腺相关病毒介导绿色荧光蛋白基因对体外培养IPE细胞的转染和表达

目的 研究重组腺相关病毒（rAAV)载体介导的绿色荧光蛋白基因（GFP）对体外培养虹膜色素上皮（IPE）细胞的转染和表达，为rAAV携带目的基因治疗视网膜色素变性提供理论依据。方法 酶辅助的显微分离方法体外培养IPE细胞并鉴定。按转染倍数（MOI）为10^3,10^4,10^5,10^6转录已培养3d的传二代IPE细胞，转染后的第1、3、5、7、9d，在倒置荧光显微镜下观察IPE中GFP表达阳性的情况，记录100个IPE细胞中GFP阳性所占的百分比。当GFP表达稳定后，共聚焦显微镜照相，流式细胞仪检测rAAV-GFP对IPE的转染效率，结果 rAAV-GFP在细胞中的表达呈绿色，弥漫于整个胞浆。MOI=10^3时，转染后48h,GFP开始表达，MOI=10^4,10^5,10^6时，转染后24h时便可看到GFP表达阳性的细胞，细胞的起始表达强度不一，随MOI值的增高而增强，同时GFP的表达强度随着时间延长而逐渐增强，转染后第7-9d达到高峰并维持，此时检测rAAV-GFP对IPE的转染效率，MOI=10^3时是26.7%,MOI=10^4时是53.6%,MOI=10^5时是60.2%,MOI=10^6时是63.7%。结论 rAAV-GFP对体外培养的IPE细胞转染效率可达60%以上，将腺相关病毒载体介导的基因治疗和IPE移植结合起来治疗视网膜色素变性是可行的。     

重组增强型绿色荧光蛋白腺相关病毒转染兔晶状体上皮细胞的研究

目的研究2型重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus2,rAAV2)载体介导增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein,EGFP)对体外培养兔晶状体上皮细胞(N/N1003A)的转染和病毒载体对晶状体上皮细胞增生的影响,探讨rAAV2作为后囊膜混浊基因治疗载体的可行性。方法rAAV2-EGFP按感染复数(mul-tiplicity of infection,MOI)为104、105、2×105、106转染N/N1003A细胞,倒置荧光显微镜下观察晶状体上皮细胞中EGFP的表达,流式细胞仪检测rAAV2-EGFP对N/N1003A细胞的转染效率,MTT比色法测定rAAV2载体对N/N1003A增生的影响。结果EGFP在细胞中的表达呈绿色,弥漫于整个胞浆。rAAV2-EGFP的转染效率随着MOI的增加和时间的延长而增加,MOI=106时,转染后第7d达到71.12%.MTT法显示各转染组与未转染组A值无统计学差异。结论重组腺相关病毒载体可以介导EGFP基因高效稳定转染晶状体上皮细胞,并且对细胞增生无抑制作用,腺相关病毒作为后囊膜混浊基因治疗载体是可行的。     

腺伴随病毒介导绿色荧光蛋白基因对体外培养的鼠视网膜神经节细胞转染的实验研究

目的评价重组腺伴随病毒载体介导的绿色荧光蛋白基因(recombinant adeno-associated virus-mediated green fluorescence protein,rAAV-GFP)对体外培养的鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells ,RGCs)的转染效率和安全性。方法取出生24 h内的SD乳鼠的视网膜神经上皮层,行视网膜神经细胞的体外混合培养;培养2 d后,按转染倍数(multiple oninfection,MOI)为10、102、103、104、105对细胞进行转染;5 d后行流式细胞仪检测细胞表达绿荧光的比率,并应用PE-Thy1 .1抗体标记RGCs ,评价不同MOI的rAAV-GFP对RGCs的转染效率。应用MTT比色方法检测各组细胞的生长活性。结果MOI为10、102、103、104、105时,对混合培养的全体细胞的转染效率分别为6·4 %、15.6 %、20.2 %、45.1 %和65.8 %,其中对RGCs的转染效率分别为11.7 %、22.5 %、27.7 %、52.0 %和75.3 %;rAAV-GFP转染RGCs后,细胞生长状态正常;MTT比色结果显示,各转染细胞和未转染细胞的光吸收值无显著性差异(P>0 .05)。结论 rAAV作为体外培养的SD乳鼠RGCs转染的载体是安全可行的,且对细胞生长无明显影响。     

腺相关病毒介导的增强型绿色荧光蛋白基因转染豚鼠巩膜成纤维细胞的实验研究

目的比较四种不同血清型腺相关病毒(adeno-associatedvirus,AAV)介导增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因转染豚鼠巩膜成纤维细胞(guinea pig scleral fibroblast,GSF)的转染效率及安全性,筛选合适的基因转染载体。方法原代分离培养GSF并鉴定,利用AAV2、AAV5、AAV8、AAV9介导EGFP基因并按不同感染复数(multiplicity of infection,MOI)10、100、1000、10 000转染GSF,空白对照组加入空白培养基,转染后2 d、3 d、4 d、5 d荧光显微镜下观察GFP表达强度及细胞生长状态,流式细胞术检测细胞转染率及凋亡率,CCK-8法检测细胞活力。结果 AAV感染GSF后2 d各组均可见弱荧光,荧光强度随时间延长及MOI值增大而增强,而AAV9-EGFP组全程弱荧光,空白对照组全程无荧光。转染后5 d,MOI=10 000时各组荧光最强,基因转染率组间整体比较,差异具有统计学意义(P<0.05);组间两两比较,AAV8-EG...     

腺伴随病毒介导绿色荧光蛋白基因对体外培养的鼠视网膜神经节细转染的实验研究

目的 评价重组腺伴随病毒载体介导的绿色荧光蛋白基因(recombinant adenoassociated virus-mediated green fluorescence protein,rAAV-GFP)对体外培养的鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGCs)的转染效率和安全性.方法 取出生24 h内的SD乳鼠的视网膜神经上皮层,行视网膜神经细胞的体外混合培养;培养2 d后,按转染倍数(multiple on infection,MOI)为10、102、103、104、105对细胞进行转染;5 d后行流式细胞仪检测细胞表达绿荧光的比率,并应用PE-Thy1.1抗体标记RGCs,评价不同MOI的rAAV-GFP对RGCs的转染效率.应用MTT比色方法检测各组细胞的生长活性.结果 MOI为10、102、103、104、105时,对混合培养的全体细胞的转染效率分别为6.4%、15.6%、20.2%、45.1%和65.8%,其中对RGCs的转染效率分别为11.7%、22.5%、27.7%、52.0%和75.3%;rAAV-GFP转染RGCs后,细胞生长状态正常;MTT比色结果显示,各转染细胞和未转染细胞的光吸收值无显著性差异(P＞0.05).结论 rAAV作为体外培养的SD乳鼠RGCs转染的载体是安全可行的,且对细胞生长无明显影响.     

腺相关病毒-1介导增强型绿色荧光蛋白基因在大鼠角膜基质细胞体内外转染的研究

目的:探讨血清1型腺相关病毒(rAAV1)介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因体内、外转染大鼠角膜基质细胞后绿色荧光蛋白(GFP)的表达及转染率。方法:采用携带绿色荧光蛋白报告基因的血清1型腺相关病毒(rAAV1-EGFP)感染原代培养的SD大鼠角膜基质细胞,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察和检测EGFP的表达及阳性率。建立大鼠异体角膜移植模型,用含rAAV1-EGFP转染液的培养基在37℃孵育SD大鼠角膜植片同时浸泡缝线18h,再用此缝线间断缝合,将植片移植到大鼠角膜植床,术后通过荧光体视镜观察Wistar大鼠角膜出现EGFP荧光的起始时间及分布情况。结果:按rAAV1-EGFP不同转染倍数(MOI)转染角膜基质细胞。转染后3d,在倒置荧光显微镜下观察到角膜基质细胞的细胞质有GFP阳性表达。体视荧光显微镜观察到大鼠角膜中开始有GFP阳性表达;随MOI值的增高而增强,转染后7~9d达到高峰,此时检测rAAV1-EGFP对角膜基质细胞的转染效率,MOI=103时是16.3%,MOI=104时是30.3%,MOI=105时是43.6%,MOI=106时是47.5%。rAAV1-EGFP在大鼠角膜中的表达也明显增强。结论:rAAV1-EGFP可以在体内外稳定、有效转染大鼠角膜基质细胞,是角膜基质细胞理想的报告基因。     

腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因在晶状体上皮细胞中的表达

目的研究Ⅱ型重组腺相关病毒(recombinantadeno-associated virus 2,rAAV2)载体介导的增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein,EGFP)对体外培养兔晶状体上皮细胞的转染和表达情况,为rAAV携带目的基因防治后囊膜混浊提供理论依据。方法组织块培养法体外培养兔晶状体上皮细胞。rAAV2-EGFP按感染复数(multiplic-ity of infection,MOI)为103、104、105、4×105、106转染传2代细胞,转染后第1天、第3天、第5天、第7天、第9天、第11天在倒置荧光显微镜下观察晶状体上皮细胞中EGFP表达的阳性情况,记录200个细胞中EGFP阳性表达所占的百分比。当EGFP表达稳定后用激光共聚焦显微镜照相。用倒置显微镜观察rAAV转染对细胞生长和形态的影响。结果当MOI=103、104时,转染后第72小时晶状体上皮细胞中EGFP开始表达,当MOI=105、4×105、106时,转染后第24小时便可见EGFP阳性表达。随着MOI值的增大及时间的延长,EGFP表达效率逐渐增高,转染后第8~第9天达到高峰并维持,此时,MOI=103、104、105、4×105、106的转导效率分别为16%、41%、55%、86%、94%。对照组和转染组细胞的生长和形态特征无明显改变。结论腺相关病毒载体可以携带报告基因稳定转染晶状体上皮细胞,并且转染效率高,因而腺相关病毒携带目的基因防治后囊膜混浊是可行的。     

腺相关病毒介导胶质细胞源性神经营养因子转染牛眼虹膜色素上皮细胞

目的　探讨以腺相关病毒 (AAV)为载体对体外培养牛眼虹膜色素上皮细胞 (IPECs)进行胶质细胞源性神经营养因子 (GDNF)转染 ,获得高效表达GDNF转基因细胞的可行性。方法　采用狭隙杂交测定AAV GDNF的滴度 ,按感染复数 (MOI)为 50对传二代IPECs进行AAV GDNF转染 ,于含3 %胎牛血清DMEM培养基中连续不换液培养 4周 ,酶联免疫吸附测定 (ELISA)细胞培养上清液中GDNF的量。同样方法对传二代IPECs进行AAV介导的绿色荧光蛋白 (GFP)基因转染 ,于含 2 0 %胎牛血清DMEM培养基中进行常规细胞培养。荧光显微镜下每 2d计数 1次培养IPECs的GFP表达阳性率。结果　 (1)AAV GFP转染后 ,IPECs生长正常 ,于转染后 4d部分IPECs开始出现GFP表达。GFP的表达在荧光显微镜 490nm波长激发光下呈黄绿色 ,弥漫于整个胞质。转染 8～ 10d后 ,IPECs中GFP的表达至高峰。 (2 )根据ELISA检测结果、经过计算 ,AAV GDNF转染IPECs的培养上清液中GDNF的含量为 (17.14± 1.10 ) μg/L。 结论　AAV GDNF能有效地转染体外培养的IPECs和表达GDNF。 (中华眼科杂志 ,2 0 0 4,40 :45 48)     

8型重组腺相关病毒介导绿色荧光蛋白基因在角膜基质细胞中的表达及影响

目的:评价8型重组腺相关病毒(rAAV8)介导增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)转染角膜基质细胞后的表达及对细胞增殖的影响。方法:以不同MOI的rAAV8-EGFP转染大鼠角膜基质细胞,转染后以倒置荧光显微镜观察角膜基质细胞中GFP的表达,流式细胞仪分析角膜基质细胞中rAAV8-EGFP表达的阳性率。MTT法分别检测rAAV8和rAAV8-EGFP转染对角膜基质细胞增殖的影响。结果:倒置荧光显微镜观察rAAV8-EGFP转染角膜基质细胞后GFP的阳性表达7d达到高峰,此时流式细胞仪检测rAAV8-EGFP对角膜基质细胞的转染效率分别为31.5%(MOI=5×103),42.5%(MOI=5×104),54.8%(MOI=5×105);MTT检测结果显示rAAV8及rAAV8-EGFP转染对角膜基质细胞增殖均无明显影响。结论:rAAV8-EGFP能有效地转染角膜基质细胞,并且对细胞增殖无明显影响。     

重组增强型绿色荧火蛋白腺相关病素转染兔晶状体上皮细胞的研究

目的 研究2型重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus 2,Raav2)载体介导增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein,EGFP)对体外培养兔晶状体上皮细胞(N/N1003A)的转染和病毒载体对晶状体上皮细胞增生的影响,探讨Raav2作为后囊膜混浊基因治疗载体的可行性.方法　Raav2-EGFP按感染复数(multiplicity of infection,MOI)为104、105、2×105、106转染N/N1003A细胞,倒置荧光显微镜下观察晶状体上皮细胞中EGFP的表达,流式细胞仪检测Raav2-EGFP对N/N1003A细胞的转染效率,MTT比色法测定Raav2载体对N/N1003A增生的影响.结果 EGFP在细胞中的表达呈绿色,弥漫于整个胞浆.rAAV2-EGFP的转染效率随着MOI的增加和时间的延长而增加,MOI=106时,转染后第7 d达到71.12%.MTT法显示各转染组与未转染组A值无统计学差异.结论　重组腺相关病毒载体可以介导EGFP基因高效稳定转染晶状体上皮细胞,并且对细胞增生无抑制作用,腺相关病毒作为后囊膜混浊基因治疗载体是可行的.     

杆状病毒介导LacZ基因转染体外培养的人虹膜色素上皮细胞

目的：研究重组杆状病毒(baculovinus)载体介导β—半乳糖苷酶基因(LacZ)对体外培养虹膜色素上皮(IPE)细胞的转染和表达情况。方法：将质粒pCMV—β中的CMV—LacZ表达盒插入杆状病毒表达栽体pFast BacI的Eco RI／Hind Ⅲ位点，构建重组质粒pBac—β，并利用Bac—to—Bac表达系统在Sf9细胞中产生出重组杆状病毒BV—β。将MOI为200的BV—β感染经酶消化加显微法分离培养的IPE细胞，24h后进行X-gal染色。在显微镜下观察IPE中LacZ表达阳性的情况，记录阳性细胞所占的百分比。结果：限制性酶切分析及测序结果表明，我们已成功构建表达质粒pBac—β及重组杆状病毒BV—β。X-gal染色证实杆状病毒介导LacZ在细胞中的表达呈蓝色，弥漫于整个胞浆。感染后24h时表达阳性率达85％。结论：重组杆状病毒可有效介导报告基因在体外培养的IPE细胞中表达，为利用杆状病毒构建可供移植的基因工程化虹膜色素上皮细胞提供了实验依据。     

AAV载体介导的视网膜基因转移实验研究

目的以绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)作为标记基因,观察腺相关病毒(AAV)载体介导视网膜基因转移作用,为视网膜疾病的基因治疗打下基础.方法制备重组腺相关病毒rAAV-gfp;将纯化的rAAV-gfp病毒10μL(10×10     

层黏连蛋白体外对人虹膜色素上皮细胞的影响

目的:研究不同浓度的层黏连蛋白对体外培养的人虹膜色素上皮细胞(IPE)的作用.方法:采用酶辅助的显微分离法对成人眼进行IPE的原代和传代培养,观察其形态;以不同浓度的层黏连蛋白(0,1,5,10mg/L)处理第3代IPE细胞,MTT法作出生长曲线,免疫荧光法检测细胞角蛋白1(CK1)表达的变化.结果:原代培养的IPE细胞内色素丰富,而传代培养后色素显著减少;低浓度层黏连蛋白(5mg/L)明显促进IPE细胞增殖(0.187 vs 0.151,0.236 vs 0.176,0.245 vs 0.215,0.261vs 0.238,0.279 vs 0.254;P＜0.05);高浓度(10mg/L)明显抑制细胞增殖(0.121 vs 0.151,0.081 vs 0.176,0.094 vs0.215,0.065 vs 0.238,0.078 vs 0.254;P＜0.05);CK1染色均为阳性,高浓度层黏连蛋白(10mg/L)使IPE细胞聚集,CK1表达明显增强.结论:层黏连蛋白对IPE细胞具有双重作用,低浓度的层黏连蛋白适于IPE细胞的体外培养.     

CFDA-SE标记虹膜色素上皮细胞的自体移植

目的探讨兔眼自体虹膜色素上皮细胞（irispigment epithelialcells，IPECs）羧基荧光素乙酰乙酸（CFDA-SE）标记后，采用单通道内路移植方法将传代的IPECs移植于视网膜神经上皮层下的可行性。方法取兔眼自体虹膜细胞分离培养并传代，于第3代经CFDA-SE染色后移植到自体视网膜神经上皮层下。术后不同时间应用彩色眼底照相、激光扫描检眼镜、光学相干断层扫描进行活体观察。不同时间点对移植眼进行切片并常规染色及免疫组化，用光学显微镜对移植细胞进行观察和评价。实验数据采用两均数的等效检验，以0．5倍标准差作为等效界值观察移植前后ZO-1和Actin表达情况。结果移植术后观察显示移植区界限清晰；激光扫描检眼镜可观察到移植区内荧光；光学相干断层扫描和HE染色均显示移植区神经上皮层下有色素上皮细胞堆积，并随时间推移堆积逐渐变平。经免疫组化显示移植区ZO-1、Actin呈棕色点，有规律的间断分布在Bruch膜上，IPECs嵌插在原始的RPECs间，且形成完整的单层。结论CFDA-SE是一种快捷、稳定、安全的活体细胞染料，在IPECs移植中可作为理想的标记物应用；我们首次使用的单通道内路移植方法具有手术快捷简单、安全、并发症少等优点。[眼科新进展2007；27（3）：165-169】