型绿色荧光蛋白 (Enhancedgreenfluorescentprotein ,EGFP)的表达和MAGE 3mRNA的表达。结果　从pUC19 MAGE 3重组质粒中扩增获得一条约 95 0bp的片段 ,成功构建了真核表达载体pIRES2 EGFP MAGE 3,转染B16细胞后筛选得到阳性克隆 ,可见融合蛋白表达产生明亮的绿色荧光 ,RT PCR检测到MAGE 3mRNA的表达。结论　成功构建了真核表达载体pIRES2 EGFP MAGE 3,获得了稳定表达该载体的小鼠黑色素瘤B16细胞系 ,为研究MAGE 3在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了基础。     

人生长激素基因真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建人生长激素的真核细胞表达载体,测定并分析目的 基因序列.方法 用PCR方法扩增出人生长激素基因,连接至T克隆载体,然后分别亚克隆至真核细胞表达载体pCDNA3.1、pCEP4中.使用DNA ssist软件分析序列.结果 所构建真核表达载体的酶切鉴定、PCR鉴定、测序鉴定均正确.结论 成功构建出多个人生长激素基因真核细胞表达载体,验证了基因序列的正确性,为下一步基因治疗研究打下基础.     

重组真核表达载体pEGFP-BDNF的构建

目的将脑源性神经生长因子(BDNF)构建到表达质粒(pEGFP-N1)上。方法本实验采用RT-PCR的方法,从大鼠海马总RNA中扩增目的基因,分别用一步法(直接构建到表达载体上)和两步法(先构建到克隆载体再构建到表达载体上)构建重组载体,通过酶切和基因测序筛选鉴定正确的阳性克隆,并对两种方法做简单的比较。结果两种方法构建的重组载体都插入了正确的序列。两步法的转染效率明显高于一步法,但一步法也同样得到了正确的阳性克隆。结论成功构建了pEGFP-BDNF重组表达载体。     

ABO血型基因及亚型真核表达载体的构建及鉴定CSCD

目的构建人ABO血型A101、B101及其CisAB01、Ae105、B（A）04和Bw03亚型真核表达载体,为研究ABO血型基因及砸型基因的功能奠定基础。方法从已知ABO基因分型的标本中（A101,B101）提取总RNA,将其逆转录合成cDNA,经特异性引物扩增目的基因片段,将其定向连接到pcDNA3．1（＋）真核表达载体;采用定点突变PCR的方法构建CisAB01、Ael05、B（A）04和Bw03亚型真核表达载体,通过测序鉴定其序列正确。将ABO血型A101、B101及其CisAB01、Ael05、B（A）04和Bw03亚型真核表达载体分别转染Hela细胞系,通过免疫荧光和Western印迹检测各ABO基因在细胞中的表达。结果测序结果显示扩增到的A101及B101cDNA以正确序列和方式插入载体,CisAB01、Ael05、B（A）04和Bw03亚型真核表达载体的测序结果显示相应位点均成功突变;免疫荧光和Western印迹结果显示A101、B101及其CisAB0l、Ael05、B（A）04和Bw03亚型在Hela细胞中均有表达。结论成功构建了ABO血型基因及亚型基因真核表达载体,体外转染Hela细胞成功表达糖基转移酶,为后续研究奠定了基础。     

载脂蛋白M基因真核表达载体构建及其对HBV复制的影响

载脂蛋白(apolipoprotein,apo)是脂蛋白中的蛋白成分,主要由肝细胞合成,是正常脂蛋白颗粒的装配和分泌所必需的。载脂蛋白M(apoM)是高密度脂蛋白(HDL)胆固醇的主要成分之一,参与HDL的合成和分泌[1]。研究表明HBV感染患者apoM血清学水平升高[2],但apoM能否影响HBV的复制还不清楚。本研究通过构建apoM的真核表达载体,探讨apoM对HBV复制的影响。     

SEDL基因及其突变体真核表达载体的构建与鉴定

目的构建SEDL基因及其突变体与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体的融合表达质粒pEGFP-C3-SEDL并获得表达。方法分别提取X连锁迟发性脊柱骨骺发育不良(SEDT)患者和正常对照外周血淋巴细胞RNA,RT-PCR方法扩增SEDL基因cDNA,双酶切后克隆至pEGFP-C3空载体,构建表达质粒pEGFP-C3-SEDL。双酶切和DNA测序鉴定后,转染COS-7细胞,通过流式细胞仪和荧光显微镜观察重组蛋白表达情况。结果 DNA测序显示重组真核表达载体pEGFP-C3-SEDL构建成功,SEDL基因c.370-371ins A突变位点被成功克隆到突变体重组质粒中。荧光倒置显微镜观察证实重组质粒均能在细胞内进行蛋白表达。结论 SEDL基因及其突变体真核表达载体的成功构建为其进一步研究SEDL基因突变致SEDT的分子机制奠定了基础。