趋化因子SDF-1体外趋化骨髓基质细胞迁移的实验研究

目的探讨趋化因子SDF-1在体外对骨髓基质细胞的迁移作用。方法采用全骨髓法培养成年Wistar大鼠骨髓基质细胞。取第五代骨髓基质细胞行免疫荧光鉴定；后通过细胞免疫荧光及RT-PCR的方法检测骨髓基质细胞表达趋化因子受体CXCR4的情况．利用Boyden小室法探讨趋化因子SDF-1对骨髓基质细胞的体外趋化作用及其特异性。结果第五代骨髓基质细胞都表达间充质干细胞标记物Vimentin、Laminin及Fibronectin；细胞免疫荧光及RT-PCR结果证实骨髓基质细胞表达趋化因子受体CXCR4；趋化因子SDF-1（5、50、500ng／mL）体外可趋化骨髓基质细胞迁移，抗SDF-1多克隆抗体可对抗其趋化迁移作用。结论SDF-1／CXCR4通路参与骨髓基质细胞体外迁移，为进一步研究骨髓基质细胞的迁移机制提供了理论依据。     

趋化因子Fractalkine体外趋化骨髓基质细胞迁移的实验研究

目的探讨趋化因子Fractalkine对骨髓基质细胞(BMSCs)的体外迁移作用。方法采用全骨髓法培养成年Wistar大鼠BMSCs,取第五代BMSCs行免疫荧光鉴定;后通过细胞免疫荧光及RT-PCR的方法检测BMSCs表达趋化因子受体CX3CR1的情况,利用Boyden小室法探讨趋化因子Fractalkine对BMSCs的体外趋化作用及其特异性。结果第五代BMSCs都表达间充质干细胞标记物Vimentin、Laminin及Fibronectin;CX3CR1细胞免疫荧光及RT-PCR结果证实BMSCs表达趋化因子受体CX3CR1,趋化因子Fractalkine(5、50、500ng/mL)体外可趋化BMSCs迁移,抗Fractalkine多克隆抗体可对抗其趋化迁移作用。结论Fractalkine/CX3CR1通路参与BMSCs体外迁移,为进一步研究BMSCs的迁移机制提供了理论依据。     

趋化因子CXCL-16体外趋化骨髓基质细胞迁移的实验研究

目的 探讨趋化因子CXCL-16对骨髓基质细胞的体外迁移作用.方法 采用全骨髓法培养成年Wistar-大鼠骨髓基质细胞,取第5代骨髓基质细胞行流式细胞仪鉴定;然后通过细胞免疫荧光及RT-PCR的方法检测骨髓基质细胞表达趋化因子受体CXCR6的情况,利用Transwell小室法探讨趋化因子CXCL-16对骨髓基质细胞的体外趋化作用及其特异性.结果 第5代骨髓基质细胞的间充质干细胞的标志CD29的表达呈阳性,而造血干细胞表面标志CD45呈阴性;细胞免疫荧光及RT-PCR结果从基因和蛋白两方面证实骨髓基质细胞表达趋化因子受体CXCR6,趋化凶子CXCL-16(5～500 ng/ml)体外可趋化骨髓基质细胞迁移,抗CXCR6多克隆抗体可对抗其趋化迁移作用.结论 CXCL-16/CXCR6通路参与骨髓基质细胞体外迁移,为进一步研究骨髓基质细胞的迁移机制提供了理论依据.     

VEGF/PDGF受体通路参与骨髓间充质干细胞诱导分化及向脑胶质瘤的定向迁移

背景：最近的研究显示VEGF能够诱导骨髓间质干细胞分化为血管内皮细胞样细胞,促进骨髓间质干细胞向脑胶质瘤选择性迁移,但骨髓间质干细胞并无VEGF受体的表达,目前关于VEGF对骨髓间质干细胞的诱导分化和促迁移作用机制还不清楚。 目的：探讨PDGF受体在VEGF诱导骨髓间质干细胞分化和促迁移过程中的作用。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2008-06/2009-03在安徽医科大学附属省立医院神经再生与修复实验室完成。 材料：骨髓取自骨科病人;U87胶质瘤细胞购自上海生命科学院;Transwell小室购自美国Coring公司;DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司;生长因子购自美国Peprotech公司。 方法：利用50ng/ml VEGF对骨髓间质干细胞进行诱导分化培养,实验组骨髓间质干细胞在接受诱导分化培养前用受体中和抗体封闭相关受体的生物学活性,以不进行预处理作为对照组,以研究相关受体信号通路在骨髓间质干细胞分化过程中的作用;细胞迁移实验采用Transwell迁移模型进行,骨髓间质干细胞加在Transwell小室的上室,生长因子或胶质瘤细胞培养上清加在下室,实验组利用受体抗体进行预处理骨髓间质干细胞,对照组不予预处理,以研究相关受体信号通路在骨髓间质干细胞定向迁移过程中的作用;VEGF预培养骨髓间质干细胞,比较预培养组和对照组向胶质瘤细胞培养上清的迁移能力。 主要结果：封闭骨髓间质干细胞表面PDGF受体的生物学作用后,VEGF不能诱导骨髓间质干细胞表达细胞表面标志物的CD-31、vWF;用VEGF受体封闭剂进行封闭时,VEGF任能诱导骨髓间质干细胞表达CD-31、vWF;封闭PDGF受体后,VEGF吸引骨髓间质干细胞穿过Transwell小室聚碳酸脂膜发生迁移的细胞数减少,骨髓间质干细胞向脑胶质瘤迁移的细胞数也减少,用VEGF受体封闭剂进行封闭时,穿过的细胞数没有改变;用VEGF预培养骨髓间质干细胞,能够增加向胶质瘤迁移的细胞数。 结论：VEGF通过与骨髓间质干细胞表面PDGF受体结合,吸引骨髓间质干细胞定向迁移,诱导其分化;VEGF/PDGF受体通路参与骨髓间质干细胞向脑胶质瘤的定向迁移;用生长因子VEGF预处理骨髓间质干细胞可以增加骨髓间质干细胞向胶质瘤的迁移效率。 国内外研究现状：国内外研究一致认为骨髓间质干细胞无血管内皮细胞生长因子（VEGF）受体的表达,对VEGF诱导骨髓间质干细胞分化和促迁移作用机制的研究还很少,通过Pubmed搜索仅一篇发表于2007年的文献的研究相对深入,认为VEGF的促迁移作用可能与PDGF受体有关,本研究对此做了更深入的研究,结果见前文。     

IL-32在神经胶质瘤中的表达及调节机制研究

目的 探讨白细胞介素(IL)-32在神经胶质瘤中的表达及调节机制. 方法 RT-PCR、Western blotting检测体外培养3d的神经胶质瘤细胞株CHG-5、U251 IL-32 mRNA和蛋白的表达;应用10 ng/mL IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、肿瘤坏死因子(TNF)-α、TNF-β、干扰素(IFN)-γ作用U251细胞24 h后RT-PCR检测细胞IL-32 mRNA表达的变化;RT-PCR检测不同浓度IL-1β、TNF-α、IFN-γ作用U251细胞不同时间后IL-32 mRNA表达的变化. 结果 U251细胞IL-32 mRNA表达水平高于CHG-5细胞,IL-32蛋白表达水平(0.95±0.42)高于CHG-5细胞(0.28±0.13),差异均有统计学意义(P＜0.05); IL-1β、TNF-α、IFN-γ作用U251细胞24 h后IL-32 mRNA表达量增加,差异有统计学意义(P＜0.05),且IL-32 mRNA的表达量对IL-1β、TNF-α、IFN-γ刺激的浓度和时间有依赖性. 结论 IL-32在神经胶质瘤中高表达,IL-1β、TNF-α、IFN-γ对IL-32 mRNA的表达具有调节作用,且存在时间与剂量依赖性.     

膜结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体修饰的人骨髓基质干细胞对脑胶质瘤细胞的体外靶向抗肿瘤作用

目的：探索经膜结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）修饰的人骨髓基质干细胞（hMSCs）对脑胶质瘤的靶向抗肿瘤作用。方法：通过体外Transwell系统研究hMSCs向胶质瘤的迁徙能力。采用经全长人TRAIL（hTRAIL）重组的腺相关病毒（rAAV）载体（rAAV hTRAIL）对骨髓基质干细胞（MSCs）进行修饰。将hTRAIL修饰的MSCs与人胶质瘤细胞（U87MG）在体外共同培养,分析其对脑胶质瘤的靶向抗肿瘤作用。结果：hMSCs向胶质瘤细胞的迁徙具有高度特异性。经TRAIL修饰的hMSCs不仅在MSCs表面表达全长TRAIL,且能在培养基中分泌可溶性TRAIL。经rAAV-hTRAIL转染后,hMSCs细胞凋亡作用无增加。将TRAIL修饰的hMSCs与U87MG细胞共培养,与采用可溶性TRAIL治疗后相比较,可明显提高U87MG细胞的凋亡率。结论：在体外实验中,hMSCs向胶质瘤细胞的迁徒具有高度特异性,且能诱导胶质瘤细胞凋亡,并提高对sTRAIL不敏感胶质瘤细胞的凋亡率。由此推测膜结合型TRAIL修饰的MSCs在肿瘤微环境中对脑胶质瘤具备靶向抗肿瘤效应。MSCs可能成为脑胶质瘤靶向治疗的有效载体。     

基质细胞衍生因子-1诱导神经干细胞靶向性迁移的实验研究

目的 观察基质细胞衍生因子-1(SDF-1)对神经干细胞(NSCs)迁移的影响.方法 由胚胎大鼠脑组织获取NSCs并进行传代培养和分化鉴定,使用流式细胞术检测NSCs纯度及SDF-1特异性受体CXCR4的表达情况,之后利用Blind-Well小室体外迁移体系观察不同浓度的SDF-1(0 ng/L、1 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、500 ng/mL和1000 ng/mL)对NSCs迁移数量的影响,并使用μ-载片观察SDF-1对NSCs迁移距离的影响.结果成功分离培养得到了能够在体外不断分裂增殖、具有多向分化潜能的NSCs,连续传3代后绝大部分细胞nestin表达阳性,nestin和CXCR4的共表达率达到80%左右.细胞趋化实验结果表明,SDF-1对NSCs有较强的趋化作用,随着SDF-1浓度的升高,发生迁移的细胞数量也随之增加,并于SDF-1浓度为500ng/mL时达到最高峰[(256.79±38.27)个细胞/每高倍视野].在μ-载片细胞生长通道两侧的SDF-1浓度梯度(500ng/mL→0ng/mL)作用下,由细胞克隆球迁出的细胞呈不对称分布,通常有更多的迁出细胞分布于趋化因子浓度较高的一侧,且该侧细胞的最大迁移距离也比对侧远.结论 SDF-1与其特异性受体CXCR4相巨作用能够诱导NSCs发生靶向性迁移.     

趋化因子CXCL-8趋化骨髓间充质干细胞迁移的体外效应

背景：早期研究表明趋化因子参与骨髓间充质干细胞的体外趋化,确定骨髓间充质干细胞体内迁移的分子机制,对其介导的细胞治疗中枢神经系统损伤和疾病有重要作用。 目的：观察体外条件下趋化因子CXCL-8对大鼠骨髓间充质干细胞迁移的趋化作用。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-10/2008-06在青岛大学医学院附属医院脑血管病研究所完成。 材料：纯种SPF级成年Wistar大鼠8只,由青岛市实验动物和动物实验中心提供。鼠重组趋化因子CXCL-8为Santa cruz公司产品。 方法：采用全骨髓法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,胰蛋白酶消化传代。取500 μL趋化因子CXCL-8,加入含体积分数为0.5%胎牛血清的DMEM条件培养基,分别将质量浓度调整为5,50,250,500 μg/L加到趋化板下层,对照组单纯添加DMEM条件培养基,以8 μm孔径的聚碳酸酯膜覆盖。调整骨髓间充质干细胞浓度至1.5×109 L-1,取100 μL细胞悬液加到趋化板上层。为验证趋化因子CXCL-8作用的特异性,将经抗CXCR6多克隆抗体孵育12 h后的骨髓间充质干细胞加到趋化板上层,趋化因子CXCL-8加到趋化板下层。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞趋化因子受体CXCR1的表达,趋化因子CXCL-8对骨髓间充质干细胞体外趋化迁移作用及其特异性检测。 结果：骨髓间充质干细胞趋化因子受体CXCR1呈阳性表达,位于细胞膜和细胞浆中,RT-PCR琼脂糖凝胶电泳后出现215 bp特异性扩增条带。与对照组比较,加入5~500 μg/L趋化因子CXCL-8后,骨髓间充质干细胞迁移数均明显增加（P < 0.05）。加入抗CXCR1多克隆抗体后,骨髓间充质干细胞迁移数较250 μg/L趋化因子CXCL-8组明显减少（P < 0.05）。 结论：体外条件下趋化因子CXCL-8在5~500 μg/L质量浓度范围可趋化骨髓间充质干细胞迁移,封闭趋化因子受体CXCR1后其趋化迁移作用明显减弱。     

人骨髓间充质干细胞分化神经元样细胞表达单胺类受体mRNA

目的 检测体外人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)经DMSO/BHA联合诱导后所分化的神经元样细胞表达单胺类受体基因的状况,以探讨体外诱导hMSCs向神经元样细胞分化的条件和机制.方法 采用密度梯度离心法和贴壁培养的方法分离纯化hMSCs,DMSO/BHA联合诱导分化,免疫细胞化学法检测神经元特异性烯醇化酶(neurone specific enolase,NSE)的表达,RT-PCR检测5-HT2受体和多巴胺2受体(DRD2)mRNA.结果 分离纯化的hMSCs加入诱导剂后,hMSCs形成多极神经元的形态;免疫组化结果显示NSE蛋白表达阳性;RT-PCR结果显示诱导后细胞表达5-HT2受体的mRNA,而不表达DRD2的mRNA.结论 DMSO/BHA可诱导hMSCs表达5-HT2受体基因,但不表达DRD2受体基因.     

基质细胞衍生因子1趋化神经干细胞迁移的体外效应

背景：神经干细胞的迁移在神经系统的发育和损伤修复中起着至关重要的作用,近来研究表明趋化因子参与神经干细胞的迁移,但关于其迁移机制目前尚不清楚。 目的：观察体外条件下基质细胞衍生因子1对胎鼠海马神经干细胞的趋化迁移作用。 方法：通过无血清法体外分离、培养及鉴定胎鼠海马神经干细胞;细胞免疫荧光及RT-PCR检测其CXCR4是否表达;观察不同浓度基质细胞衍生因子1对神经干细胞的趋化迁移作用,中和CXCR4受体以验证基质细胞衍生因子1趋化迁移作用的特异性。 结果与结论：胎鼠海马来源神经干细胞表达趋化因子受体CXCR4,呈阳性。RT-PCR琼脂糖凝胶电泳后出现643 bp特异性扩增条带。体外条件下基质细胞衍生因子1趋化迁移随浓度而增强,500 μg/L为最佳趋化浓度。加入抗CXCR4多克隆抗体中和后,神经干细胞迁移较基质细胞衍生因子1组明显减少,与对照组比较,差异无显著性意义(P > 0.05),提示抗CXCR4多克隆抗体可阻断趋化迁移作用。     

下调RNA甲基化酶NSUN2表达对脑胶质瘤U87细胞增殖、侵袭、迁移的影响

目的 探讨下调NOP2/Sun RNA甲基转移酶家族成员2(NSUN2)表达对脑胶质瘤细胞增殖、侵袭、迁移的影响。方法体外培养正常胶质细胞HEB、胶质瘤细胞系（A172、U251、U87）,免疫印迹法检测NSUN2蛋白表达水平;用shNSUN2慢病毒（sh-NSUN2组）及shRNA scramble慢病毒（sh-CON组）感染U87细胞下调NSUN2表达,用CCK-8法检测细胞增殖活力,Transwell实验检测细胞侵袭和迁移。结果 与正常胶质细胞HEB相比,胶质瘤细胞系A172、U251、U87的NSUN2蛋白表达量均明显增高（P<0.05）。与sh-CON组比较,sh-NSUN2组NSUN2蛋白表达水平、细胞增殖活力、侵袭能力和迁移能力均明显降低（P<0.05）。结论 胶质瘤NSUN2呈高表达,下调其表达明显抑制胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移。     

Aberrant hippocampal spine morphology and impaired memory formation in neuronal platelet-derived growth factor beta-receptor lacking mice

The physiological role of platelet-derived growth factor (PDGF) in the central nervous system (CNS) synaptic function remains uncharacterized. Here we identify physiological roles of PDGF receptor-β (PDGFR-β) in the CNS by conditional knockout of the gene encoding it. In the hippocampus, PDGFR-β colocalized immunohistochemically with both presynaptic synaptophysin and postsynaptic density-95 (PSD-95). In the hippocampal CA1 region, expression levels of postsynaptic proteins, including spinophilin, drebrin, and PSD-95, were significantly decreased in PDGFR-β knockout mice, although presynaptic synaptophysin levels remained comparable to controls. Interestingly, in hippocampal CA1 pyramidal neurons, dendritic spine density in PDGFR-β knockout mice was significantly decreased compared with that seen in wild-type mice, although spine length and number of dendritic branches remained unchanged. Consistent with these findings, impairment in hippocampal long-term potentiation (LTP) and in hippocampus-dependent memory formation were seen in PDGFR-β knockout mice. These results suggest PDGFR-β plays critical roles in spine morphology and memory formation in mouse brain.     

Type 1 astrocytes and oligodendrocyte-type 2 astrocyte glial progenitors migrate toward distinct molecules

During central nervous system (CNS) development, glial precursors proliferate in subventricular zones and then migrate throughout the CNS to adopt their final destinations and differentiate into various types of mature glial cells. Although several growth factors promoting the proliferation and/or differentiation of glial precursors have been identified, very little is known about the nature of signals that guide glial cell migration in the CNS. Therefore, we have investigated whether polypeptide growth factors and/or extracellular matrix molecules may mediate the migration of two major glial cell types, type 1 astrocytes and oligodendrocyte-type 2 astrocyte (O-2A) progenitor cells. We show that, in a microchemotaxis chamber assay, type 1 astrocytes move toward laminin and complement-derived C5a. Astrocyte migration toward laminin is inhibited by a laminin-specific pentapeptide, YIGSR-NH2. In contrast, O-2A progenitors migrate toward platelet-derived growth factor (PDGF), which also functions as a mitogen for these cells. Using a new method to simultaneously assay migration and DNA synthesis, we also demonstrate that O-2A progenitors can migrate toward PDGF even when DNA replication is inhibited with an antimitotic agent. Thus, migration of different types of glial cells can be induced in vitro by specific signaling molecules, which are present in the developing brain and may stimulate migration of glial cells prior to CNS myelination.     

Mesenchymal stem cells and glioma cells form a structural as well as a functional syncytium in vitro

The interaction of human mesenchymal stem cells (hMSCs) and tumor cells has been investigated in various contexts. HMSCs are considered as cellular treatment vectors based on their capacity to migrate towards a malignant lesion. However, concerns about unpredictable behavior of transplanted hMSCs are accumulating. In malignant gliomas, the recruitment mechanism is driven by glioma-secreted factors which lead to accumulation of both, tissue specific stem cells as well as bone marrow derived hMSCs within the tumor. The aim of the present work was to study specific cellular interactions between hMSCs and glioma cells in vitro. We show, that glioma cells as well as hMSCs differentially express connexins, and that they interact via gap-junctional coupling. Besides this so-called functional syncytium formation, we also provide evidence of cell fusion events (structural syncytium). These complex cellular interactions led to an enhanced migration and altered proliferation of both, tumor and mesenchymal stem cell types in vitro. The presented work shows that glioma cells display signs of functional as well as structural syncytium formation with hMSCs in vitro. The described cellular phenomena provide new insight into the complexity of interaction patterns between tumor cells and host cells. Based on these findings, further studies are warranted to define the impact of a functional or structural syncytium formation on malignant tumors and cell based therapies in vivo.     

钙蛋白酶-1在胶质瘤组织中的表达及其对U87细胞侵袭和迁移的影响

目的 探讨钙蛋白酶-1在人脑胶质瘤组织中的表达及其对U87胶质瘤细胞侵袭和迁移的影响。方法 收集2015年1月至2018年3月手术切除的胶质瘤组织和瘤旁正常脑组织各57例。体外培养U87细胞,将阴性对照小干扰RNA（NC组）和钙蛋白酶-1小干扰RNA（钙蛋白酶-1组）转染至人胶质瘤细胞株U87,以未转染的U87细胞为对照组。采用RT-PCR和免疫印迹法检测mRNA和蛋白表达水平,Transwell实验检测U87细胞侵袭能力,划痕实验评估U87细胞迁移能力。结果 胶质瘤组织钙蛋白酶-1 mRNA和蛋白表达水平均显著高于瘤旁正常脑组织（P<0.05）。钙蛋白酶-1组U87细胞钙蛋白酶-1 mRNA和蛋白表达水平、细胞侵袭数目、细胞迁移率以及转化生长因子-β、基质金属蛋白酶（MMP）-2和MMP-9 mRNA表达水平均明显低于对照组和NC组（P<0.05）,而对照组和NC组均无统计学差异（P>0.05）。结论 钙蛋白酶-1在人脑胶质瘤中表达升高,而抑制钙蛋白酶-1表达可能通过影响上皮间质转化,抑制胶质瘤细胞侵袭和迁移。     

人骨髓基质细胞体外分化为神经细胞潜力的研究

目的探讨人骨髓基质细胞体外分化为神经细胞所需要的条件及其分化能力。方法取胸部创伤患者的肋骨进行骨髓基质细胞分离培养,接种于含10%胎牛血清的DMEM中,于相差显微镜下观察细胞生长情况。细胞培养第1、5和10d,应用免疫荧光染色法检测骨髓基质细胞各种表面标志物的表达情况;于细胞培养第1、4、7、10及13d,应用ELISA法检测培养上清液中的脑源性神经营养因子和神经生长因子的分泌水平。结果骨髓基质细胞表面标志物巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白、S-100以及微管相关蛋白-2的表达,随培养时间的不同而有所差异,其中以S-100在体积较小的细胞中表达较强。于培养第10d可在培养上清液中检测到脑源性神经营养因子;于培养第7、10及13d检测到神经生长因子。结论人骨髓基质细胞在用含血清培养基的条件下能够表达神经前体细胞和神经细胞的相关表面标志物,并且能够分泌一定水平的神经营养因子,具有分化成神经细胞的潜力。     

Vascular endothelial growth factor A contributes to glioma-induced migration of human marrow stromal cells (hMSC)

OBJECTIVE: It has been demonstrated that murine neural stem cells (mNSCs) and human mesenchymal stroma cells migrate toward experimental gliomas, making stem cells a candidate for cellular carrier systems of anti-glioma therapy. However, few data are available on the factors involved in regulating stem cell migration. The aim of our study was to characterize the migratory and invasive behavior of adult human marrow stromal cells (hMSC) that interact with glioma cells, especially focusing on vascular endothelial growth factor A (VEGF-A)-mediated effects. METHODS: Human MSC were isolated from bone marrow biopsies carried out for hematological indications. The chemokinetic activity of hMSC in response to glioma-conditioned medium as well as VEGF-A was analyzed using a modified Boyden chamber assay. Invasion of hMSC and glioma spheroids was investigated using confrontational cultures. To provide analogous data from a well-described system, invasion of murine C17.2 neural stem cells was assessed. VEGF-A secretion by gliomas and the expression of VEGF-receptor 2 in hMSC were evaluated. RESULTS: Human MSC showed an extensive invasion into glioma spheroids. Glioma-conditioned medium significantly increased hMSC migration and also invasion, driven by chemotaxis. VEGF-A also showed significant pro-migratory and pro-invasive effects on hMSC, but in a reduced fashion compared to glioma-conditioned medium. CONCLUSIONS: Human MSC show intensive migratory and invasive behavior in the presence of glioma cells and glioma-conditioned medium. Among others, VEGF-A seems to be one important factor in enhancing and directing stem cell motility.