佛波酯通过抑制蛋白激酶B活性诱导血管平滑肌细胞凋亡

目的探讨佛波酯对血管平滑肌细胞凋亡的影响及可能的作用机制。方法用佛波酯处理体外培养的大鼠动脉平滑肌细胞A10,原位缺口末端标记法检测佛波酯对平滑肌细胞凋亡的影响;用免疫印迹法检测蛋白激酶B及其下游底物的总蛋白和磷酸化水平。结果佛波酯可诱导平滑肌细胞的凋亡。过度表达持续活性的蛋白激酶B明显抑制佛波酯诱导的细胞凋亡;相反,显性负性蛋白激酶B加重佛波酯的促凋亡作用。进一步研究发现,佛波酯可降低蛋白激酶B的磷酸化水平,并随着剂量的增高或时间的延长而逐步降低,同时佛波酯也能抑制蛋白激酶B下游的靶蛋白如叉头转录因子3a和糖原合成酶激酶3β磷酸化水平。最后发现蛋白激酶C抑制剂可阻断佛波酯降低蛋白激酶B磷酸化水平的作用,但丝裂原活化蛋白激酶抑制剂无此作用。结论佛波酯通过蛋白激酶C信号途径抑制蛋白激酶B激酶活性而诱导平滑肌细胞凋亡。     

编码大鼠血管紧张素转换酶短发夹环RNA质粒的构建与鉴定

目的构建编码大鼠ACE mRNA的shRNA真核表达载体质粒,为利用基因沉默技术从转录后水平进行高血压治疗的研究做准备。方法根据大鼠ACE mRNA序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆进入载体pGenesil-1,并进行酶切鉴定和测序。结果酶切证明构建的shRNA已插入载体,经测序证明与设计的相同,获得大鼠ACE的shRNA表达载体质粒。结论构建的编码大鼠ACE mRNA的shRNA真核表达载体可进入哺乳动物细胞内表达短发夹RNA,经Dicer酶裂解成si R-NA并降解靶基因mRNA,而达到基因干扰的作用。为利用其进行自发性高血压大鼠的降压治疗研究奠定了基础。     

RNA干扰对肝癌细胞增殖及其Bcl-2表达的影响

目的观察靶向Bcl-2基因的shRNA对肝癌HepG-2细胞增殖及其Bcl-2表达的影响。方法构建靶向Bcl-2基因的shRNA,转染对数生长期HepG-2细胞,设空白组、空载体组、pGenesil—B1组、pGenesil-B2组、pGenesil-B3组、pGenesil-S组;MTT法检测HepG-2细胞增殖抑制率,流式细胞仪检测HepG-2细胞凋亡率,RT-PCR法检测Bcl-2 mRNA,免疫细胞化学SP法检测Bcl-2蛋白。结果空白组、空载体组、pGenesil—B1组、pGenesil-B2组、pGenesil-B3组、pGenesil—S组细胞抑制率分别为0、4．6％、3．8％、46．4％、8．3％、0．13％,细胞凋亡率分别为33．95％、48．80％、69．14％、90．50％、58．14％、50．96％,Bcl-2 mRNA的表达抑制率分别为0、3％、8．3％、49．1％、4．8％、1．8％,Bel-2蛋白阳性率分别为38．15％±3．46％、35．25％±2．67％、15．21％±2．32％、9．51％±2．51％、14．15％±2．67％、36．83％±3．35％,pGenesil-B2组与其他各组相比,P均〈0．01。结论shRNA可致HepG-2细胞凋亡,并抑制Bcl-2的表达。     

辛伐他汀对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响

目的观察辛伐他汀对血管平滑肌细胞增殖、迁移及血管内皮生长因子表达的影响。方法体外培养大鼠原代血管平滑肌细胞,体内建立大鼠动脉粥样硬化血管损伤模型,分为正常对照组、动脉粥样硬化损伤组、低剂量和高剂量辛伐他汀组。4周后处死动物,酶法测定血脂水平,检测胸主动脉和左颈总动脉内膜/(内膜 中膜)比值,免疫组织化学和逆转录聚合酶链反应法检测血管内皮生长因子的表达。结果辛伐他汀对血管平滑肌细胞的增殖和迁移无双向调节作用。小剂量辛伐他汀对血管平滑肌细胞的增殖和迁移无促进作用,大剂量辛伐他汀抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移,且随着时间延长和浓度增加其抑制作用增强,这种作用不依赖辛伐他汀的调脂性。辛伐他汀能减少血管平滑肌细胞血管内皮生长因子的表达,且高浓度的辛伐他汀显著减少血管内皮生长因子的表达。结论辛伐他汀可能通过减少血管平滑肌细胞血管内皮生长因子的表达来抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移。     

银杏叶对血管平滑肌细胞增殖活性的影响

目的研究银杏叶对血管平滑肌细胞增殖活性的影响。方法对大鼠的胸主动脉平滑肌细胞采用组织块培养法,用四氧基偶氮硝基唑蓝（MTT）法测定细胞活性。结果与正常对照组比较,高糖（30mmol/L）在24h、48h、72h均有较强的促进大鼠VSMC增殖作用（P〈0.01）;与高糖组比较,不同剂量的EGB对过度增长的VSMC有抑制作用（P〈0.05）。结论EGB制剂可抑制高糖引起的VSMC过度增殖。     

阿司匹林对血管平滑肌细胞增殖及增殖细胞核抗原表达的影响

目的探讨阿司匹林对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响及相关机制。方法体外培养大鼠主动脉平滑肌细胞,用不同浓度的阿司匹林处理,并且设置对照组,采用MTT法检测阿司匹林对血管平滑肌细胞增殖活性的影响,用免疫细胞化学和逆转录聚合酶链反应检测阿司匹林作用后血管平滑肌细胞中增殖细胞核抗原的表达。结果较高浓度(5×10-3mol/L)的阿司匹林对血管平滑肌细胞的增殖有明显抑制作用(P<0.05),相对抑制率为31.5%。与对照组相比,该浓度组血管平滑肌细胞中增殖细胞核抗原的蛋白和mRNA表达量均显著降低(P<0.05)。结论阿司匹林可能通过降低增殖细胞核抗原的表达来抑制血管平滑肌的增殖,对心血管系统具有抗血小板聚集之外的保护作用。     

三七总皂甙对血管平滑肌细胞增殖及JNK磷酸化的影响

目的以往的研究发现，三七总皂甙（TPN）具有抑制和促进血管平滑肌细胞（VSMC）增殖的双重作用，但至今对其作用机制十分不明。本研究旨在观察TPN对大鼠VSMC增殖的影响及经由何种信号通路介导。方法体外培养的大鼠VSMC给予TPN不同浓度作用一定时间或某一特定浓度不同作用时间，采用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）和蛋白印迹（Western blot）法观察了VSMC增殖的变化及c-Jun氨基末端激酶（JNK）磷酸化的变化。结果TPN能快速的激活JNK1／2，并呈时间和浓度依赖性。     

过氧化氢酶过度表达对血管平滑肌细胞凋亡的影响

目的 探讨腺病毒戢体介导的过氧化氢酶基因转染对体外培养的人血管平滑肌细胞凋亡的影响。方法 用含过氧化氢酶基因的重组腺病毒转染人血管平滑肌细胞，采用Western blot方法检测血管平滑肌细胞过氧化氢酶的表达。应用流式细胞术、TUNEL法等方法检测血管平滑肌细胞的凋亡。结果 含过氧化氢酶基因的重组腺病毒转染后血管平滑肌细胞过氧化氢酶表达明显增多；流式细胞术显示含过氧化氢酶基因的重组腺病毒组与对照组比较凋亡率明显增加（P〈0．01）。经TUNEL分析显示，含过氧化氢酶基因的重组腺病毒组凋亡细胞明显多于对照组。两者之间有显著性差异（P〈0．001）。结论 腺病毒载体介导的过氧化氢酶基因转染导致过氧化氢酶过度表达。促进人血管平滑肌细胞的凋亡，这可能是防治经皮腔内冠状动脉血管成形术后再狭窄的一种新方法。     

应用RNA干扰技术体外抑制脂蛋白脂肪酶基因的表达

目的给探讨脂蛋白脂肪酶基因作为动脉粥样硬化基因治疗靶点提供实验基础.方法利用RNA干扰技术在细胞水平抑制脂蛋白脂肪酶基因的表达,根据人脂蛋白脂肪酶基因设计靶序列短发夹RNA,构建重组干扰质粒pSIREN-DNR-shRNA,将干扰质粒与人脂蛋白脂肪酶真核表达质粒pCDNA3-hLPL以脂质体方法共转染COS-7细胞,通过实时荧光定量聚合酶链反应、Western blot和活性检测等方法判断脂蛋白脂肪酶基因抑制的效果.结果转染干扰质粒的细胞中脂蛋白脂肪酶mRNA、蛋白表达以及酶活性均明显降低,抑制率可达70%以上.结论所选靶序列可以有效抑制细胞中脂蛋白脂肪酶基因的表达,为进一步的体内研究奠定了基础.     

Ap-1基因RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的探讨Ap-1基因RNA干扰抑制血管平滑肌细胞（VSMCs）基因对VSMCs增殖的影响。方法以Ap-1基因RNA干扰VSMCs基因,应用MTr比色试验检测VSMCs增殖情况,流式细胞仪检测VSMCs细胞周期,免疫细胞化学染色观察增殖细胞核抗原（PCNA）表达。结果siRNA转染后,3个阳性siRNA转染组Ap-1基因表达水平均降低;VSMCs的MTY吸光度值和PCNA表达量均降低;VSMCs出现明显的G0／G1期阻滞。结论RNA干扰介导的Ap-1基因沉寂可显著抑制VSMCs增殖。     

PI3K/Akt在肺炎衣原体感染诱导血管平滑肌细胞迁移中的作用

目的研究PI3K/Akt在肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae,C.pn)感染诱导血管平滑肌细胞(vascularsmooth muscle cell,VSMC)迁移中的作用。方法利用透射电镜鉴定C.pn成功感染VSMC;采用PI3K特异性抑制剂LY294002预处理VSMC后,wound-healing实验和Transwell实验分别观察VSMC迁移能力的改变;Western blot实验检测VSMC内Akt的磷酸化水平。结果透射电镜可观察到感染的VSMC内出现典型的C.pn原体;C.pn感染VSMC 24 h后,细胞迁移实验结果显示C.pn感染组VSMC的迁移能力增强且明显高于正常对照组(P<0.05);Western blot结果显示C.pn感染组Akt的磷酸化表达水平明显上调且高于正常对照组(P<0.05);PI3K特异性抑制剂LY294002可有效抑制C.pn感染诱导的VSMC迁移及Akt的磷酸化。结论 C.pn感染通过激活PI3K/Akt促进VSMC迁移。     

瘦素对大鼠主动脉平滑肌细胞迁移和增殖的影响

目的探讨瘦素对大鼠主动脉平滑肌细胞迁移和增殖的影响,以阐明瘦素在动脉粥样硬化发生发展机制中的作用。方法体外培养大鼠主动脉平滑肌细胞至第4~6代,分别用不同浓度的瘦素(0、20、40、80、100、200μg/L)孵育24 h后:模拟Boyden实验,检测瘦素对平滑肌细胞趋化迁移的影响;MTT法检测瘦素对平滑肌细胞生长的影响;流式细胞仪检测瘦素对平滑肌细胞增殖指数的影响。结果瘦素对平滑肌细胞的生长有促进作用,这种促增殖效应呈剂量依赖性,在瘦素浓度为100μg/L时达最大效应(OD值为0.193±0.010)。瘦素对平滑肌细胞增殖指数的影响与此相同。瘦素有明显的促进平滑肌细胞趋化迁移作用,而且随着瘦素浓度的增加,迁移的细胞数目明显增多。结论瘦素可以促进平滑肌细胞的迁移和增殖,提示瘦素可能有促进动脉粥样硬化的作用。     

泽泻汤对氧化型低密度脂蛋白诱导血管平滑肌细胞增殖的影响

目的观察泽泻汤对血管平滑肌细胞(VSMC)周期蛋白Cyclin D1、Cyclin E、增殖细胞核抗原(PCNA)和p27表达的影响,探讨泽泻汤在氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的VSMC增殖中的作用和机制。方法通过体外50 mg/L ox-LDL诱导VSMC,建立VSMC增殖的动脉粥样硬化细胞模型;应用空白血清及20%泽泻汤含药血清干预。MTS法检测泽泻汤含药血清对VSMC增殖的影响;Western blot检测增殖相关蛋白Cyclin D1、Cyclin E、PCNA和p27表达水平。结果 50 mg/L ox-LDL可明显诱导VSMC增殖。与ox-LDL组比较,泽泻汤含药血清可显著抑制ox-LDL诱导的VSMC增殖,下调细胞Cyclin D1、Cyclin E和PCNA的表达,同时促进p27蛋白表达。结论泽泻汤具有抗VSMC增殖的作用,机制可能与上调p27蛋白和抑制Cyclin D1、Cyclin E、PCNA表达有关。     

纤维蛋白原诱导大鼠主动脉平滑肌细胞增殖及趋化

目的观察不同浓度纤维蛋白原对体外培养的血管平滑肌细胞增殖、趋化和随机迁移的影响,探讨其致动脉粥样硬化的可能作用及其机制。方法采用胶原酶消化法培养大鼠主动脉平滑肌细胞,用BrdU掺入法和细胞计数法观察其增殖能力,刮伤实验及慢速显微摄像技术检测其随机迁移能力,微孔滤膜法观察其趋化性,Western印迹法检测其明胶酶A的表达,明胶酶谱分析其分泌的明胶酶活性。结果细胞计数(r=0.860,P<0.05)和BrdU掺入实验(r=0.880,P<0.05)发现0.2gL～3.2gL纤维蛋白原呈剂量依赖性地促进血管平滑肌细胞增殖,其中0.4、0.8、1.6和3.2gL纤维蛋白原作用48h,细胞计数依次为(6.32±0.39)×107L、(10.63±0.25)×107L、(12.31±0.44)×107L和(13.59±0.43)×107L,BrdU掺入率依次为5.2%±2.2%、17.5%±2.0%、21.5%±2.3%和25.5%±2.5%,与对照组[分别为(5.63±0.34)×107L和2.0%±0.8%]比较差异均有显著性(P<0.01)。微孔滤膜法趋化实验发现0.2gL～3.2gL纤维蛋白原呈剂量依赖性地促进血管平滑肌细胞趋化(r=0.957,P<0.01)。刮伤实验中细胞迁移速度及慢速显微摄像单细胞随机迁移速度在纤维蛋白原组及对照组细胞均无明显差别(P>0.05)。Western印迹及明胶酶谱发现纤维蛋白原促使血管平滑肌细胞明胶酶A的表达及活性上调。结论纤维蛋白原可能通过促进血管平滑肌细胞增殖和趋化在动脉粥样硬化发生过程中起重要作用。     

线粒体融合素2基因突变体对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 研究大鼠线粒体融合素2基因的蛋白激酶A磷酸化位点两种突变体对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响及其相关的信号通路.方法 利用两种携带蛋白激酶A磷酸化位点突变的线粒体融合素2基因重组腺病毒(Adv-Mfn2-alaPKA和Adv-Mfn2-asnPKA)和携带线粒体融合素2基因的重组腺病毒(Adv-Mfn2),感染培养的大鼠血管平滑肌细胞.水溶性四甲基偶氮唑盐法比较各组细胞增殖的变化;流式细胞术比较各组细胞周期的变化;免疫印迹法比较各组线粒体融合素2基因和磷酸化细胞外调节激酶1/2蛋白表达变化.结果 感染重组腺病毒的三组细胞线粒体融合素2基因表达差异无显著性.与对照组相比,Adv-Mfn2-alaPKA和Adv-Mfn2组显著抑制细胞增殖(P<0.01),停滞于G_0/G_1期细胞比例显著增加(P<0.01),磷酸化细胞外调节激酶1/2蛋白表达水平显著降低(P<0.01),且Adv-Mfn2-slaPKA作用更明显(P<0.01),而Adv-Mfn2-asnPKA组较对照组差异无显著性.结论 Mfn2-alaPKA通过细胞外调节激酶1/2信号通路抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖的作用较线粒体融合素2基因更明显;而Mfn2-asnPKA对血管平滑肌细胞无抑制增殖的作用,对细胞外调节激酶1/2信号通路也无作用.蛋白激酶A磷酸化位点是调控线粒体融合素2基因抗血管平滑肌细胞增殖的重要功能位点.     

生物机械力诱导蛋白激酶CβⅡ活化促进血管平滑肌细胞增殖

目的 高血压引起的血管重塑与生物机械力的异常增加有关。为了探讨细胞外生物机械力是如何被细胞感受并被转导为细胞内的生物化学信号、最终导致细胞的病理生理反应。方法 被分离的大鼠主动脉血管平滑肌细胞种植在底部为橡胶薄膜的细胞培养板上进行体外培养，细胞达80％融合后给予生物机械力刺激不同时间（60／min，15％伸张度）。受刺激后的细胞被收集后通过蛋白印迹（Western blot）方法进行蛋白激酶CβⅡ在细胞内转膜和蛋白激酶CβⅡ蛋白磷酸化分析。此外，受刺激后的细胞用氚标胸腺嘧啶核苷酸标记6h并进行同住素计数。结果 平滑肌细胞在静息状态下蛋白激酶CβⅡ在胞浆和胞膜的分布各占50％，受机械力刺激后蛋白激酶CβⅡ在胞浆和胞膜的分布为20％和80％，呈现出了机械力诱导的蛋白激酶CβⅡ明显地由胞浆向胞膜转位。蛋白激酶CβⅡ磷酸化分析显示：平滑肌细胞受机械力刺激后蛋白激酶CβⅡ能快速磷酸化，并呈现明显的时间依赖性。蛋白激酶CβⅡ磷酸化在受机械力刺激后2min时达峰值，随后逐渐减弱，而未受机械力刺激的细胞则没有蛋白激酶CβⅡ磷酸化发生。氚标胸腺嘧啶核苷酸掺入实验结果发现，机械力刺激可明显促进细胞DNA合成增加。结论 生物机械力可快速激活细胞蛋白激酶CβⅡ，导致蛋白激酶CβⅡ在细胞内转住和磷酸化，最终引起血管平滑肌细胞增殖。该研究对于理解高血压及其相关的心脑血管疾病发生的分子机制和提供对该疾病的防治方法将是非常有用的。     

钙激动剂介导血管平滑肌细胞增殖的信号转导途径

为探讨钙调神经磷酸酶依赖的信号通路在雷尼丁刺激的大鼠血管平滑肌细胞增殖中的作用,以培养的大鼠血管平滑肌细胞为模型,用雷尼丁刺激其内贮Ca^2 释放入胞浆,环孢素A阻断钙调神经磷酸酶信号通路,维拉帕米阻断钙通道,检测血管平滑肌细胞钙调神经磷酸酶、丝裂素活化蛋白激酶和蛋白激酶C活性,用^3H-亮氨酸及^3H－胸腺嘧啶掺入量作为反应细胞增殖的指标。结果显示,雷尼丁刺激组蛋白核酸合成速率明显增高,与对照组相比差异显著（P＜0．01）;环孢素A及维拉帕米能明显抑制雷尼丁介导的平滑肌细胞蛋白核酸合成速率增高,与雷尼丁刺激组相比差异显著（P＜0．01）。同时发现雷尼丁刺激组钙神经磷酸酶、蛋白激酶C活性与对照组平滑肌细胞相比差异显著（P＜0．05或0．01）。环孢素A和维拉帕米抑制雷尼丁介导的平滑肌细胞钙调神经磷酸酶活性增高,维拉帕米抑制雷尼丁介导的平滑肌细胞蛋白激酶C活性的增高。提示钙调神经磷酸酶信号通路在雷尼丁刺激的平滑肌细胞增殖中起重要作用,但钙调神经磷酸酶信号通路不是雷尼丁介导平滑肌细胞增殖的唯一信号通路,以丝裂素活化蛋白激酶为核心的信号通路亦参与了雷尼丁刺激的平滑肌细胞增殖。     

香烟尘粒对血管平滑肌细胞增殖的作用

为探讨香烟尘粒对血管平滑肌细胞是否有促增殖作用及其作用机制 ,以兔主动脉平滑肌细胞为实验对象 ,选用细胞存活率 >90 %的小剂量 (1∶10 0 0、2∶10 0 0和 3∶10 0 0 )香烟尘粒 ,分别加入培养基中 ,采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法、流式细胞仪分析、细胞蛋白测定和放射免疫法观察香烟尘粒对血管平滑肌细胞增殖及内皮素 1分泌的影响。结果发现 ,与对照组 (不加香烟尘粒组 )相比 ,1∶10 0 0、2∶10 0 0和 3∶10 0 0香烟尘粒组细胞蛋白吸光度值无明显差异 (P >0 .0 5 ) ;1∶10 0 0和 2∶10 0 0香烟尘粒组血管平滑肌细胞增殖明显 (P <0 .0 1) ;流式细胞仪分析结果显示 ,2∶10 0 0香烟尘粒组G1 期细胞数明显减少 (P <0 .0 5 ) ,S期细胞数显著增多 (P <0 .0 1)。 1∶10 0 0、2∶10 0 0和 3∶10 0 0香烟尘粒组培养基中内皮素 1含量均显著增高 ,尤以 2∶10 0 0组增高最明显 (P <0 .0 1)。结果表明 ,1∶10 0 0和 2∶10 0 0香烟尘粒有促进血管平滑肌细胞增殖的作用 ,其促增殖作用可能与内皮素 1合成释放增多有关     

糖基化终产物对平滑肌细胞增殖及纤溶酶原激活物抑制剂1基因表达的影响

目的探讨糖基化终产物对大鼠平滑肌细胞增殖以及纤溶酶原激活物抑制剂1基因表达的影响。方法体外分离培养大鼠平滑肌细胞,以不同浓度(50、100、200和400mg/L)糖基化终产物作用于平滑肌细胞不同时间(0、4、8、16、24、48、72和96h),MTT法观察糖基化终产物对平滑肌细胞增殖的影响,逆转录聚合酶链反应测定纤溶酶原激活物抑制剂1基因的表达。结果不同浓度的糖基化终产物作用8h均对平滑肌细胞增殖无影响,以后各时间点不同浓度的糖基化终产物均导致平滑肌细胞增殖,与对照组比较差异有显著性(P<0.05)。糖基化终产物作用不同时间均可使平滑肌细胞表达纤溶酶原激活物抑制剂1基因水平升高,且随着浓度升高而增加(分别为0.85±0.05、0.97±0.05、1.08±0.12和1.41±0.05),与对照组(0.80±0.03)比较差异有显著性(P<0.05)。结论糖基化终产物诱导血管平滑肌细胞增殖并增加纤溶酶原激活物抑制剂1基因表达是糖尿病患者易患动脉粥样硬化的可能原因。