伤寒杆菌耐药质粒pRST98与细菌在巨噬细胞内存活关系的研究

目的 研究伤寒杆菌的不相容性Ｃ群接合性耐药质粒ｐＲＳＴ９８对其宿主菌在巨噬细胞内存活的影响。方法 用标准系列稀释法检测３株同源染色体伤寒杆菌－含ｐＲＳＴ９８的野生型伤寒菌株ＳＴｐＲＳＴ９８、经ＳＤＳ人工消除ｐＲＳＴ９８的突变体菌株ＳＴ（Ｒ＾－）及ｐＲＳＴ９８重新导入突变体的接合子ｐＲＳＴ９８／ＳＴ（Ｒ＾－），研究它们在ＢＡＬＢ／ｃ小鼠腹腔巨噬细胞ＭΦＪ７７４Ａ．１同的存活情况。结果 巨噬细胞吞噬后     

伤寒杆菌耐药质粒pRST98与细菌外膜泡的关系

目的：研究伤寒杆菌耐药质粒pRST98与细胞外膜泡（OMV）形成的关系。方法：将（1）携带pRST98的野生型耐药性伤寒杆菌－－ST1及ST2；（2）不含pRST98的野生型敏感伤寒杆菌－－ST3及ST4；（3）不含质粒的大肠杆菌－－E.coliK12W1485;(4)用十二烷基硫酸钠消除pRST8的突变体菌株－－ST1（R^-)及ST2（R^-)；和（5）经接合转移将pRST98导入敏感型伤寒杆菌及大肠杆菌的接合子－－pRST98/ST3、pRST98/ST4及pRST98的耐药伤寒杆菌消除pRST98前后，不含pRST98的的敏感伤寒杆菌和大鼠肝菌在导入该质粒前后，细菌形成OMV的数量和形态均无明显变化。结论：伤寒杆菌耐药质粒pRST98在体外与细菌外膜泡的形成未发现有明显关系。     

伤寒杆菌耐药质粒pRST98介导血清杀菌作用抗性的研究

将ｐＲＳＴ９８导入不含质粒且对抗菌药物敏感的大肠杆菌、伤寒杆菌，并用十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ）清除耐药菌株的ｐＲＳＴ９８，计算接合子及Ｒ质粒消除前后菌株在人、兔及豚鼠的不同浓度、不同成份血清中的存活率。ｐＲＳＴ９８介导其宿主苏对血清杀苏的抗性，但在不同宿注菌中抵抗力不同；补体经典途径主路途径均参与血清杀菌过程。ｐＲＳＴ９８具有多效性，其广泛的宿主性在介导细菌多重耐药的同时，还赋予细菌抵抗血清的杀菌作     

伤寒杆菌耐药质粒pRST98毒力基因spv的序列测定

目的 对伤寒杆菌多重耐药质粒pRST98的毒力基因spv进行克隆及核酸序列测定。方法 为区分毒力基因存在于细菌染色体还是位于耐药质粒pRST98，先分离提取耐药质粒pRST98，再以该质粒为模板，将自行设计的引物经多聚酶链式反应(PCR)扩增目的基因，装入克隆载体pGEM-T EASY进行核酸序列测定。结果 PCR反应得到spv，基因的spvR和spvB片段，其ORF大小分别为894bp和1776bp，核酸序列测定后进行生物信息学分析。结论 伤寒杆菌多重耐药质粒pRST98除编码细菌抗药性外，还具有与细菌毒力相关的基因，该质粒是一种具有双重功能的“嵌合型”质粒。     

伤寒杆菌耐药质粒pRST98介导血清杀菌作用抗性的研究

将pR     

细菌接合性耐药质粒与毒力关系的研究

目的　研究伤寒菌接合性耐药质粒ｐＲＳＴ９８ 与宿主菌毒力的关系。方法　用伤寒菌同源染色体的含ｐＲＳＴ９８ 野生株、消除ｐＲＳＴ９８ 菌株及ｐＲＳＴ９８ 重新导入消除菌株后,检测它们在人、兔及豚鼠血清中抵抗力的改变。将ｐＲＳＴ９８ 导入不含质粒的鼠伤寒无毒株ＲＩＡ,比较接合子ｐＲＳＴ９８／ＲＩＡ 与含一毒力质粒的鼠伤寒毒株ＳＲ－ １１ 及ＲＩＡ在体外对Ｈｅｐ－ ２ 、ＣＨＯ 和ＨｅＬａ 细胞的粘附、侵袭能力;经口感染小鼠观察３ 种菌在体内播散、繁殖及引起所在脏器的病理改变,并经腹腔感染测定对小鼠的半数致死量。结果　携带ｐＲＳＴ９８ 的菌株在血清中的抵抗力显著高于无此质粒菌株（ Ｐ＜ ０ ．０５）;ｐＲＳＴ９８ 在体外不影响宿主菌对上述３ 种细胞的粘附、侵袭力,但能使携带该质粒的ｐＲＳＴ９８／ＲＩＡ在小鼠肠系膜淋巴结、脾和肝脏的活菌数显著增加（ Ｐ＜ ０．０５） ,并引起相应的病理变化;腹腔注射小鼠ＬＤ５０ 比ＲＩＡ降低１０００ 倍（Ｐ＜ ０．０１） 。结论　伤寒菌耐药质粒ｐＲＳＴ９８ 具有多效性,不但能编码对药物的抗性,同时还能使宿主菌的毒力增强。     

伤寒杆菌耐药质粒pR_(ST98)介导血清杀菌作用抗性的研究

将ｐ Ｒ Ｓ Ｔ９８ 导入不含质粒且对抗菌药物敏感的大肠杆菌、伤寒杆菌,并用十二烷基硫酸钠（ Ｓ Ｄ Ｓ） 消除耐药菌株的ｐ Ｒ Ｓ Ｔ９８ ,计算接合子及 Ｒ 质粒消除前后菌株在人、兔及豚鼠的不同浓度、不同成份血清中的存活率。ｐ Ｒ Ｓ Ｔ９８ 介导其宿主菌对血清杀菌的抗性,但在不同宿主菌中抵抗力不同;补体经典途径及旁路途径均参与血清杀菌过程。ｐ Ｒ Ｓ Ｔ９ ８ 具有多效性,其广泛的宿主性在介导细菌多重耐药的同时,还赋予细菌抵抗血清的杀菌作用,使病原菌致病性增强。     

细菌接合性耐药质粒与毒力关系的研究

目的 研究伤寒菌接合性耐药质粒ｐＲＳＴ９８与宿主菌毒力的关系。方法 用伤寒菌同源染色体的含 ｐＲＳＴ９８野生株、消除ｐＲＳＴ９８菌株及ｐＲＳＴ９８重新导入消除菌株后，检测它们在人、兔及豚鼠血清中抵抗力的改变。将ＰＲＳＴ９８导入不含质粒的鼠伤寒无毒株ＲＩＡ，比较接合了ｐＲＳＴ９８／ＲＩＡ与含一毒力质粒的鼠伤寒毒株ＳＲ－１１及ＲＩＡ在体外对Ｈｅｐ－２、ＣＨＯ和ＨｅＬａ细胞的粘附、侵袭能力；经口感染小鼠     

药物在体外消除肠道杆菌携带的耐药质粒pRsT98的研究

目的 探讨用中西药在体外消除肠道杆菌携带的耐药质粒pRST98的可能性。方法 将原存在于伤寒杆菌中的耐药质粒pRST98经接合转移分别导入大肠杆菌和鼠伤寒杆菌，选用双黄连和氧氟沙星对上述3种细菌进行亚抑菌浓度的消除试验，并对实验前后的受试菌分别进行K－B纸片扩散法和最小抑菌浓度法（MIC）药敏试验及质粒电泳检测。结果 两种药物在体外未能将受式菌携带的pRST98消除；但该质粒编码的耐药标志减少；部分菌株对原有药物的耐药程度明显下降。结论 双黄连和氧氟沙星能降低pRST98宿主菌的耐药性，但药物作用后同一质粒在不同宿主菌中耐药性变化的差异，显示该质粒表达的多样性和复杂性。     

伤寒沙门菌质粒pR_(ST98)与巨噬细胞凋亡的关系

目的研究伤寒沙门菌质粒pRST98与小鼠巨噬细胞J774A.1凋亡之间的关系。方法用3株鼠伤寒沙门菌——标准毒株SR-11、低毒株RIA和将pRST98经接合转移导入RIA的接合子pRST98/RIA在体外分别与小鼠巨噬细胞J774A.1共培养,于0、2、4、6、12和24h用JC-1染色法和流式细胞术检测pRST98对J774A.1线粒体膜电位的影响;用AnnexinV-FITC试剂盒和TUNEL法检测J774A.1的凋亡情况;台盼蓝染色法和系列稀释法分别用于活细胞和胞内活菌计数。结果从感染后2h起,SR-11组、pRST98/RIA组和RIA组J774A.1线粒体膜电位下降的百分率依次降低,随着感染的时间延长,J774A.1通过线粒体途径而导致的细胞凋亡率呈上升趋势;各感染组J774A.1的凋亡率表现为SR-11组〉pRST98/RIA组〉RIA组,差异均有统计学意义（P〈0.05或〈0.01）;各时间段J774A.1的活细胞数和细胞内活菌计数均呈现SR-11组%@ 1673-0399     

伤寒沙门菌质粒pRST98的限制性核酸内切酶分析

目的 以我国特有的多重耐药伤寒沙门菌中分离的质粒pRST98为研究对象，对其除编码细菌抗药性外还能使宿主毒力增强这一独特性状产生的分子基础，用限制性核酸内切酶进行核酸酶谱分析。方法 将质粒pRST98用QIAGEN试剂盒提纯并精确害量后，选用常用9种限制性核酸内切酶消化，制作该质粒的酶切图谱。结果 用试剂盒提纯质粒，再用限制性内酶消化后得到了清晰，准确的质粒酶切图谱，其中BglⅡ，EcoRⅤ,PstⅠ和SacⅡ是对该质粒进行分子生物学和分子流行病学研究的理想工具。结论 伤寒沙门菌多效性质粒pRST98限制性核酸内切酶谱的建立，为分析该质粒的遗传特征，流行病学追踪和基因功能定位奠定了基础。     

伤寒和甲、乙、丙型副伤寒沙门菌多重PCR及荧光PCR分型方法的建立与评价

目的建立伤寒和甲、乙、丙型副伤寒沙门菌的快速和特异的检测方法,用于沙门菌属内的分型鉴定。方法根据GenBank公布的伤寒和甲、乙、丙型副伤寒沙门菌的保守序列设计引物和改良分子信标探针,建立多重PCR检测方法和实时荧光PCR检测方法。结果采用所建立的多重PCR方法可分别检测到伤寒的3条特异性条带、甲型副伤寒沙门菌的2条特异性条带和丙型副伤寒沙门菌的1条特异性条带,但是乙型副伤寒沙门菌未出现特异性条带。建立的实时荧光PCR方法可以快速、特异、灵敏地检测出伤寒和甲、乙、丙型副伤寒沙门菌,纯DNA和菌液的最低检出限分别可达10 fg/reaction和20 CFU/reaction;对77株细菌的检测正确率达100%。结论建立的实时荧光PCR检测方法比多重PCR方法更能快速、特异、灵敏地检测伤寒和甲、乙、丙型副伤寒沙门菌。     

腹腔巨噬细胞的获取、提纯及体外培养的研究

用昆明种小鼠按Wasley's法快速获取腹腔巨噬细胞。以贴壁法提纯(9～12℃),体外培养的细胞呈单层生长,可存活2～3周。对提纯的细胞用形态学、细胞化学、吞噬及抗胰蛋白酶消化试验等法鉴定。结果:体外培养的细胞具有巨噬细胞的典型特征,属高纯度的巨噬细胞,纯度达97%以上。使用高纯度的细胞必将提高实验研究的质量。