宁夏地区人畜BDV p24基因系统发生树构建和序列分析

目的 了解宁夏及其周边地区博尔纳病病毒(BDV)的感染状况和基因特征及其种系发生来源.方法 采用巢式反转录实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-nRT-PCR),检测119例病毒性脑炎(VE)患者和其密切接触的患病或健康牛205头、绵羊978只及脑血管病患者46例、多发硬化患者13例的外周血单核细胞BDVp24片段,检出的阳性序列连同前期检出的宁夏绵羊、VE患者和抑郁症患者阳性BDVp24基因序列与GenBank中5个国家7个动物种属29例BDVp24基因序列进行比对,分析其核苷酸和氨基酸序列的同源性,重新构建基因系统发生树.结果 23例阳性检测标本连同3例前期检测序列基因聚合分析显示核苷酸之间的同源相似度为96.5%～100.0%,氨基酸的同源相似度为95.3%～100.0%.与德国马源性标准株HE80同源相似度较高.构建基因的系统发生树发现宁夏绵羊、VE患者和抑郁症患者同德国马和绵羊、奥地利马都各自形成了独立的支系,其余样本形成混合支系,其中宁夏的VE患者、牛、绵羊同德围马、日本绵羊形成德国-中国宁夏-日本混合支系.结论 宁夏及其周边地区人和动物BDV的感染,存在区域源性BDV独立株和国外传人基冈保守株的多源状态.     

遵义市及周边地区博尔纳病毒感染分子流行病学研究

目的 探讨博尔纳病毒(BDV)在遵义市及周边地区流行状况.方法 采用荧光定量巢式反转录酶聚合酶链反应(FQ-nRT-PCR)检测43例病毒性脑炎(VE)患者、9例多发性硬化(MS)患者、7例急性吉兰-巴雷综合征(GBS)患者、5例帕金森病(PD)患者、98名健康人外周血液单个核细胞(PBMC)、300只山羊PBMC中BDV p24基因片段.对阳性产物进行基因序列测定,氨基酸顺序及同源性分析,并分析BDV分子流行病学特点.结果 BDV p24基肉片段阳性率VE患者为13.95%,MS患者为22.22%,而GBS和PD患者及健康人中未检出.VE和MS患者检出率明显高于健康人(0%,P<0.05),山羊BDV p24基冈片段阳性率为0.67%,与健康人对比差异尢统计学意义(P>0.05);VE和MS患者测序结果 相同与GenBank提供的strain V毒株比较同源性为96.51%,有3个位点出现一致性沉寂突变,BDV/MDCK毒株比较同源性为97.67%,有2个位点出现一致性沉寂突变,与C6BV毒株比较有2个位点出现一致性沉寂突变,其山羊中BDV p24基因片段测序结果 与GenBank提供的strain V毒株比较同源性为96.51%,有3个位点出现一致性沉寂突变,与BDV/MDCK毒株比较同源性为96.51%,有3个位点出现一致性沉寂突变,与C6BV毒株比较同源性为96.51%,有3个位点出现一致性沉寂突变,但所编码的氨基酸没有改变.结论 遵义市及周边部分地区VE、MS可能与BDV感染有关,人类感染BDV可能存在动物源性.     

新疆伊犁地区不同品种犬博尔纳病病毒自然感染调查

目的 调查新疆伊犁地区不同品种犬博尔纳病病毒(BDV)流行现状和分析其可能的种系来源.方法 采用改进的巢式反转录PCR(nRT-PCR)方法,检测犬外周血单核细胞(PBMCs)BDV磷蛋白(p24)RNA基因片段.用BDV核蛋白(p40)RNA片段和质粒PMD19标准品验证p24阳性产物,排除可能的假阳性.验证后的阳性产物进行基因测序、同源比对、氨基酸序列和系统发生学分析.结果 8个品种150只犬中,仅哈萨克牧羊犬检出BDV p24片段,阳性率为11.0%(10/91).基因序列与德国马He/80和德国绵羊S6病毒株同源相似度分别为99.2%和95.7%,氨基酸相似度为100%和89.3%,亲缘关系与He/80最近,其次为S6.结论 新疆伊犁地区哈萨克牧羊犬可能存在BDV自然感染,其流行株与该地区伊犁马感染的He/80和引进德国美利奴绵羊的S6病毒株有关.     

新疆伊犁地区不同品种犬博尔纳病病毒自然感染调查

目的 调查新疆伊犁地区不同品种犬博尔纳病病毒(BDV)流行现状和分析其可能的种系来源.方法 采用改进的巢式反转录PCR(nRT-PCR)方法,检测犬外周血单核细胞(PBMCs)BDV磷蛋白(p24)RNA基因片段.用BDV核蛋白(p40)RNA片段和质粒PMD19标准品验证p24阳性产物,排除可能的假阳性.验证后的阳性产物进行基因测序、同源比对、氨基酸序列和系统发生学分析.结果 8个品种150只犬中,仅哈萨克牧羊犬检出BDV p24片段,阳性率为11.0%(10/91).基因序列与德国马He/80和德国绵羊S6病毒株同源相似度分别为99.2%和95.7%,氨基酸相似度为100%和89.3%,亲缘关系与He/80最近,其次为S6.结论 新疆伊犁地区哈萨克牧羊犬可能存在BDV自然感染,其流行株与该地区伊犁马感染的He/80和引进德国美利奴绵羊的S6病毒株有关.     

博尔纳病病毒感染与病毒性脑炎发病的关系

目的 检测宁夏地区不明原因病毒性脑炎患者外周血单个核细胞(PBMCs)博尔纳病病毒(BDV)携带情况,分析BDV与标准病毒株之间的同源性.探讨BDV感染性疾病与不明原因病毒性脑炎之间的关系,同时也为部分病毒性脑炎的病因学诊断及其防治提供实验依据.方法 采用荧光定量巢式反转录酶聚合酶链反应(FQ-nRT-PCR)检测宁夏地区不明原因病毒性脑炎患者及正常人PBMCs BDV p24基因片段,并对其中阳性扩增产物进行基因序列测定,然后采用BLAST软件以及DNAsist 5.0软件对测序结果进行分析.结果 病毒性脑炎组样本BDVp24基因片段FQ-nRT-PCR阳性率(10.17%)显著高于正常对照组(0%)(P＜0.05).病毒性脑炎患者检出BDVp24基因片段的核苷酸序列与马BDV标准病毒株H3915序列同源性为97.67%,与H1766株比较在3个位点出现一致性突变(nt1659 T→C,nt1668 A→G,nt1674 T→C;突变率为3.49%);与strain V株比较在4个位点出现一致性突变(nt1648 C→T,nt1658 G→A,nt1667 A→G,nt1673 T→C;突变率为4.65%),但编码的氨基酸相同.证实扩增所得目的 基因片段确系BDV p24的相应片段.结论 宁夏地区不明原因病毒性脑炎患者中存在BDV感染,提示部分不明原因病毒性脑炎的发生可能与BDV感染有关.且该BDVp24扩增产物核苷酸序列与标准病毒株高度同源性,与马源strain H3915同源性最高.     

新疆伊犁地区马群中博尔纳病病毒自然感染调查

目的 了解新疆伊犁地区马群中博尔纳病病毒(BDV)的流行状况,分析该病毒的种系来源.方法 采用改进的巢式反转录PCR(nRT-PCR)方法对新疆伊犁地区120匹马的外周血单个核细胞(PBMC)及脑组织中的BDV p24基因片段进行检测,对阳性产物进行基因序列测定和同源性分析.结果 有3匹马外周血和腩组织中同时检测到BDV,阳性率为2.5%(3/120).扩增产物序列与其他国外马源BDV分离株同源性>93%,与标准株He/80同源性达到98%以上.结论 新疆伊犁地区马群中存在BDV的自然感染.该地区BDV流行株与标准株He/80存在高度的同源性.     

北京丰台区2013年春季流行麻疹野病毒的基因型分析

目的了解丰台区流行的麻疹野病毒的基因特征,为控制和消除麻疹提供依据。方法采集2013年春季疑似麻疹爆发和散发患者咽拭子标本分离病毒,通过逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）,从分离到的麻疹病毒中扩增出核蛋白（nucleoprotein,N）基因c末端634个核苷酸片段,再对扩增产物进行核苷酸序列测定和分析,并以C末端450个核苷酸片段构建基因亲缘关系树,进行遗传距离分析。结果共分离麻疹病毒39株,测序后为H1基因型（28株）和D8基因型（11株）。结论丰台区2013年春季麻疹流行株仍属于H基因组,Hl基因型,Hla亚型。此外北京市丰台区首次发现D8基因型麻疹野病毒。     

新疆博乐地区大沙土鼠感染恙虫病东方体基因分型与序列分析

目的鉴定新疆博乐地区恙虫病东方体分离株的基因型别,分析其核苷酸序列。方法应用巢式PCR（nPCR）对新疆博乐地区采集的鼠标本Ot-Sta56KDa基因片段进行检测,PCR扩增产物纯化后测序,进行序列分析。结果博乐地区艾比湖滩涂地优势鼠种为大沙土鼠;在大沙土鼠脾总DNA用群引物扩增出481507bp的目的片段;经相应型引物扩增出了目的片段,序列同源性显示,核苷酸序列与KarpI、SS-11、Taiwan的核苷酸序列的同源性为97%,与Kanda的核苷酸序列同源性为92%。系统发生树表明,分离株与Karp株亲缘关系较近。结论在新疆地区首次从大沙土鼠中分离并扩增到恙虫病东方体基因片段,与Karp株型有较近的亲缘关系。     

博尔纳病病毒自然感染状况及其核苷酸序列

目的探讨中国黑龙江地区正常人和马博尔纳病病毒(Boma Disease Virus,BDV)自然感染状况,进而比较分析中国自然感染的BDV与国外精神分裂症患者和患病马的BDV分离株及标准株He/80在种系发生中的关系.方法用巢式RT-PCR方法检测中国黑龙江地区正常人和马匹单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中BDV-p24基因片段,分别随机选取每种样本部分阳性扩增产物进行克隆测序,测序结果与国外精神分裂症患者和患病马的BDV分离株以及标准株He/80进行序列比较.结果76例正常人、34匹马的标本中BDV-p24基因的阳性检出率分别为9.2%(7/76)和23.5%(8/34).序列分析结果表明,中国黑龙江地区正常人和马感染的BDV的核苷酸序列除与一个新亚型株No/98差别较大(大于15%)外,与其他国外精神分裂症患者和马源BDV分离株同源性均大于94%,与标准株He/80同源性达到98%以上.结论证实黑龙江地区正常人和马中存在BDV的自然感染.该地区感染的BDV与标准株He/80存在高度的同源性.     

新疆博乐地区大沙土鼠感染恙虫病东方体基因分型与序列分析

目的 鉴定新疆博乐地区恙虫病东方体分离株的基因型别,分析其核苷酸序列.方法 应用巢式PCR(nPCR)对新疆博乐地区采集的鼠标本Ot-Sta56KDa基因片段进行检测,PCR扩增产物纯化后测序,进行序列分析.结果 博乐地区艾比湖滩涂地优势鼠种为大沙土鼠;在大沙土鼠脾总DNA用群引物扩增出481～507bp的目的 片段;经相应型引物扩增出了目的 片段,序列同源性显示,核苷酸序列与Karp、ISS-11、Taiwan的核苷酸序列的同源性为97%,与Kanda的核苷酸序列同源性为92%.系统发生树表明,分离株与Karp株亲缘关系较近.结论 在新疆地区首次从大沙土鼠中分离并扩增到恙虫病东方体基因片段,与Karp株型有较近的亲缘关系.     

HBV感染患者外周血单个核细胞HBV DNA和cccDNA的检测

目的 探讨乙型肝炎患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）能否感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）并进行复制。方法 选取 137例住院患者作为研究对象,采集血液标本,分离提取外周血单个核细胞,使用细胞甩片法固定细胞,采用实时荧光定量聚合酶链式反应技术（real-time quantitative polymerase chain reaction,QPCR）和滚环扩增结合原位跨缺口原位聚合酶链式反应技术检测HBV共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）;免疫组织化学染色法检测HBV DNA和HBV cccDNA表达。结果 137例标本中,68.6%（94/137）的标本经免疫组化染色后检测出HBV DNA的表达;83.9%（115/137）的标本原位杂交和滚环扩增PCR后检出HBV cccDNA阳性信号;血清HBV DNA浓度高于106 copies/ml的患者PBMC中HBV cccDNA阳性率为95.1%,低于106 copies/ml的阳性率为51.4%。结论 高浓度外周血HBV DNA是HBV感染外周血单个核细胞的危险因素,通过原位聚合酶链式反应方法能够更灵敏地检测HBV DNA和cccDNA在PBMC中的表达,为进一步研究证实PBMC感染导致HBV母婴传播途径的分子机制奠定基础。     

Wild birds as a possible natural reservoir of Borna disease virus

The natural reservoir of Borna disease virus (BDV) is unknown. In this paper, we show that mallards (Anas platyrhyncos) and jackdaws (Corvus monedula) can be subclinically infected carriers of this virus. From faecal samples collected at a bird pond, we were able to amplify fragments of the BDV p24 and p40 genes. Following cloning and sequencing, a phylogenetic analysis revealed that these birds carry strains of BDV closely related to but distinct from the reference strains BDV V and He/80. To our knowledge, this is the first confirmed finding of BDV in wild birds.     

荧光定量PCR检测慢性乙肝患者外周血单个核细胞乙肝病毒 DNA

目的探讨定量检测慢性乙肝患者外周血单个核细胞(PBMC)乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)的临床意义.方法采用荧光定量PCR检测PBMC及血清中HBV-DNA含量.结果 49例慢性乙肝患者PBMC及血清中HBV-DNA阳性率分别为44.9%(22/49),51.0%(25/49),两者阳性率无统计学意义的差异(P＞0.05),具有一致性;血清HBV-DNA高水平组PBMC的HBV-DNA含量与低水平组比较,两者有统计学意义差异(P＜0.01);血清HBV- DNA高水平组PBMC的HBV-DNA阳性率(100%)与血清低水平组PBMC的HBV-DNA阳性率(42.9%)比较,两者有统计学意义的差异(P＜0.05);在24例血清HBV-DNA阴性患者中,发现5例PBMC HBV-DNA阳性.结论 PBMC的HBV-DNA检测可反映病毒在体内的复制程度,是对慢乙肝患者血清HBV-DNA检测有意义的补充,有助于临床上对慢乙肝患者血清病毒复制状态的了解及指导治疗用药.