VEGF对白血病树突状细胞诱导CTL杀伤活性的影响

目的观察血管内皮生长因子(VEGF)对白血病树突状细胞(DC)激活的CTL体外杀伤活性的影响。方法K562白血病细胞经5μmol/L VEGF反义寡核苷酸作用24 h后诱导生成DC。流式细胞术检测DC特征性表型(CD40、CD86、HLA-DR和CD83)的表达,MTT法检测DC激发的细胞毒T淋巴细胞(CTL)对靶细胞的杀伤活性。ELISA法检测DC上清中IL-12的表达。结果与正常K562诱生的DC(K562-DC)相比,K562经反义寡核苷酸下调VEGF表达后培养出具有典型特征的DC(AS-K562-DC),它不仅高表达DC免疫表型,而且激活的CTL对K562细胞具有更强的杀伤效应,同时具有更强的IL-12分泌能力(P均<0.05)。结论抑制白血病细胞VEGF表达,能够促进白血病源DC的分化和成熟,激活的CTL在体外具有更强的抗白血病效应。     

K562细胞外泌体诱导特异性CTL生成的研究

为了研究人白血病细胞株K562细胞分泌的外泌体（exosomes）及K562细胞总RNA刺激人树突状细胞（DC）分泌的外泌体能否诱导出K562细胞特异性CTL，采用四步离心法提取K562细胞及K562细胞总RNA刺激人树突状细胞的培养上清液中的外泌体，并诱导CTL生成，以四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测CTL对K562细胞的杀伤作用。结果显示：K562细胞外泌体和K562细胞RNA刺激的DC和外泌体均能明显促进对K562细胞的杀伤活性，与未经外泌体作用的对照组相比有显著性差异（P〈0．05）。外泌体作用后对K562细胞的杀伤作用明显比对HL-60细胞的杀伤作用强，其差异有显著性（P〈0．05）。结论：K562细胞外泌体能够诱导出特异性抗白血病细胞的免疫反应。     

M1-GS RNA靶向作用于K562细胞的研究

目的；探讨带有导引序列的核糖核酸酶P亚单位M1 RNA(M1-GS RNA)转染白血病细胞株K562细胞后对bcr-abl融合基因mRNA及其表达产物的作用效应。方法：含有针对bcr-abl mRNA的M1-GS RNA表达质粒pAVGS4，以X-treme Q2介导转染K562细胞，设置空载体组作为对照，分别在转染后24，48，72和96h收集细胞，以Trizol试剂抽提总RNA，通过RT-PCR检测转染后不同时间bcr-abl mRNA的变化；在转染后48和96h，抽提总蛋白质，通过Western blot检测癌基因的表达产物P210在不同时间的变化。利用半固体琼脂培养方法观察pAVGS4对K562细胞集落形成的影响。结果：pAVGS4转染K562细胞后24，48，72和96h RT-PCR结果显示：在转染后24h，随时间的推移，实验组细胞内bcr-ablmRNA含量下降近1个对数级，72和96h实验组细胞内bcr-abl mRNA的含量接近，而对照组无明显改变。Western blot结果显示：实验组在48h的灰度值是同期对照组的10．4％，96h时为6．7％。K562细胞集落形成分析显示96h后集落抑制率达81．3％。结论：M1-GS RNA可以有效、特异地破坏bcr-abl mRNA，显著下调P210的表达，抑制K562集落形成。     

抑制VEGF表达对白血病来源树突状细胞免疫功能的影响

目的：探讨抑制血管内皮生长因子（VEGF）对白血病来源树突状细胞（Dc）免疫功能的影响。方法：利用反义寡核苷酸下调K562白血病细胞VEGF表达，K562细胞经细胞因子作用诱生白血病DC。利用MTT法检测DC刺激正常外周血T细胞增殖的能力及DC激发的细胞毒T淋巴细胞（CTL）杀伤活性；ELISA法检测DC培养上清液中IL-12及DC与外周血单个核细胞（PBMNC）共同培养液中IFN-γ的含量。结果：K562细胞经5μmol／LVEGF反义寡核苷酸处理24h后VEGF蛋白分泌下降59％，其诱生的DC与正常K562来源的DC相比，实验组DC刺激T淋巴细胞增殖能力、CTL杀伤活性以及DC分泌IL-12和协同刺激外周血单个核细胞分泌TNF-γ的能力明显增强。结论：抑制VEGF表达可促进白血病来源DC免疫功能的成熟。     

转染慢性粒细胞白血病总RNA对树突状细胞介导的抗白血病作用的体外研究

目的体外诱导和鉴定慢性粒细胞白血病-树突状细胞（CML—DC）,并探讨人慢性粒细胞白血病（CML）总RNA体外转染对其介导的特异性细胞毒T淋巴细胞（CTLl对慢性粒细胞白血病细胞杀伤作用的影响。方法分离14例CML患者骨髓单个核细胞．加入rhIL-4、rhGbl—CSF、rhTNF-α诱导培养CML—DC。分别于培养第1、3、6、14d用倒置显微镜进行形态学观察．流式细胞术检测免疫学表型,染色体G显带技术检测其染色体核型,逆转录聚合酶链反应（RT—PCRIl检测bcr—abl融合基因。并于CML-DC培养第5d,加人CML细胞总RNA脂质体转染,或裸总RNA转染,或不加任何试剂继续培养的DC,共三种CML—DC．分别致敏T淋巴细胞．另设以IL-2培养的T淋巴细胞为对照组,比较不同组别的致敏T淋巴细胞的杀伤活性。结果CML骨髓单个核细胞诱导前CDlct、CD83表达均在5％以下。而诱导成熟的CML—DC细胞CDla、CD83阳性表达率分别为20．13~3．43％、26．76＋2．79％,较诱导前均明显增高（P〈0．01）。CML-DC细胞均存在Phl染色体,并表达bcr-abl融合基因。总RNA脂质体转染CML—DC、裸总RNA转染CML—DC、单纯CML—DC分别致敏的T淋巴细胞在效：靶比为20：1时对CML单个核细胞的杀伤效率分别为75．33±3．11％、37．23±2．92％、29．62±1．61％,均明显高于对照组f9．87＋3．43％,P〈0．01）。总RNA脂质体转染的CML—DC所诱导的CTL杀伤活性最强．与后三组杀伤活性均有显著性差异（P〈0．001）。结论CML—DC既具有CML白血病源性．又具有DC细胞的特性,并能诱导特异性CTL杀伤白血病细胞。经脂质体转染CML细胞总RNA可以提高CML-DC介导的CTL特异性杀伤慢性粒细胞白血病细胞。     

RNA特异性干扰bcr-abl融合基因联合p27基因克隆对K562细胞的影响

本研究旨在探讨RNA干扰抑制慢性髓系白血病bcr-abl融合基因表达,以及RNAi和p27基因克隆联合作用对K562细胞的细胞增殖、细胞周期及凋亡等的调控作用。以细胞系K562为研究对象,合成并转染针对K562细胞bcr-abl融合基因融合位点的21nt siRNA,应用Northern blot法检测bcr-abl融合基因的表达,Western blot法检测BCR-ABL蛋白及凋亡相关蛋白BCL-xL的表达;同时应用RT-PCR扩增p27基因,构建P27-pcDNA3.1载体,转染p27基因入缺失p27基因的K562细胞,经筛选得到G418抗性的K562细胞株;经Western blot证实有P27蛋白表达后,联合应用RNA干扰及p27基因克隆,通过MTT法及流式细胞仪等检测联合作用后对K562细胞的细胞增殖、细胞周期及凋亡等的调控作用。结果表明,RNA干扰组K562细胞bcr-abl融合基因的表达水平明显下降,转染24小时时有18.4%的K562细胞发生凋亡,细胞凋亡相关蛋白BCL-xL的表达水平下调,出现明显的G1期阻滞;表达外源性P27蛋白的P27-pcDNA3.1-K562细胞株生长速度明显慢于对照K562细胞株。流式细胞仪检测显示,G0/G1期细胞增多,S期细胞明显减少;RNA干扰与p27基因克隆联合作用于K562细胞后,凋亡细胞比例明显上升(33.4%)。MTT法显示,细胞存活率较单纯p27-K562细胞组及RNA干扰-K562细胞组均明显下降(p0.01和p0.05)。结论:特异性siRNA分子可以抑制bcr-abl融合基因的表达,诱导K562细胞分化或凋亡。RNA干扰联合p27基因克隆对抑制K562细胞增殖及促凋亡方面具有协同作用。     

用携有存活蛋白基因的重组腺病毒载体转染树突状细胞诱导细胞毒T细胞抗淋巴瘤免疫效应

本研究探讨转染survivin（SVV）基因的树突状细胞（DC）体外诱导特异性抗淋巴瘤的免疫效应。对人外周血DC进行诱导培养,以Ad-SVV转染DC,用Westernblot鉴定Survivin的表达,用乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应,用混合淋巴细胞反应（MLR）测定DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力,以ELISA法检测上清中的细胞因子IL-12含量。结果表明：在MLR中,刺激应答比（S/R）为1∶5、1∶10、1∶50和1∶100时,转染Ad-SVV的DC有较强刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力;转染Ad-SVV的DC组所诱发的CTL活性明显高于对照DC组;转染病毒后第2天,转染Ad-SVV的DC组的IL-12分泌水平高于对照DC组。结论：含存活蛋白基因的DC能够在体外诱导特异性CTL效应,对CA46细胞有明显的杀伤作用。     

多药耐药K562/A02和敏感K562细胞来源的树突状细胞介导抗白血病效应对比研究

本研究探讨多药耐药(MDR)白血病K562/A02细胞和敏感K562细胞诱导树突状细胞(DC)分化及介导的抗白血病效应。采用慢性粒细胞白血病(CML)P170糖蛋白(Pgp)高表达的MDRK562/A02细胞、敏感K562细胞在含细胞因子GMCSF(1000U/ml)、IL4(500U/ml)和TNFα(100ng/ml)的RPMI1640完全培养液中诱导分化成DC,以光镜观察细胞形态、流式细胞术检测细胞表型,异基因混合淋巴细胞反应(alloMLR)检测T细胞增殖活性,MTT法测定细胞毒作用。结果表明:培养14天的K562/A02细胞和K562细胞均出现典型的DC形态特征,表达DC的相关分化抗原及共刺激分子CD1a、CD83、HLADR、CD80、CD86。alloMLR检测中,K562/A02DC较K562DC具有更强的刺激异基因T细胞增殖能力(P<0.05)。两种DC激活的CTL分别对K562/A02和K562细胞较HL60细胞具有显著的杀伤活性(P<0.01);更重要的是,K562/A02DC较K562DC激活的CTL对Pgp高表达的MDRK562/A02细胞、HL60/VCR细胞具有更强的细胞毒作用,杀伤活性分别为(40.7±1.3)%、(28.4±0.9)%(P<0.01)和(24.9±1.1)%、(8.2±0.7)%(P<0.01)。结论:Pgp高表达的MDR白血病细胞K562/A02和敏感K562细胞都可在GMCSF、IL4和TNFα作用下诱导分化为成熟DC,均可活化CTL产生特异的抗白血病效应;尤其K562/A02细胞来源的DC可介导针对Pgp高表达的多药耐药白血病的特异细胞毒作用。     

K562/MDR细胞与树突细胞融合诱导P170蛋白特异的细胞毒性T淋巴细胞应答

目的通过细胞融合方法将P170抗原负载树突细胞(DC),探讨能否有效诱导P170蛋白特异的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。方法通过贴壁黏附获得外周血单核细胞,用GM-CSF+ IL-4诱导培养DC,并以TNF-α促进DC成熟,于第7天收获DC,然后分3组:①DC与耐药细胞系K562/MDR细胞融合以负载P170抗原;②DC与K562／MDR细胞共培养;③单独DC培养。通过流式细胞术(FCM)检测PE-P170／FITC-HLA-ABC抗体双标细胞来评估融合率。将3组细胞分别与T细胞共同孵育5 d,通过MTT法比较各组T细胞对P170+靶细胞K562／MDR及HL-60／VCR的杀伤活性。结果采用PEG-DMSO诱导的DC与K562／MDR细胞的融合效率为(22．39±2．55)％,融合细胞同时表达DC表型和P170分子,HLA-ABC和P170双阳性表达率为(26．90±3．63)％,明显高于共培养组的(4．52±1．77)％,融合细胞能激活T淋巴细胞,显示出对P170+靶细胞产生抗原特异细胞毒作用,效靶比为25:1时,对K562／MDR细胞的杀伤率为(65．75±4．65)％,明显高于共培养组[(22．15±2．40)％]。结论K562／MDR与DC融合能够诱导P170蛋白特异的CTL应答,可用于多药耐药白血病的免疫治疗。     

含癌胚抗原片段的重组腺相关病毒转染树突状细胞疫苗的体外杀伤作用

目的：观察研究人外周血单核细胞来源的树突状细胞（DC）转染含癌胚抗原（CEA）片段的重组腺相关病毒后所诱导的特异性T细胞对直肠癌细胞株LOVO和SW480的体外杀伤作用。方法：抽取HLA表型为A11的健康志愿者外周血，分离单核细胞，体外培养，使用含CEA片断的重组腺相关病毒转染未成熟DC，诱导特异性T细胞。检测体外培养的DC和CTL活性，并使用MTT法检测细胞毒性T细胞（CTL）对LOVO细胞的杀伤作用。结果：转染或未转染的体外培养的成熟DC高表达CD40、CD86、IL-12，诱导的细胞毒性T细胞高表达IFN-γ；转染后DC诱导特异性细胞毒性T细胞可有效识别并杀伤HLA-A11阳性的LOVO细胞。结论：重组腺相关病毒转染DC，不明显改变DC表型和刺激淋巴细胞增殖、分化功能，可诱导自体细胞毒性T细胞增殖，含CEA片断的腺相关病毒转染DC诱导自体细胞毒性T细胞对LOVO细胞有明显杀伤作用，DC疫苗可以作为直肠癌患者免疫治疗的有效补充。     

源于细菌DNA的寡核苷酸对K562/A02细胞来源的树突细胞促成熟作用

目的 研究源于细菌CpG基序的寡核苷酸和含细菌短磷酸二酯骨架的寡核苷酸对K562/A02细胞来源的树突细胞(DC)的促成熟作用.方法 联合应用细胞因子rhGM-CSF和rhIL-4诱导K562/A02细胞成为DC.7 d后以瑞特-姬姆萨染色观察细胞形态的变化,流式细胞术检测细胞免疫表型的变化,用同种混合淋巴细胞反应、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性检测、IL-12和IL-6的分泌实验评价DC的成熟程度.然后在DC中分别加入源于细菌CpG基序的寡核苷酸CpG2006以及含细菌短磷酸二酯骨架的寡核苷酸A-ODN和T-ODN,处理3 d后再次检测该DC成熟度.结果 K562/A02细胞可在细胞因子rhGM-CSF和rhIL-4联合作用下分化成为DC,免疫表型检测发现CD83、HLA-DR和CD86分子的表达分别为(65.5±8.4)%、(32.0±4.3)%和(18.6±3.2)%,经CpG2006作用后表达升高到(88.9±3.6)%、(53.9±3.2)%和(39.9±7.3)%;经A-ODN作用后升高到(97.0±5.3)%、(63.9±7.3)%和(40.2±7.4)%;经T-ODN作用后升高到(93.3±4.6)%、(58.3±5.6)%和(36.2±6.8)%,与作用前相比差异均有统计学意义.经CpG2006、A-ODN和T-ODN作用后具有典型DC形态的细胞增多.上述3种寡核苷酸处理的DC均可刺激T细胞产生较强的增殖效应、诱导产生的CTL对靶细胞K562/A02的杀伤率明显增强,IL-6和IL-12分泌明显增高.结论 源于细菌CpG基序的寡核苷酸以及含细菌短磷酸二酯骨架的寡核苷酸对白血病源性DC有促成熟作用.     

转染A549细胞总RNA的树突状细胞疫苗抗肿瘤效应的体外研究

目的探讨人肺腺癌细胞株A549总RNA转染的人树突状细胞(DCs)在体外诱导特异性抗肿瘤免疫反应的能力。方法利用密度梯度离心法从血细胞分离机新鲜采集的外周富集血中分离出单个核细胞(PBMCs),贴壁获得单核细胞,加入重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和重组人白细胞介素-4(rhIL-4)进一步诱导为树突状细胞(DCs),同时利用提取的A549细胞总RNA转染DCs来制备疫苗,并与T细胞混合培养诱导扩增细胞毒性T淋巴细胞(CTLs);实验分为转染A549细胞总RNA的DC组、未转染DC组和转染空脂质体DC组,分别以流式细胞术(FCM)鉴定DCs表型、酶联免疫吸附法(ELISA)检测IL-12、IFN-γ分泌水平、3H-TdR掺入检测T细胞增殖能力及乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定杀伤肿瘤活性并比较各组差异。结果1)转染总RNA组DCs表面CD40、CD80、CD83、HLA-DR的表达较未转染组DCs和转染空脂质体组DCs均有升高,CD40在3组的表达率分别为(69.01±7.67)%、(19.28±3.51)%和(39.62±2.72)%;CD80在3组的表达率分别为:(74.39±6.46)%、(15.48±3.03)%和(25.70±2.92)%;CD83在3组的表达率分别为:(81.79±4.61)%、(13.29±2.34)%和(31.42±1.97)%;HLA-DR在3组的表达率分别为:(76.53±5.13)%、(49.23±4.05)%和(29.94±3.53)%,差异有统计学意义(P<0.05);2)转染总RNA组DCs的IL-12和IFN-γ分泌水平较未转染组及转染空脂质体组明显升高(P<0.05),3组IL-12分别为(543.24±68.33)、(77.11±27.65)和(167.78±31.84)pg/ml;3组IFN-γ分别为:(122.95±32.84)、(41.06±10.97)和(56.08±15.96)pg/ml;3)3H-TdR掺入试验所得的cpm,3组分别为(7437±720)、(3 807±476)和(4 543±719),阳性对照组为:16 739±91,差异有统计学意义(P<0.05);4)LDH释放法可见转染A549总RNA的DC组的特异性杀瘤活性(58.54±8.27)%,明显高于未转染组(36.03±4.03)%和转染空脂质体组(33.47±8.21)%,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论人肺腺癌细胞A549总RNA转染的DC疫苗体外诱导的特异性抗肿瘤免疫能力显著增强,有望为肺腺癌的治疗提供新的手段。     

致敏的脐血源树突状细胞诱导CTL特异杀伤白血病细胞的实验研究

探讨脐血单个核细胞（MNC）诱导的树突状细胞（DC）通过负载冻融的HL-60、K562细胞抗原体外诱导产生细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对HL-60、K562的杀伤作用。取脐血12份,分离MNC。在MNC中加入细胞因子GM-CSF（granulocyte monocyte colony-stimulating factor）、IL-3（interleukin 3）、SCF（stemcell factor）和EPO培养4周。使用CD83、CD1a、CD11C和CDw123单克隆抗体、流式细胞仪测定培养前后脐血DC抗原变化及扩增情况。DC通过负载HL-60、K-562白血病细胞抗原致敏T淋巴细胞产生CTL^3H-TdR掺入试验测定DC免疫刺激活性,MTT法观察CTL对HL-60、K562细胞的特异性杀伤活性。结果表明：新鲜脐血CD1a^＋、CD11c^＋、CD83^＋、CDw123^＋细胞数分别为0．27×10^5／ml、5．87×10^5／ml、1．94×10^5／ml、2．73×10^5／ml。加入上述细胞因子培养的脐血MNC分化为CD1a^＋、CD11C^＋、CD83^＋、CDw123^＋DC,经培养2—4周,DC数明显增多,分别达11．02×10^5／ml、28．24×10^5／ml、10．57×10^5／ml、18．7×10^5／ml,此后逐渐减少。细胞因子诱导脐血DC具有免疫刺激活性,且DC与CBMNC细胞比例为1：40时的刺激活性最佳。冻融法得到的HL-60、K562白血病细胞抗原致敏DC诱导的CTL对HL-60、K562细胞的杀伤率分别为（42．04±8．46）％和（31．25±11．07）％,与实验组比较有显著性差异（P〈0．01）。结论：加入细胞因子GM—CSF、IL-3、SCF和EPO培养2-4周的脐血MNC可分化为cD1a^＋、CD11C^＋、CD83^＋、CDw123^＋DC。冻融法得到的HL-60、K562白血病细胞抗原致敏DC,其诱导的CTL对HL-60、K562细胞具有特异的杀伤作用。脐血DC作为抗原呈递细胞在肿瘤免疫治疗上将起到重要作用。     

人肺腺癌细胞总RNA电穿孔法转染的树突状细胞疫苗的体外抗肿瘤效应研究

目的探讨人肺腺癌细胞A549总RNA电穿孔法转染的树突状细胞(dendritic cell,DC)的特征及其特异性抗肿瘤免疫反应的能力。方法用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和重组人白细胞介素4(rhIL-4)从血细胞分离机分离出的外周血采集物中诱导DCs产生,同时从人肺腺癌细胞A549中提取总RNA用以转染DCs,并用转染后的DCs与自体T细胞共同培养,诱导成为细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)。实验分未转染DCs组,转染PBS的DCs组,转染RNA的DCs组,以流式细胞术(FCM)鉴定DCs、T细胞表型、RT-PCR证明总RNA转染效率,MTT检测T细胞增殖能力及乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定杀伤肿瘤活性,酶联免疫吸附法(ELISA)检测IL-12、IFN-γ分泌水平并比较各组差异。结果 1)RT-PCR证明电穿孔法可成功使A549的总RNA转染入DCs并可使DCs表达肿瘤抗原。2)RNA转染组的DCs表面标志物CD40、CD80、CCR-7、CD83、HLA-DR都呈强阳性表达,表达率明显高于PBS转染组DCs和未转染组,差异有统计学意义(P<0.05);3)流式结果显示RNA转染的DCs刺激后的T细胞表面标志物CD8比例明显上升;4)RNA转染组IL-12、IFN-γ分泌水平明显高于PBS转染组和未转染组(P<0.05);5)RNA转染组DCs可以有效刺激T淋巴细胞增殖,并且诱导肿瘤特异性CTLs产生,对A549细胞产生特异性杀伤作用。而PBS转染组与未转染组则无明显作用(P<0.05)。结论利用电转染法可成功将A549的总RNA转入DCs内并使其表达肿瘤抗原,在体外能诱导肿瘤特异性免疫反应。     

p16基因克隆联合伊马替尼对慢性粒细胞白血病K562细胞作用的研究

目的：探讨p16基因克隆联合伊马替尼对慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞的增殖、周期及凋亡等的调控作用。方法：RT-PCR扩增p16基因，胶纯化回收后连接到T载体测序，序列正确后构建p16-pcDNA3．1载体．将p16-pcDNA3、1与空载体分别以脂质体转染入p16基因缺失的K562细胞。经筛选得到G418抗性的K562细胞株．Westernblot证实转染后有p16蛋白表达。MTT法检测细胞存活率，流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。结果：反复测序发现，从K562细胞中扩增的DNA片段属于非特异性扩增。证实K562细胞中p16基因缺失。转染p16基因后表达外源性p16蛋白的p16-pcDNA3、1-K562细胞株生长速度明显减慢；伊马替尼作用于已转染p16-pcDNA3、1的K562细胞．其细胞存活率与伊马替尼作用未转染K562细胞及单纯转染p16-pcDNA3．1的K562细胞相比均明显降低。转染p16基因后G0／G1期细胞增多，S期细胞明显减少，p16．pcDNA3．1-K562细胞与伊马替尼联合应用后凋亡细胞比例明显上升。结论：p16基因抑制K562细胞增殖并调节其周期，外源p16联合应用伊马替尼对抑制K562细胞增殖及促凋亡方面具有协同作用。