牙龈卟啉单胞菌c-di-AMP代谢相关基因的克隆及表达纯化

目的 克隆牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）中负责c-di-AMP代谢的相关基因,并使其在大肠杆菌中正确表达及高效纯化。方法 通过聚合酶链反应（PCR）克隆牙龈卟啉单胞菌ATCC33277的pgn0523、pgn1187和pgn2003三个基因,经过酶切后将目的基因片段与大肠杆菌表达质粒pET28a连接,分别构建出重组表达质粒pETpgn0523 pETpgn0523、pET-pgn1187和pET-pgn2003。将重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达重组蛋白,通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析和鉴定。用镍离子金属亲和层析法对重组蛋白进行分离纯化,BCA法检测目的蛋白的浓度。结果 目的基因pgn0523、pgn1187和pgn2003扩增产物条带与预期大小一致。重组表达质粒pET-pgn0523、pET-pgn1187和pET-pgn2003及其PCR产物琼脂糖凝胶电泳验证与预期大小相符,测序结果与GenBank中牙龈卟啉单胞菌ATCC33277国际标准菌株的基因序列100%一致。IPTG诱导后的菌体经SDS-PAGE检测得到3个大小分别为19.5×10³、39.9×10³、66.0×10³的蛋白质增强条带,与预期大小相符。镍离子金属亲和层析柱纯化得到的蛋白与预期目的蛋白分子量一致,BCA法测定目的蛋白的浓度分别为0.708、0.523和0.861 mg·mL^-1。结论 本研究成功克隆并表达纯化了牙龈卟啉单胞菌c-di-AMP代谢相关蛋白,得到了较高浓度和纯度的目的蛋白,为进一步探究牙龈卟啉单胞菌c-di-AMP的生理功能及体内代谢途径奠定了基础。     

牙龈卟啉单胞菌精氨酸牙龈素催化结构域基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 克隆牙龈卟啉单胞菌精氨酸牙龈素催化结构域（RgpAcd）基因,并将其置于大肠杆菌中作融合表
达。方法 利用PCR技术和基因重组技术,克隆牙龈卟啉单胞菌RgpAcd,然后插入中介载体pMD18-T中并测序鉴定。将目的基因片段插入原核表达载体pET-15b来构建表达质粒pET-15b/RgpAcd。重组原核表达质粒经酶切鉴定后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达融合蛋白。结果 核酸序列测定与分析的结果表明,克隆的1 476 bp基因序列与GenBank数据库中的序列呈现100%同源性;IPTG诱导后的菌体经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后有一个相对分子质量为5×104的融合表达蛋白产生。结论 本实验成功克隆了牙龈卟啉单胞菌RgpAcd基因,并在大肠杆菌中表达了RgpAcd蛋白,为进一步研制重组活载体疫苗奠定了基础。     

伴放线放线杆菌cdtB基因克隆及其表达蛋白的体外生物学活性检测

目的 体外构建伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans,Aa)CdtB蛋白的原核表达载体并诱导其表达,通过变性、复性获得有Ⅰ型脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease Ⅰ,DNase Ⅰ)样活性的重组CdtB蛋白,为进一步研究AaCdtB的功能以及Aa细胞致死性扩张毒素三聚体全毒素在牙周炎发生、发展过程中的分子致病机制奠定基础.方法 以AaATCC29522基因组DNA为模板,采用聚合酶链反应(PCR)法获得cdtB基因,经双酶切、连接的定向克隆技术构建原核表达载体pET-15b-cdtB.转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导CdtB蛋白表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)及蛋白质印迹法检测并鉴定蛋白表达.纯化的重组CdtB体外与超螺旋质粒(pET-32a)DNA孵育,观察其生物学活性.结果 经测序鉴定,构建的原核表达载体pET-15b-cdtB转染的感受态大肠杆菌携带有cdtB基因,该基因片段与GenBank中已收录的AacdtB基因序列一致性高达99%.SDS-PAGE观察到32 000左右的高表达蛋白条带,蛋白质印迹法发现带有6个组氨酸蛋白标签标记的目的 蛋白CdtB.超螺旋质粒DNA与CdtB体外孵育后发生了解螺旋现象.结论 本项研究成功构建了AaCdtB的原核表达载体并诱导CdtB蛋白的体外表达,获得了具有DNaseⅠ样活性的重组CdtB蛋白.     

小鼠重组釉蛋白32000多肽的原核表达和纯化

目的 在大肠杆菌中表达小鼠重组釉蛋白32 000多肽,为进一步制备抗鼠釉蛋白抗体和釉蛋白功能研究奠定基础.方法 利用聚合酶链反应(PCR)法扩增出编码小鼠釉蛋白32 000多肽的cDNA序列,将所得基因片段插入pGEM-T Easy质粒载体,转化大肠杆菌JM109后挑取阳性克隆,提取重组质粒DNA,并经酶切鉴定后将所克隆的序列312 bp片段连入原核表达载体pGEX-4T1,并于大肠杆菌BL21中诱导表达,行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析.结果 成功构建了重组表达载体pGEX-4T1-EN312,并经异丙基硫代半乳糖苷诱导后,可见相对分子质量(Mr)为47×103的融合蛋白.结论 利用pGEX-4T1-EN312-BL21体系成功获得了小鼠重组釉蛋白32 000多肽在大肠杆菌中的原核表达和初步纯化.     

人釉原蛋白成熟肽基因的原核表达和纯化

目的 建立人釉原蛋白(amelogenin,AMG)成熟肽基因原核表达和纯化的技术路线,获得纯化的人AMG成熟肽蛋白,以期为牙周炎的基础治疗提供依据.方法 通过已构建并经鉴定的重组质粒pGEX-4T-1-AMG,转化BL21大肠杆菌,原核表达后利用谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白纯化系统(glutathione S-transferase fusion protein purification system,GSTrapFF)亲和层析柱进行重组人AMG的纯化.结果 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳图和蛋白质印迹法分析结果显示,获得纯化的相对分子质量为45 000大小GST-AMG融合蛋白和19 000大小的目的 蛋白AMG.结论 利用pGEX-4T-1-AMG-BL21体系成功获得了人AMG成熟肽基因在大肠杆菌中的原核表达和纯化.     

伴放线放线杆菌细胞膨胀致死毒素重组蛋白的表达

目的 通过分子克隆技术构建细胞膨胀致死毒素(cytolethal distending toxin,CDT)的重组表达载体,并诱导重组CDT蛋白的表达,以期为重组CDT蛋白的生物学功能研究奠定基础.方法 采用聚合酶链反应(PCR)扩增获得CDT的编码基因cdtABC,通过TA克隆和限制性酶切将cdtABC与目的载体pQE60连接,转化感受态大肠杆菌后诱导重组COT蛋白的表达,收集细菌总蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹法鉴定.结果 pQE60-cdtABC转染的感受态大肠杆菌中均携带cdtABC基因,该片段与GenBank中的DNA一致性高达99%.细菌总蛋白中21 000、25 000、32 000左右的蛋白增多,蛋白质印迹法检测发现带有6-His标记的目的蛋白.结论 本研究成功构建了CDT的重组表达载体,并诱导重组CDT蛋白的表达.     

伴放线放线杆菌细胞膨胀致死毒素重组蛋白的表达

目的 通过分子克隆技术构建细胞膨胀致死毒素(cytolethal distending toxin,CDT)的重组表达载体,并诱导重组CDT蛋白的表达,以期为重组CDT蛋白的生物学功能研究奠定基础.方法 采用聚合酶链反应(PCR)扩增获得CDT的编码基因cdtABC,通过TA克隆和限制性酶切将cdtABC与目的载体pQE60连接,转化感受态大肠杆菌后诱导重组COT蛋白的表达,收集细菌总蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹法鉴定.结果 pQE60-cdtABC转染的感受态大肠杆菌中均携带cdtABC基因,该片段与GenBank中的DNA一致性高达99%.细菌总蛋白中21 000、25 000、32 000左右的蛋白增多,蛋白质印迹法检测发现带有6-His标记的目的蛋白.结论 本研究成功构建了CDT的重组表达载体,并诱导重组CDT蛋白的表达.     

伴放线放线杆菌细胞膨胀致死毒素重组蛋白的表达

目的 通过分子克隆技术构建细胞膨胀致死毒素(cytolethal distending toxin,CDT)的重组表达载体,并诱导重组CDT蛋白的表达,以期为重组CDT蛋白的生物学功能研究奠定基础.方法 采用聚合酶链反应(PCR)扩增获得CDT的编码基因cdtABC,通过TA克隆和限制性酶切将cdtABC与目的载体pQE60连接,转化感受态大肠杆菌后诱导重组COT蛋白的表达,收集细菌总蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹法鉴定.结果 pQE60-cdtABC转染的感受态大肠杆菌中均携带cdtABC基因,该片段与GenBank中的DNA一致性高达99%.细菌总蛋白中21 000、25 000、32 000左右的蛋白增多,蛋白质印迹法检测发现带有6-His标记的目的蛋白.结论 本研究成功构建了CDT的重组表达载体,并诱导重组CDT蛋白的表达.     

伴放线放线杆菌细胞膨胀致死毒素重组蛋白的表达

目的 通过分子克隆技术构建细胞膨胀致死毒素(cytolethal distending toxin,CDT)的重组表达载体,并诱导重组CDT蛋白的表达,以期为重组CDT蛋白的生物学功能研究奠定基础.方法 采用聚合酶链反应(PCR)扩增获得CDT的编码基因cdtABC,通过TA克隆和限制性酶切将cdtABC与目的载体pQE60连接,转化感受态大肠杆菌后诱导重组COT蛋白的表达,收集细菌总蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹法鉴定.结果 pQE60-cdtABC转染的感受态大肠杆菌中均携带cdtABC基因,该片段与GenBank中的DNA一致性高达99%.细菌总蛋白中21 000、25 000、32 000左右的蛋白增多,蛋白质印迹法检测发现带有6-His标记的目的蛋白.结论 本研究成功构建了CDT的重组表达载体,并诱导重组CDT蛋白的表达.     

伴放线放线杆菌细胞膨胀致死毒素重组蛋白的表达

目的 通过分子克隆技术构建细胞膨胀致死毒素(cytolethal distending toxin,CDT)的重组表达载体,并诱导重组CDT蛋白的表达,以期为重组CDT蛋白的生物学功能研究奠定基础.方法 采用聚合酶链反应(PCR)扩增获得CDT的编码基因cdtABC,通过TA克隆和限制性酶切将cdtABC与目的载体pQE60连接,转化感受态大肠杆菌后诱导重组COT蛋白的表达,收集细菌总蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹法鉴定.结果 pQE60-cdtABC转染的感受态大肠杆菌中均携带cdtABC基因,该片段与GenBank中的DNA一致性高达99%.细菌总蛋白中21 000、25 000、32 000左右的蛋白增多,蛋白质印迹法检测发现带有6-His标记的目的蛋白.结论 本研究成功构建了CDT的重组表达载体,并诱导重组CDT蛋白的表达.     

牙龈卟啉单胞菌菌毛fimA基因在大肠杆菌的融合表达

目的：克隆牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因,并使其在大肠杆菌中融合表达。方法：利用PCR方法克隆fimA,并用基因重组融合表达技术获得在大肠杆菌中的表达。结果：克隆基因测序结果与GenBank数据库中的序列呈现99．9％同源性;经诱导表达后可观察到Mr38kDa的融合蛋白。结论：成功克隆了fimA基因,并在大肠杆菌中表达了FimA蛋白,为后续研究奠定了基础。     

牙龈卟啉菌牙龈蛋白酶K催化结构域的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 :克隆牙龈卟啉菌蛋白酶K催化结构域 (kgpcd)基因 ,并使其在大肠杆菌中获得表达。方法 :利用PCR方法克隆kgpcd ,并用基因重组融合表达技术获得在大肠杆菌中的表达。结果 :克隆基因测序结果与GeneBank数据库中的序列一致 ,经诱导表达见Mr为 5 6× 1 0 3 的融合蛋白。结论 :成功克隆了kgpcd的基因 ,并在大肠杆菌中表达了KGPcd蛋白 ,为后续研究奠定了基础     

牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化

目的克隆牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因,构建原核表达载体,诱导其在大肠杆菌中融合表达,并鉴定、纯化其表达产物。方法克隆牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因,构建表达载体pET15b-FimA,转化大肠杆菌BL21（DE3）pLyS感受态细胞;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达融合蛋白,以抗6×His Tag单克隆抗体为一抗,Western blot鉴定、Co2+柱亲和层析纯化融合蛋白。结果克隆的FimA基因序列及插入表达载体中的FimA序列均与GenBank数据库中的序列呈现100%同源性;IPTG诱导后Western blot鉴定4.1×104处有目的蛋白表达;Co2+柱亲和层析法获得纯化的高浓度FimA蛋白。结论本实验成功构建了牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因的原核表达载体pET15b-FimA,并在大肠杆菌中获得成功表达和纯化,为进一步制备牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白单克隆抗体和研制开发预防牙周炎的亚单位蛋白疫苗奠定了实验基础。     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因特异片段在大肠杆菌中的表达

目的原核表达变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因(glucan-bindingproteinCgene,gbpC)特异片段。方法将克隆获得的约0.45kb的gbpC基因特异片段经EcoRⅠ/SalⅠ双酶切后,定向插入pGEX-4T-1中,构建pGEX-4T-1/gbpCE原核融合表达载体,转化感受态大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆,酶切及PCR鉴定后,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropy1-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达融合蛋白GST-GbpCE,SDS-PAGE检测表达产物。结果在SDS-PAGE凝胶上出现一条新生蛋白质条带,其相对分子质量约为43000,与预计大小相符合。结论成功表达gbpC特异片段,获得了融合蛋白GST-GbpCE,可用于制备GbpC抗体。     

融合防龋DNA疫苗pGLUA-P的构建及其细胞表达研究

目的 将变形链球菌（Streptococcus mutans)表面蛋白PAc编码A区和P区（A－P）的序列克隆到真核载体pGLU中，构建出GTF－PAc融合防龋DNA疫苗，并检测其在原核细胞和真核细胞中的表达。方法 将pCIA-P质粒中A－P片段序列与pGLU质粒连接，构建出GTF－PAc融合防龋DNA疫苗pGLUA-P。将pGLUA-P转化大肠杆菌BL21（DE3），以SDS－PAGE电泳鉴定目的蛋白GLUA－P的表达。通过脂质体将pGLUA-P转染大鼠原代肌母细胞，以免疫组织化学检测GLUA－P的表达。结果 GTF－PAc融合防龋DNA疫苗pGLUA-P经酶切分析证实携带GLU和A－P片段。pGLUA-P转化的大肠杆菌BL21（DE3）经IPTG诱导能够表达完整的融合蛋白。pGLUA-P转染的大鼠原代肌母细胞中可检测到融合蛋白的表达。结论 成功地构建了融合防龋DNA疫苗pGLUA-P，所携带的基因序列正确，能够在原核和真核细胞中表达正确的融合蛋白。     

基因重组鼠伤寒沙门氏菌防龋疫苗的研究Ⅱ.携带变形链球菌pac基因表达质粒的构建与初步鉴定

目的：构建携带变形链球菌表面蛋白pac基因A区片段的原核高效表达系统。方法：对含变形链球菌表面蛋白pca基因的pPC41质粒进行PCR扩增,获得了pac基因A区片段,将扩增获得pac基因A区片段与表达质粒pET17-b定向克隆,重组质粒用B HI,EcoRV双酶切后电泳鉴定。结果：获得携带pac基因片段的重组持粒,结论：利用基因工程技术获得的重组质粒为后继工作准备了实验基础。     

牙龈卟啉菌蛋白酶基因rgpA与rgpB蛋白酶区的克隆和表达

目的克隆牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)rgpA、rgpB蛋白酶区,构建rgpA、rgpB蛋白酶区原核表达系统。方法采用聚合酶链式反应(PCR)从PgATCC33277菌株中扩增rgpA、rgpB蛋白酶区,T-A克隆后测定核苷酸序列,构建pET42a的rgpA/rgpB蛋白酶区表达载体,在E.coli BL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导其表达。结果所克隆的PgATCC33277菌株rgpA、rgpB基因蛋白酶区的核苷酸序列与报道的相应核苷酸序列同源性分别为98.9%、99.0%,氨基酸序列同源性分别高达99.2%、99.1%。pET42a-rgpA/rgpB-E.coli BL21DE3系统的蛋白表达量为细菌总蛋白的60%左右。结论本研究成功地构建PgrgpA、rgpB蛋白酶区高效表达系统,为测定RgpA、RgpB免疫原性及作用提供前提。     

牙龈卟啉单胞菌菌毛fimA基因的克隆及表达纯化

目的克隆牙龈卟啉单胞菌菌毛fimA基因并使其在大肠杆菌中正确表达。方法利用PCR方法克隆牙龈卟啉单胞菌fimA基因,构建其原核表达质粒pT-BAD/fimA,获得其在大肠杆菌中的表达,基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）鉴定重组蛋白。以不同质量浓度咪唑缓冲液（250、200、150、100、50 μmol·L-1）洗脱结合在His-tag纯化柱的目的蛋白,选择最佳洗脱质量浓度。结果克隆基因测序结果与GeneBank数据库中的序列呈现99.9%同源性;诱导表达后可观察到相对分子量3.8×104的融合蛋白,经MALDI-TOF-MS检测进一步证实为FimA蛋白。100 μmol·L-1咪唑缓冲液洗脱得到的蛋白质纯度最高,其纯度为95%。结论本实验成功克隆了fimA基因,并获得在大肠杆菌中的正确表达,同时得到纯度较高的FimA蛋白,为后续研制增强免疫应答的高效牙周炎真核表达质粒奠定了基础。