幽门螺杆菌cagA基因片段原核表达载体的构建及其cagA基因和CagA蛋白及感染者血清抗体的检测

目的:构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)cagA基因片段的原核表达系统,建立ELISA检测CagA及其抗体,了解表达CagA的Hp菌株(CagA Hp)感染与所致疾病种类的关系.方法:从快速尿素酶试验阳性的156例患者胃黏膜活检标本中分离Hp.采用PCR检测109株Hp cagA基因,并从临床菌株Y06中扩增2 148 bp的cagA基因片段(cagA1).构建cagA1原核表达系统,用SDS-PAGE检查目的重组蛋白(rCagA1)的表达情况,用Western blot和免疫双扩散试验鉴定rCagA1的免疫反应性和抗原性.建立ELISA,检测109株Hp CagA表达和相应患者血清中CagA抗体.分析CagA Hp感染与胃炎和消化性溃疡的关系.结果:80.8%胃黏膜活检标本中分离出Hp(126/156),97.2%的Hp菌株(106/109)cagA基因阳性.与文献报道比较,所克隆的cagA1片段核苷酸和氨基酸序列同源性分别为94.83%和93.30%.所构建的原核表达系统表达的rCagA1量约为细菌总蛋白的30.0%.rCagA1能与Hp全菌抗体发生结合反应,免疫家兔产生双扩散效价为1∶4的抗体.92.6%菌株(101/109)可表达CagA,88.1% 患者(96/109)血清CagA抗体阳性.消化性溃疡标本中CagA Hp菌株分离阳性率(97.9%)高于胃炎标本(88.5%),但无统计学差异(χ2=3.48,P>0.05).结论:本实验构建的原核表达系统表达的rCagA1有良好的免疫反应性和抗原性,建立的ELISA可用于Hp CagA及其抗体的检测,分离的Hp菌株cagA基因携带率和CagA表达率均很高.消化性溃疡和胃炎与其感染的Hp是否表达CagA无明显关系.     

幽门螺旋杆菌细胞毒素相关蛋白A真核表达载体的构建与表达

目的构建幽门螺旋杆菌（Helieobaeterpylori,Hp）细胞毒素相关蛋白A（cytotoxin—associatedprotein,CagA）基因表达载体并表达其编码蛋白。方法从胃黏膜活检标本中分离Hp,提取核酸,采用RT—PCR技术扩增CagA基因,将其克隆至pEGFP真核表达载体中,构建HpCagA基因真核表达载体并转染293-T细胞表达其编码蛋白。结果通过PCR、双酶切、测序鉴定证实CagA基因的真核表达载体构建成功,免疫印迹法证实CagA蛋白的表达。结论成功构建了HpCagA基因真核表达载体并表达其编码蛋白,为后期功能研究提供了材料和基础。     

幽门螺杆菌cagA基因全长克隆及序列分析

目的探索扩增cagA基因全长的PCR方法,克隆中国2株胃癌幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)分离株和1株十二指肠溃疡分离株及国际标准株SS1的cagA基因,初步探讨cagA序列和磷酸化位点变异及其临床意义.方法针对已知cagA基因两侧及cag致病岛右侧反转重复序列设计PCR引物,扩增cagA基因并克隆测序,分析已知cagA序列同源性及其酪氨酸磷酸化位点.结果3株中国Hp分离株cagA氨基酸序列的同源性约为94%(93.9%、94%、94.5%),并都有pY117/118/122和EPIYA-A、B、D 4个酪氨酸磷酸化位点.SS1株cagA与西方菌株同源性大于85%,而与中国菌株的同源性小于80%,具有pY117/118/122和EPIYA-A、B、C 4个酪氨酸磷酸化位点.结论建立的PCR方法可扩增cagA基因全长.CagA序列变异和磷酸化位点具有地区聚类特征,但与Hp感染临床结局无特殊关联.     

胃十二指肠疾病患者感染幽门螺杆菌的cagA基因和血清CagA抗体状况

目的 :探讨幽门螺杆菌cagA基因和血清CagA抗体与胃十二指肠疾病的关系。方法 :用聚合酶链反应方法测定 62株由慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌患者感染HpcagA基因 ;用酶免疫方法测定同一患者血清CagA抗体。结果 :HpcagA基因阳性率为 5 6.45 %。慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌患者感染HpcagA基因阳性率分别为 5 5 .5 6%、5 4.17%和 63 .64 % ,三种疾病患者之间感染Hp的cagA基因阳性率无显著差异 (P >0 .0 5 ) ;慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌患者血清CagA抗体阳性率分别为 70 .3 7%、79.17%和 40 .0 0 % ,血清CagA抗体总阳性率为 68.85 %。慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌患者之间血清CagA抗体阳性率无显著差异 (P >0 .0 5 )。结论 :HpcagA基因和血清CagA抗体与Hp感染个体发生的不同类型胃十二指肠疾病之间无关联     

苯妥英钠代谢酶CYP2C9、CYP2C19基因多态性的分析

目的研究药物代谢酶基因多态性对苯妥英钠代谢的影响,并建立分析苯妥英钠代谢酶中CYP2C9、CYP2C19基因多态性的方法。方法从人全血中抽取DNA,设计引物扩增CYP2C9及CYP2C19,并运用限制性片段长度多态性（RFLP）技术的方法进行CYP2C9及CYP2C19的基因分型。结果成功设计了引物用来扩增CYP2C9及CYP2C19的基因片段,并测序验证。结论建立了简单可靠的CYP2C9及CYP2C19的RFLP基因分型方法。     

具有野生起点的丙型肝炎病毒RNA依赖的RNA聚合酶表达质粒的构建

目的 构建具有野生起点的丙型肝炎病毒ＲＮＡ依赖的ＲＮＡ聚合酶表达载体。方法 根据疏水性分析选定待表达的丙型肝炎病毒非结构基因５ｂ区大部分基因。以聚合酶链反应扩增泛素基因,逆转录－聚合酶链反应扩增丙型肝炎病毒ＲＮＡ依赖的ＲＮＡ聚合酶基因。限制性酶切长度多态性分析重组克隆,并以ＤＮＡ序列分析方法最终确认。     

贵州省幽门螺杆菌CagA基因表达与甲硝唑耐药性

目的:探讨贵州地区上消化道疾病患者幽门螺杆菌(H pylori)细胞毒素相关蛋白(CagA)基因的表达及其与甲硝唑(MTZ)耐药的相关性。方法:从上消化道疾病患者胃黏膜分离50株H pylori,经聚合酶链反应(PCR)检测CagA基因,E-test法检测MTZ耐药情况,测序并应用BLAST分析MTZ敏感株(MTZS)与耐药株(MTZR)CagA基因的分子差异。结果:50株H pylori中有92%的菌株表达CagA,其阳性表达率在消化性溃疡患者与慢性胃炎患者无差异;50株H pylori对MTZ总耐药率为54%,CagA阳性及阴性菌株耐药率分别为54.3%及50.0%(P>0.05);基因测序结果显示MTZS及MTZR两组间CagA基因突变无统计学差异。结论:贵州地区CagA阳性菌株与上消化道疾病密切相关,但与疾病的严重程度无明显关系,CagA基因表达及基因变异与MTZ耐药性之间无明显关系。     

半夏凝集素基因的克隆与氨基酸序列初步分析

目的 克隆半夏凝集素基因并对其氨基酸序列生物信息与已报道相关基因进行对比分析,为抗虫基因利用和转基因育种研究奠定基础。方法 根据已报道的植物凝集素基因序列设计特异引物,以半夏叶片DNA为模板进行PCR扩增,获得特异性片段,将其连接到测序载体上,进行序列测定,用分析软件分析序列信息。结果 克隆1 069 bp的半夏凝集素基因(pta),开放阅读框全长804 bp,编码268个氨基酸残基;预测相对分子质量和等电点分别为2.91×10⁴和7.77,功能区完整,具有1条信号肽和3个甘露糖结合区;已在GenBank中登记（登录号AY725425）。结论 克隆的半夏凝集素基因序列信息完整,具有典型的甘露糖结合位点,可以作为抗虫基因用于抗虫育种。     

幽门螺杆菌毒力基因与克拉霉素耐药基因突变相关性

目的 分析浙江省台州地区幽门螺杆菌（helicobacter pylori,Hp）cagA和VacA为主的毒力基因型分布,探讨其与克拉霉素耐药基因突变类型的关系。方法 招募存在上消化道症状患者,并行胃镜检查活检患者胃黏膜组织。通过Hp分离培养方法,培养出216株Hp。采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测并分析cagA和VacA的分型情况。采用PCR扩增和Sanger测序技术检测克拉霉素耐药基因（23S rRNA）2142和2143位碱基点突变情况。结果 CagA基因的阳性检出率为99.54%（215/216）,其中CagA-D为95.83%（207/216）、CagA-C为3.70%（8/216）。VacA基因阳性检出率为97.22%（210/216）,s1、s2、m1、m2亚型分别为97.22%（210/216）、0、35.19%（76/216）、60.65%（131/216）。本研究发现,浙江省台州地区毒力基因以CagA-D和VacAs1 m2型为优势基因型。此外,23S rRNA基因2142和2143位点均未突变的有93株。突变的有123株,其中A2142G位点突变4株、A2143G位点突变119株。毒力基因型与23S rRNA基因2142和2143位点突变类型无相关性（P>0.05）。结论 台州地区为HP高毒力地区,且以CagA-D和VacAs1 m2型为主,其分布与克拉霉素耐药基因突变无密切相关性。     

新生儿晚期黄疸人巨细胞病毒gB基因分型研究

目的了解引起新生儿晚期黄疸患者人巨细胞病毒(HCMV)gB基因型的分布,探讨HCMVgB基因多态性与黄疸之间的关系。结论采用荧光定量PCR法检测本院新生儿科98例晚期黄疸新生儿标本HCMV-DNA含量,巢式聚合酶链反应扩增阳性标本HCMVgB基因,并进行DNA测序,绘制种系进化树。利用HinfⅠ和RsaⅠ对gB基因进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析。结果 30例晚期黄疸新生儿HCMV荧光定量PCR检测阳性,阳性率为30.6%。种系进化树分析结果显示gB基因分为4个基因型,gB1型15株(50%),gB2型5株(16.7%),gB3型9株(30.0%),gB1/3混合型1株(3.3%)。以HCMV实验室标准株AD169作为参考,将序列进行同源性比较,gB1型同源性为94.7%～95.0%,gB2型同源性93.1%～93.4%,gB3型同源性94.7%,gB1/3型同源性93.7%。RFLP分析将gB基因分为4个基因型,分型结果与种系进化树分型一致。结论 HCMV感染是导致新生儿晚期黄疸的原因之一;gB基因的DNA序列比较保守,但仍存在一定的多态性,晚期黄疸新生儿中HCMV感染以gB1、gB3型为主。     

幽门螺杆菌CagA基因的原核表达及抗原性测定

目的：合成胃癌相关幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)的 CagA基因片段,建立原核表达系统,鉴定重组表达产物的抗原性。方法：选取前期研究确定的与胃癌相关的H.pylori CagA基因片段,优化设计并合成CagA基因,将合成的CagA基因从pUC57-CagA质粒中切出,用表达载体pET32a携带该基因转化宿主菌BL21(DE3),通过氨苄青霉素抗性筛选和菌落PCR挑选出阳性克隆pET32a-CagA;以IPTG诱导含pET32a-CagA的宿主菌表达融合蛋白,经SDS-PAGE凝胶电泳分析CagA蛋白表达情况,用Western印迹鉴定融合蛋白的抗原性。结果：设计并人工合成了CagA基因片段,序列测定结果显示,合成的CagA基因序列与设计的序列（AF289435）基本一致;成功构建pET32a-CagA原核表达质粒,对应蛋白序列与AAG09884同源性为100%;含pET32a-CagA的BL21(DE3)宿主菌经IPTG诱导后能表达CagA融合蛋白,经SDS-PAGE凝胶电泳分析结果表明,融合蛋白相对分子质量大小与预期一致(45 kD);Western印迹检测结果显示该融合蛋白可与抗H.pylori全菌抗体结合反应。结论：本实验构建的原核表达系统表达的CagA融合蛋白具有良好的抗原性,为临床胃癌相关H.pylori菌株的筛选和针对性治疗奠定了基础。     

幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A绿色荧光蛋白真核表达载体的构建

目的构建含幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A（CagA）基因片段的绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-CagA。方法从幽门螺杆菌细胞株中扩增出CagA基因片段,经回收、纯化,连接到质粒pGEM-T上,测序、酶切后与质粒pEGFP-C3连接,脂质体法将pEGFP-C3-CagA转染入胃癌细胞株BGC823,用荧光显微镜观察转染的细胞。结果通过测序、酶切证明CagA插入质粒正确,构建出载体pEGFP-C3-CagA,转染后经荧光显微镜观察到胃癌细胞株BGC823中有绿色荧光。结论成功构建表达CagA的真核绿色荧光载体。     

Lack of correlation of vacA genotype, cagA gene of Helicobacter pylori and their expression products with various gastroduodenal diseases

目的　研究幽门螺杆菌vacA基因型、cagA基因 ,空泡形成细胞毒素和血清CagA抗体与胃十二指肠疾病的关系。　方法　应用多聚酶链反应方法对 6 2例慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌患者分离获得幽门螺杆菌菌株的vacA基因型和cagA基因进行测定 ;应用Hela细胞方法测定体外空泡形成细胞毒素活性 ;应用酶免疫测定方法检测同一患者的血清CagA抗体。结果　 6 2株幽门螺杆菌菌株均具有vacA基因 ,所有菌株的vacA基因型均为sla/m2型。cagA基因的总阳性率为5 6 4 5 % ;慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌患者分离获得幽门螺杆菌的cagA基因阳性率分别为 5 5 5 6 %、5 4 17%和6 3 6 4 % (P >0 0 5 )。空泡形成细胞毒素的阳性率为 37 10 % ,慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌患者分离获得幽门螺杆菌菌株表达空泡形成细胞毒素的阳性率分别为 33 33%、2 9 17%和 6 3 6 4 % (P >0 0 5 )。慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌患者血清CagA抗体分别为 70 37%、79 17%和 4 0 0 0 % (P >0 0 5 ) ,血清CagA抗体的总阳性率为 6 8 85 %。结论　幽门螺杆菌vacA基因型、cagA基因、空泡形成细胞毒素和血清CagA抗体不能预示H pylori感染个体将更可能发生何种类型胃十二指肠疾病。     

实验动物皮肤病原真菌核酸鉴定方法的建立

目的选择一种快速、敏感和特异的方法来检测实验动物皮肤病原真菌.方法选取真菌CHS1基因中一段序列设计皮肤真菌通用引物和选取一种随机引物FM1,利用聚合酶链反应（PCR）扩增三种动物皮肤病原真菌标准株：须毛癣菌、石膏样小孢子菌、犬小孢子菌.结果两种引物扩增产物片段大小在三种真菌之间有明显不同.结论本实验方法可快速特异性检测实验动物皮肤病原真菌.     

特异引物PCR鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌方法的建立和优化

目的以16S rRNA编码序列为靶基因,建立特异引物PCR鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌方法并优化。方法以类鼻疽伯克霍尔德菌标准菌株K96243的16S rRNA编码序列为靶序列,通过Primer Premier 5软件搜索特异的引物,以该菌为模板,优化特异引物PCR的退火温度、退火时间和反应循环数等条件。得到最优PCR反应条件后,将该方法用于检测临床分离的类鼻疽伯克霍尔德菌菌株和常见细菌感染病原体(大肠杆菌、痢疾志贺菌、伤寒沙门菌、幽门螺旋杆菌、金黄色葡萄球菌、甲型链球菌和乙型链球菌),评价该方法的有效性和特异性。结果共设计3对引物,分别扩增16S rRNA编码序列283～672、760～1 061、771～1 193片段,优化后PCR反应条件为:94℃预变性4 min,94℃变性40 s,54.5℃退火20 s,72℃延伸40 s,24个循环,最后延伸1 min;特异性分析发现此方法能将类鼻疽伯克霍尔德菌与其他常见感染病原菌进行有效地鉴别诊断。结论成功建立并优化一种快速鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌的方法,通过此方法能有效的从单个菌落中和基因组水平鉴定临床分离的8株类鼻疽伯克霍尔德菌。     

2000年中国结核病流行病学抽样调查菌株分子流行病学特征

目的　从分子流行病学角度探讨中国结核分枝杆菌的分布特征。方法　样本的获得采用全国范围等比例分层整群随机抽样 ;构建以IS6 110RFLPDNA指纹方法和以DR为基础的SpoligotypingDNA指纹方法 ;采用Gelcompare4 1软件对DNA指纹图谱进行数字化 ,比较其相似性 ;同时应用该软件行聚类 (cluster)分析 ;用 χ2 检验比较不同组别病人的分离菌株成簇率 (clustering)的差别 ,利用公式 1和 2计算影响结核病近期传播的危险因素 (OR值 )。结果　共获得 4 0 2株可进行DNA指纹分析的结核分枝杆菌 ;其中 5 0 75 % (2 0 4 / 4 0 2 )为“北京基因型”菌株 ;发现 3簇指纹图谱相同的菌株 ,其中 1簇对应的病人来源于同一家庭 ;分组统计显示 :男性组与女性组、年龄≥ 4 0岁组与<4 0岁组成簇率之间差异有显著性 (P <0 0 5 ) ,近期传播的危险因素男性为OR1:2 0 4 95 %CI(1 0 7～ 3 96 ) ,OR2 :4 96 95 %CI(2 77～ 9 0 0 ) ;<4 0岁为OR1:1 6 895 %CI(1 0 1～ 2 80 ) ,OR2 :1 30 95 %CI(0 2～ 0 4 4 ) ,其他各组之间差异无显著性 (P >0 0 5 )。结论　北京基因型结核分枝杆菌在中国呈较高水平的流行 ;男性和年长 (≥ 4 0岁 )可能为结核病近期传播的危险因素。利用结核分枝杆菌的DNA指纹图谱 ,可以实现结核分枝杆菌传染源     

CagA基因阳性Hp培养滤液对人胃粘膜上皮细胞系DNA损伤作用

目的 研究 CagA阳性幽门螺杆菌（Hp）培养滤液对人胃粘膜上皮细胞（GES－1）DNA的损伤作用。方法 制备Hp培养滤液,PCR鉴定CagA基因。采用单细胞微凝胶电泳观察Hp（CagA＋）培养滤液对GES－1细胞DNA的损伤作用。结果 Hp（CagA＋）培养滤流可使GES－1细胞形成彗星现象。结论 Hp（CagA＋）培养滤液可以导致GES－1细胞的DNA损伤。DNA损伤可能是CagA诱导GES－1细胞恶性转化的机制之一。     

Study of the relationship between the Helicobacter pylori and CagA gene in patients with gastric carcinomaG2

目的:通过检测胃癌和浅表性胃炎组织幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)和细胞毒素相关蛋白基因(CagA),探讨Hp及CagA基因与胃癌相关性及Hp形成胃癌的可能机制。方法:应用快速尿素酶试验和组织切片革兰染色和血清HpCagA抗体检测Hp,用PCR检测HpCagA基因。结果:慢性浅表性胃炎、胃癌组织中Hp检出率分别为45.9%和54.8%,两者差异无显著性(P>0.05),两种组织中HpCagA检出率分别为35.3%和77.5%,两者差异有显著性(P<0.005)。结论:胃癌组织与浅表性胃炎组Hp感染相比差异无显著性,胃癌组织中HpCagA基因检出率明显高于浅表性胃炎组,HpCagA基因与胃癌有一定相关性,HpCagA基因可能涉及胃癌的形成机制。     

Fluoroquinolone resistance and mutation patterns in <Emphasis Type="Italic">gyrA</Emphasis> and <Emphasis Type="Italic">parC</Emphasis> genes in <Emphasis Type="Italic">Neisseria gonorrhoeae</Emphasis> isolates from Shanghai,China

In order to study the resistance of Neisseria （N.） gonorrhoeae to the fluoroquinolone and detect mutation patterns of quinolone resistance-determining regions （QRDRs） of clinical isolates in Shanghai, China, a total of 80 clinical isolates of N. gonorrhoeae were consecutively collected from Shanghai. The MIC of fluoroquinolone for the isolates was examined by using the agar dilution method and the mutation profiles of the QRDRs of gyrA and parC were analyzed by sequencing and restriction fragment length polymorphism （RFLP）. Chi-square test was used for comparison of the t：nutation patterns. The results showed that： （1） High percentages of the 8 isolates were resistant to ciprofloxacin （95.0%）, ofloxacin （95.0%） and lomefloxacin （97.5%）, only one strain was susceptible to the ciprofloxacin. （2） Sensitive strains had a substitute of Asp95→Ala in the gyrA, and all isolates that were resistant or intermediated to the ciprofloxacin, had a double mutation in the gyrA （Ser91, Ala 92 and Asp95）. Some strains also had a mutation in the parC. （3） The MICs of these isolates were significantly associated with the mutation patterns in the gyrA and parC. A double mutation of gyrA combined with parC87 mutation was a predominant pattern in Shanghai and could mediate high level resistance to ciprofloxacin. It suggests that mutations in the QRDRs of gyrA and parC may be responsible for the fluoroquinolone resistance. And fluoroquinolone could not be used as the first line antibiotics for gonorrhea treatment any more in Shanghai, China.     

百色地区居民幽门螺杆菌的毒力及其耐药状况研究

目的调查百色地区居民感染幽门螺杆菌（Hp）的细胞毒素相关基因（cagA）、空泡毒素基因（vacA）的流行情况及甲硝唑耐药状况;探讨Hp的cagA、vacA型与胃肠疾病的关系。方法百色地区上腹不适来诊并行胃镜检查的患者中,尿素酶试验阳性者,用免疫印迹法检查Hp的细胞毒素CagA、空泡毒素VacA、尿素酶（Ure）、氮素还原酶（Rdxa）抗体,Ure阳性者确认Hp感染;Rdxa＋为对甲硝唑敏感菌株,反之为耐甲硝唑菌株;据CagA和VacA抗体的阳性或阴性以及它们之间不同组合分为若干菌型。结果Hp检出率42．09％（362／860）,Hp的CagA、VacA抗体阳性者分别为73．20％（265／362）和60．77％（220／362）,根据上述2种检测抗体结果的组合,有3种菌型即CasA＋／VacA＋、CagA-／VacA-CasA＋／VacA-,分别占60．77％、26．80％和12．71％;CagA、VacA抗体和CagA＋／VatA＋、CagA-／VacA-菌型在胃癌、消化性溃疡、胃炎中的表达分布差异有统计学意义（P=0．000）。规范根除Hp,总根除率86．38％（298／345）,CagA＋／Vata＋与CagA-／VatA-两种菌型根除率比较差异有统计学意义（P=0．031）;Rdxa＋组和Rdxa-组根除率分别为84．44％（76／90）和87．06％（222／255）,比较差异无统计学意义（P=0．534）。Rdxa-菌株占72．93％。结论百色地区上消化道疾病患者感染的幽门螺杆菌以CagA＋、VacA＋基因型占优势,并且与上消化道疾病严重程度存在显着相关性。推测百色地区甲硝唑耐药率较高。