塞来昔布逆转MCF-7/Adr细胞多药耐药及其机制探讨

目的观察环氧合酶-2（COX-2）抑制剂塞来昔布对肿瘤多药耐药（MDR）的逆转作用,并探讨其初步作用机制。方法在乳腺癌耐药细胞株MCF-7/Adr中,应用MTT方法检测塞来昔布对多柔比星（阿霉素,DOX）的耐药逆转倍数;RT-PCR及Western blot方法检测基因及蛋白的变化;流式细胞术（FCM）检测细胞膜P-gp的表达、功能、细胞周期和凋亡。结果塞来昔布作用24小时后,MCF-7/Adr细胞对DOX的敏感性明显增加,浓度为10μmol/L及20μmol/L时,耐药逆转倍数分别为1.82和3.80,呈现剂量依赖性。COX-2、mdr1、c-Jun、YB-1、survivin等在基因和蛋白水平明显下调（P〈0.01）,NF-κB无明显差异（P〉0.05）;20μmol/L作用24小时,P-gp的功能受抑制;G0＋G1期细胞增多,S期细胞减少（P〈0.05）,凋亡率明显增高（P〈0.05）。结论选择性环氧合酶-2抑制剂塞来昔布可有效逆转MCF-7/Adr细胞多药耐药,在一定的浓度范围内呈现剂量依赖性,初步机制可能涉及干预转录因子的表达而下调mdr1,阻滞细胞周期及增加细胞凋亡。     

塞来昔布促进T细胞淋巴瘤对化疗药物的敏感性

目的:研究塞来昔布对T细胞淋巴瘤细胞化疗敏感性的影响,并探讨其作用机制.方法:MTF法检测不同浓度塞来昔布分别作用24、48和72 h,对T细胞淋巴瘤细胞株Jurkat和Hut78增殖活性的影响;MTT法检测化疗药物[顺铂(cis-platinum,DDP)、表柔比星(epirubicin,EPI)及长春新碱(vincristine,VCR)]联合塞来昔布对Jurkat和Hut78细胞增殖活性的影响;并计算IC50值;流式细胞术检测塞来昔布联合化疗药对Jurkat和Hut78细胞凋亡水平的影响;Real-time PCR及Westernblotting技术分别从mRNA及蛋白水平检测塞来昔布对Jurkat和Hut78细胞表达MDR1、MRP1、LRP及TopoⅡ的影响.结果:塞来昔布对T细胞淋巴瘤细胞株Jurkat和Hut78增殖活性具有一定抑制作用,且可明显增强化疗药物对Jurkat和Hut78细胞的杀伤作用;在塞来昔布作用下Jurkat和Hut78细胞的凋亡水平明显增加(P＜0.01);与塞来昔布共培养的Jurkat和Hut78细胞,TopoⅡmRNA和蛋白的表达水平均明显增加,而MDR1、MRP1、LRP mRNA及蛋白的表达水平均明显下降(P＜0.05).结论:塞来昔布可通过调控耐药相关基因的表达而增强T淋巴瘤细胞对化疗药物的敏感性,因此在T细胞淋巴瘤的临床治疗中具有良好应用前景.     

Ad-p53逆转乳腺癌细胞株多药耐药性及其对P-gp、TOPOⅡ和GST-π表达的影响

背景与目的肿瘤细胞对抗癌药物产生耐受性是化疗失败的主要原因,突变型p53基因与肿瘤多药耐药密切相关.本研究旨在探讨腺病毒介导的p53基因(Ad-p53)对人乳腺癌多柔比星(阿霉素)耐药细胞株MCF-7/Adr多药耐药的逆转作用及其对耐药相关蛋白P-gp、TOPOⅡ和GST-π表达的影响.方法以人乳腺癌MCF-7细胞及其多柔比星耐药株MCF-7/Adr为实验对象,cck-8法观察Ad-p53对多药耐药的逆转作用,Western blot检测P-gp、TOPOⅡ和GST-π蛋白表达的变化.结果50 MOI Ad-p53能使多柔比星对MCF-7/Adr细胞IC50由(4.54±0.91) μg/ml降到(0.26±0.11) μg/ml,逆转耐药倍数为18.1倍(P〈0.001);P-gp、GST-π蛋白表达量下降,TOPOⅡ未见明显变化.结论Ad-p53能够逆转MCF-7/Adr多药耐药,下调P-gp和GST-π表达.     

microRNA-21对乳腺癌MCF-7/ADR细胞株多柔比星耐药性影响的研究

目的:探讨microRNA-21(miR-21)基因表达改变对乳腺癌细胞多柔比星化疗耐药的影响.方法:人工合成miR-21模拟序列或干扰序列,以脂质体为载体,转染乳腺癌细胞MCF-7及其多柔比星耐药细胞株MCF-7/ADR;应用荧光定量RT-PCR检测miR-21的表达;应用MTT法检测细胞转染前后对多柔比星的耐药性;应用流式细胞仪检测细胞凋亡;应用蛋白质印迹法检测PTEN、BAX及Bcl-2蛋白的表达.结果:MTT检测结果示,MCF-7及其耐药株MCF-7/ADR细胞多柔比星半数抑制浓度(IC50)分别为(0.28±0.03)和(17.5±0.12) μmol/L.miR-21表达上调,MCF-7细胞对多柔比星的IC50明显增高为(3.65±0.12) μmol/L;miR-21表达下调,MCF-7/ADR细胞对多柔比星的IC50明显降低为(7.53±0.11) μmol/L.流式细胞分析显示,miR-21下调后MCF-7/ADR细胞凋亡率明显增加.同时,细胞内PTEN、BAX蛋白表达水平增加,Bcl-2表达降低.结论:miR-21在乳腺癌化疗耐药中具有重要作用,抑制miR-21的表达可以逆转乳腺癌多柔比星耐药细胞株对多柔比星的耐药性.     

上调EGR-1表达对乳腺癌多柔比星耐药细胞的化疗增敏作用

目的:探讨转录因子EGR-1对人乳腺癌多柔比星耐药细胞MCF-7/Adr的化疗增敏作用.方法:采用脂质体转染EGR-1质粒进入细胞,Annexin V-FITC/PI双标流式细胞术、MTT法、RT-PCR和蛋白质印迹分别检测MCF-7/Adr细胞早晚期凋亡、细胞增殖活性、EGR-1 mRNA和Caspase-3及P-gp蛋白表达.结果:稳定转染后,MCF-7/Adr细胞早期凋亡率显著增加达(41.43±2.34)%,与阴性对照组和空载体组比较差异有统计学意义,P＝0.011;细胞存活率明显下降,多柔比星100 μg/mL浓度作用下,转染组MCF-7/Adr细胞存活率仅为35%,P=0.037;MCF-7/Adr细胞中EGR-1 mRNA增加了(79.4±1.8)%,P=0.008;Caspase-3蛋白表达增加达(58.7±2.1)%,而P-gp蛋白质水平下调仅为(34.2±2.1)%,差异均有统计学意义,P<0.05.结论:上调EGR-1表达能有效逆转乳腺癌细胞多柔比星耐药,其可能与EGR-1上调耐药细胞中Caspase-3蛋白水平,诱导细胞发生凋亡相关.     

Snail沉默和过表达对ADM诱导MDR作用的研究

目的:研究乳腺癌细胞MCF-7中Snail表达与多柔比星(ADM)诱导的多药耐药(MDR)的关系,揭示上皮-间质转化(EMT)对乳腺癌细胞多药耐药的影响.方法:构建snail真核表达载体pCDNA-Snail和RNA干扰载体pSUPER-siRNA,将载体转染乳腺癌细胞MCF-7;用多柔比星对细胞进行诱导.利用细胞毒性实验和多柔比星外排实验,对细胞的耐药状况进行评价;通过流式细胞术测量耐药细胞中P-糖蛋白(P-gP)表达,Real-Time PCR测量耐药细胞中MDR1、Snail mRNA的表达.结果:细胞毒性实验和多柔比星外排实验结果显示,细胞转染pCDNA-Snail和pSUPER-siRNA后经多柔比星诱导相对耐药指数(RR)分别为111. 3和13.7,细胞内药物荧光强度分别为9.30±0.97和87.40±9.13;Real-Time PCR显示相对于未转染细胞,转染pCDNA-Snail后MDR1,Snail mRNA的表达明显升高,P＜0.01,P-gp表达也显著升高,P＜0.01;转染pSUPER-siRNA细胞则出现相反变化(P＜0.01).结论:Snail沉默和过表达分别使乳腺癌细胞的耐药能力降低或升高.     

微小RNA-451在乳腺癌细胞中的表达及其与耐药的关系

目的:研究人类微小RNA-451(Homo sapiens micro RNA-451,hsa-miR-451)在乳腺癌细胞中的表达及其与多柔比星(adriamycin,ADM)耐药的关系。方法:用实时荧光定量PCR一步法检测乳腺癌亲本细胞MCF-7和耐ADM细胞MCF-7/ADM中hsa-miR-451的表达;利用脂质体分别将成熟miR-451的模拟物(mimics)及阴性对照转染MCF-7/ADM细胞,然后采用实时荧光定量PCR法检测细胞中多药耐药基因1(multi-drug resistance gene 1,MDR1)mRNA的表达,蛋白质印迹法检测细胞中P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的表达,MTT法检测不同浓度ADM作用下的细胞增殖情况。结果:miR-451在MCF-7/ADM耐药细胞中低表达,与亲本细胞MCF-7相比明显降低(P<0.05)。MCF-7/ADM细胞转染miR-451mimics后,MDR1 mRNA和P-gp蛋白的相对表达量比阴性对照转染组均明显下降(P<0.05);而miR-451 mimics转染组细胞对ADM的敏感性增加,其半数抑制浓度(half inhibition concentration,IC50)值与阴性对照转染组细胞相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论:在乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADM中miR-451异常低表达,可能通过作用于MDR1/P-gp参与乳腺癌细胞耐药的发生和发展。     

碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体通过P-糖蛋白逆转乳腺癌MCF-7/ADM细胞多药耐药性的分子机制

目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体(monoclonal antibody to basic broblast growth factor,bFGF mAb)通过P-糖蛋白(permeability glycoprotein,P-gp)对人乳腺癌多柔比星(adriamycin,ADM)耐药细胞株MCF-7/ADM多药耐药(multidrug resistance,MDR)性的逆转机制。方法:CCK-8(cell counting kit-8)法检测bFGF mAb对MCF-7/ADM细胞增殖的影响及其对化疗药物耐药的逆转作用;bFGF mAb作用后,FCM检测MCF-7/ADM细胞的细胞周期、P-gp的表达及细胞内罗丹明(rhodamine,Rho)123的荧光强度,实时荧光定量PCR检测MCF-7/ADM细胞中MDR1和碱性成纤维细胞生长因子(basic broblast growth factor,bFGF)mRNA的表达。结果:1μg/mL bFGF mAb对MCF-7和MCF-7/ADM细胞的抑制率分别为(19.87±1.05)%和(27.34±2.79)%,差异有统计学意义(P<0.01)。bFGF mAb可有效逆转MCF-7/ADM细胞对ADM、吉西他滨(gemcitabine,GEM)和奥沙利泊(oxaliplatin,OXA)的耐药性,逆转指数分别为4.46、4.25和2.18。bFGF mAb作用MCF-7/ADM细胞后,细胞阻滞于G0/G1期,P-gp表达下调,细胞内Rho123的荧光强度增强,MDR1和bFGF mRNA的表达下调,与未作用组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:bFGF mAb能抑制MCF-7/ADM细胞增殖并逆转其MDR,该作用机制可能与bFGF mAb下调MDR1/P-gp表达、抑制P-gp功能以及增加细胞内化疗药物浓度有关。     

环氧合酶-2抑制剂对白血病细胞HL-60的化疗增敏作用及机制

 目的　观察环氧合酶-2（COX-2）抑制剂塞来昔布对白血病细胞株HL-60的化疗增敏作用,并对其机制进行初步探讨。方法　MTT法评估塞来昔布、多柔比星及二者联合对HL-60细胞的生长抑制效应;流式细胞术（FCM）检测细胞的凋亡;反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测Survivin基因的表达;Western blotting检测Survivin蛋白的表达。结果　多柔比星联合塞来昔布5和10 μmol／L对HL-60细胞的半数抑制浓度（IC50）分别为0.25及0.16 μg／ml,明显低于多柔比星单用的IC50（0.48 μg／ml）;多柔比星0.10 μg／ml联合10 μmol／L塞来昔布下调Survivin基因mRNA及蛋白的表达;联合塞来昔布5和10 μmol／L的凋亡率[分别为（13.07±1.66）%及（22.36±1.84）%]较多柔比星0.10 μg／ml单用[（5.72±1.25）%]明显增加（P＜0.01）。结论　COX-2抑制剂塞来昔布对白血病细胞株HL-60具有明显的化疗增敏作用,其初步机制涉及下调Survivin的表达,增加细胞凋亡。     

沉默HuR的表达增加人乳腺癌耐药MCF-7/Adr细胞对多柔比星的敏感性

目的：研究RNA干扰人抗原R（human antigen R,HuR）基因的表达对人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/Adr对多柔比星（doxorubicin）敏感性的影响。 方法： 构建靶向 HuR基因 的shRNA表达质粒（pGenesil-siHuR）,稳定转染至MCF-7/Adr细胞,real-time PCR检测细胞中 MDR1 mRNA的表达,Western blotting检测MCF-7/Adr细胞中由 MDR1 基因编码的P糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）的表达,MTT法检测pGenesil-siHuR 转染后MCF-7/Adr细胞在多柔比星作用后的存活率和IC50,流式细胞术检测MCF-7/Adr细胞的凋亡率。 结果： 与未转染的MCF-7/Adr细胞比较,pGenesil-siHuR质粒转染MCF-7/Adr细胞中 MDR1 mRNA的表达水平明显减低\[（0184±0.029） vs （1.203±0.026）,P<0.01\],P-gp表达水平明显降低。pGenesil-siHuR质粒转染MCF-7/Adr细胞后,MCF-7/Adr细胞对多柔比星的IC50从未转染的(148.2±2.3）nmol/L降至(42.9±0.4）nmol/L;经多柔比星处理后,pGenesil-siHuR质粒转染组MCF-7/Adr细胞的凋亡率明显上升\[（34.6±1.1）% vs （1.1±0.2）%,P<001\]。 结论： RNA干扰HuR的表达能抑制 MDR1基因 的表达,增加耐药乳腺癌MCF-7/Adr细胞对多柔比星的敏感性。