Avastin联合抗原致敏的DC-CTL细胞体外抑制口腔鳞癌细胞生长的实验研究

目的:研究贝伐单抗(Bevacizumab,Avastin)与口腔鳞癌抗原致敏的树突状细胞(Dendritic Cell,DC)诱导的细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic t Lymphocyte,CTL)联合应用,体外研究其对口腔鳞癌细胞生长的抑制作用。方法:CAL27、SCC4肿瘤细胞系的培养,检测VEGF分泌水平;培养人外周血单核细胞来源的树突状细胞(DC);冻融法制备SCC4口腔鳞癌细胞可溶性抗原并致敏DC,检测DC表面标志物变化,刺激同种异体T细胞增殖的能力及IL-12分泌水平;将同源人T淋巴细胞与之共同培养诱导出抗原特异性的CTL细胞,Avastin联合CTL对SCC4细胞进行体外杀伤实验。结果:SCC4较CAL27分泌更高水平的VEGF;经肿瘤抗原致敏后的DC,其表面标志CD83、CD80、CD86、CD40及功能相关分子IL-12表达上调,CD1a的表达下调,可显著刺激异体T淋巴细胞增殖,具有统计学差异;Avastin联合CTL对SCC4的杀伤率达56.1%,显著高于对照组(P<0.05)。结论:Avastin联合DC致敏的CTL能显著抑制口腔癌细胞的生长。     

口腔鳞状细胞癌血管内皮生长因子与树突状细胞的相关性

目的 探讨口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)对外周血树突状细胞(dendritic cell,DC)的分化发育及功能的影响.方法 OSCC组81例及对照组24例行流式细胞仪检测外周血DC含量,ELISA法检测血清VEGF质量浓度,免疫组化法检测其中57例OSCC癌组织中VEGF的表达,观察血清与原发灶VEGF的相关性以及与DC的关系.通过体外实验,将CD-14外周血单核细胞(periphend blood mononuclear cell,PBMC)诱导为DC过程中加入VEGF165,观察其对DC分化成熟及功能的影响.结果 与对照组[(325.70±117.54)ng/L]相比,OSCC患者血清VEGF质量浓度[(764.33±263.64)ng/L]显著升高(P<0.01),而DC/PBMC比值和DC计数显著降低(P<0.01).且外周血DC与血清VEGF质量浓度呈负相关(P<0.01).OSCC组织中VEGF的表达与血清VEGF呈正相关(P<0.01),与外周血DC含量呈负相关(P<0.01).体外研究则显示VEGF165使DC表面分子CD-1a、CD-40、CD-80、CD-86、CD-83及人类白细胞抗原(human leucocyte antige,HLA)-DR的表达较对照组显著降低(P<0.05),刺激T细胞增殖能力下降,而吞噬能力增强(P<0.05).结论 OSCC过量分泌的VEGF可能是抑制DC分化发育及成熟的重要原因之一.     

基于NF-κB信号通路探究SIRT7基因对口腔癌细胞株自噬蛋白及巨噬细胞极化的作用机制

目的:基于NF-κB信号通路探究SIRT7基因对口腔癌细胞株自噬蛋白及巨噬细胞极化的作用机制。方法:人口腔鳞状细胞癌细胞株SCC25细胞分为SCC25组(无干预的SCC25细胞)、阴性对照组(SCC25细胞转染空载体pLKO.1-vector-GFP)、SIRT7 shRNA组(SCC25细胞转染SIRT7 shRNA)、SIRT7组(SCC25细胞转染SIRT7慢病毒),联合A组(SCC25细胞+50μmol/L NF-κB抑制剂PDTC+SIRT7 shRNA)及联合B组(SCC25细胞+50μmol/L NF-κB抑制剂PDTC+SIRT7慢病毒),qRT-PCR检测SIRT7相对表达;Transwell法检测侵袭数目;划痕实验检测划痕愈合率;免疫荧光检测P62、LC3-Ⅱ表达,免疫印迹分别检测M1和M2标志蛋白及NF-κB、NF-κB p65蛋白水平。结果:SCC25组及阴性对照组SCC25细胞的侵袭数目、划痕愈合率、P62、LC3-Ⅱ、CD163、CD11C、NF-κB及NF-κB p65表达比较差异无统计学意义(P>0.05);与阴性对照组相比,SIRT7 shRNA...     

舌癌Tca-83细胞培养上清对树突状细胞表型及生成的影响

目的:探讨Tca-83肿瘤细胞培养上清对树突状细胞(dendritic cell,DC)表型及生成的影响。方法:培养健康志愿者外周血单个核细胞源DC,加入细胞因子和Tca-83细胞培养上清作为实验组,培养7d,以正常培养体系为对照组。倒置显微镜及扫描电镜观察细胞的形态,流式细胞仪分析细胞的表型。结果:Tca-83细胞培养上清作为条件培养的DC,细胞形态不典型,数量明显减少。低表达CD80,CD83,HLA-DR等表面分子,与正常培养组相比显著降低(P<0.001)。结论:Tca-83肿瘤细胞培养上清中的某些因子抑制DC表面的分子表达,对DC的分化和成熟有明显的抑制作用。     

外周血DC-CIK对人舌鳞癌细胞系Tca8113的抑瘤作用

目的:探讨体外致敏成熟树突状细胞(DC)与细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)共培养细胞群对人舌鳞癌细胞系Tca8113移植瘤裸鼠的体内抑瘤效果.方法:人舌鳞癌外周血分离培养DC,体外诱导培养CIK细胞,将致敏成熟的DC与CIK体外扩增获得共培养细胞群DC-CIK细胞;于裸鼠单侧腋下接种Tca8113,将实验动物分为对照组A、实验组B和实验组C;接种后24h,A组移植瘤区注射生理盐水,B组于对侧腋下注射DC-CIK,C组同侧腋下注射DC-CIK,饲养4周；观察移植瘤的成瘤时间、成瘤率、生长曲线及组织学观察,采用SAS 6.12软件包对数据进行t检验、方差分析和x2检验.结果:A组平均成瘤时间为7.63d,B组为9.5d,C组为12d,A、C组有显著差异(P=-0.0132);注射后2周,A组成瘤率为100％,B组为87.5％,C组为62.5％,P＞O.05;观察期内,从移植瘤生长曲线观察,A组瘤体增长最快,B组其次,C组最慢,A、B组无显著差异(P＞0.05),A、C组差异显著(P=0.036).结论:致敏DC-CIK共培养细胞对Tca8113移植瘤裸鼠有一定的体内抑瘤效应.     

TNF-α刺激下人牙周膜干细胞对CD3+T细胞功能的影响

目的:研究在TNF-α刺激下牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)对CD3+T细胞功能的影响.方法:分别获取20-30岁患者的健康离体牙8例,分离培养获得PDLSCs;采用免疫磁珠法分离获取20-30岁健康患者的CD3+T细胞;PDLSCs与CD3+T细胞共培养,PDLSCs加炎症因子(TNFα 10ng/mL)与CD3+T细胞共培养,PDLSCs与CD3+T细胞比例分别为1∶10、1∶20、1∶50、1∶100,共培养时间为48h;共培养48h后分别提取不同组的RNA并反转录为cDNA,检测凋亡、炎症及增殖相关基因的变化.结果:两组细胞生长状态良好;随共培养组PDLSCs比例的降低,正常共培养组CD3+T细胞caspase3/8、IL-6,TNFα mRNA表达水平均降低,在1∶50时趋于稳定;随共培养组PDLSCs比例的降低,炎症因子共培养组CD3+T细胞caspase3/8、IL-6、TNFα mRNA表达水平均降低,在1∶20时趋于稳定.当PDLSCs与CD3+T细胞比例分别为1∶20时H-PDLSCs(Healthy-Periodontal ligament stem cells)、I-PDLSCs(Inflammatory-Periodontal ligament stem cells)对CD3+T细胞CCND-1基因有显著抑制作用,H-PDLSCs对CD3+T细胞CCND-1的抑制作用最显著.结论:在恰当的比例时,正常及炎症PDLSCs对CD3+T细胞的凋亡及炎症因子分泌均有抑制作用,在PDLSCs与CD3+T细胞比例1∶20时,可能是由于炎症因子的存在增强了其抑制作用.     

TNF-α刺激下人牙周膜干细胞对CD3+T细胞功能的影响

目的:研究在TNF-α刺激下牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)对CD3+T细胞功能的影响.方法:分别获取20-30岁患者的健康离体牙8例,分离培养获得PDLSCs;采用免疫磁珠法分离获取20-30岁健康患者的CD3+T细胞;PDLSCs与CD3+T细胞共培养,PDLSCs加炎症因子(TNFα 10ng/mL)与CD3+T细胞共培养,PDLSCs与CD3+T细胞比例分别为1∶10、1∶20、1∶50、1∶100,共培养时间为48h;共培养48h后分别提取不同组的RNA并反转录为cDNA,检测凋亡、炎症及增殖相关基因的变化.结果:两组细胞生长状态良好;随共培养组PDLSCs比例的降低,正常共培养组CD3+T细胞caspase3/8、IL-6,TNFα mRNA表达水平均降低,在1∶50时趋于稳定;随共培养组PDLSCs比例的降低,炎症因子共培养组CD3+T细胞caspase3/8、IL-6、TNFα mRNA表达水平均降低,在1∶20时趋于稳定.当PDLSCs与CD3+T细胞比例分别为1∶20时H-PDLSCs(Healthy-Periodontal ligament stem cells)、I-PDLSCs(Inflammatory-Periodontal ligament stem cells)对CD3+T细胞CCND-1基因有显著抑制作用,H-PDLSCs对CD3+T细胞CCND-1的抑制作用最显著.结论:在恰当的比例时,正常及炎症PDLSCs对CD3+T细胞的凋亡及炎症因子分泌均有抑制作用,在PDLSCs与CD3+T细胞比例1∶20时,可能是由于炎症因子的存在增强了其抑制作用.     

阿司匹林对兔颊VX-2鳞状细胞癌炎症微环境中树突细胞的影响

目的探索阿司匹林及炎症对兔颊VX-2鳞状细胞癌上清液中树突细胞（DC）成熟及功能的影响。方法通过瘤粒植入术及机械创伤+高糖饮食的方法,建立兔颊VX-2鳞状细胞癌及其炎症模型,将模型兔分为3组。实验组：制造颊癌及炎症后使用阿司匹林灌胃治疗3 d;对照组：制造颊癌及炎症后以生理盐水灌胃作为对照;空白组：不制造炎症的单纯肿瘤兔组。3 d后收集各组肿瘤标本,制成匀浆,取上清液与正常兔外周血单核细胞共培养以使其向DC分化,采用流式细胞仪检测DC表面分子CD83、CD86、人类白细胞DR抗原（HLA-DR）的表达,混合淋巴细胞反应检测DC刺激T细胞增殖的能力。结果实验组和对照组中CD83、CD86、HLA-DR阳性率均低于空白组（P<0.05）,而实验组和对照组间的差异无统计学意义（P>0.05）;同样,实验组和对照组刺激T细胞增殖的能力弱于空白组（P<0.05）,而两组间刺激T细胞增殖的能力无明显差异（P>0.05）。结论炎症可抑制DC表面分子CD83、CD86、HLA-DR的表达和功能发挥,短期、小剂量服用阿司匹林对兔颊VX-2鳞状细胞癌炎症微环境中DC的表型改善和功能发挥无明显作用。     

舌癌exosomes诱导CTL细胞体外抗瘤效应的观察

目的：研究舌癌exosomes诱导CTL体外抗肿瘤效应。方法：通过连续离心及超滤法从Tca8113细胞培养上清中分离、纯化出exosomes,然后与树突状细胞（DC）共培养,诱导T淋巴细胞活化为CTL。通过乳酸脱氢酶法测定特异性CTL对Tca8113的杀伤效应。采用SPSS11.0软件包对数据进行t检验。结果：exosomes可促使DC成熟。杀伤实验表明：负载exosomes的DC诱导CTL对Tca8113细胞的杀伤率显著高于未用exosomes负载的DC诱导的CTL及加IL-2培养的T细胞,其差异有显著性（P〈0.01）。结论：Tca8113细胞来源的exosomes负载DC后,可以诱导T细胞成为抗原特异性CTL,具有特异性杀伤肿瘤细胞的功能。     

树突状细胞体外诱导淋巴细胞抑制舌癌细胞生长的实验研究

目的 :探讨树突状细胞 (dendriticcell,DC)通过淋巴细胞介导的免疫反应对舌癌细胞生长的影响。方法 :外周血单核细胞 ,在GM CSF IL 4的诱导下体外培养。其中一组加入TNF α ,另一组不加TNF α ;以不加任何细胞因子作为对照。用Tca8113细胞冻融抗原冲击后 ,加入自体淋巴细胞一起培养。再按 10 0∶1效靶比与Tca8113共培养 ,设未致敏淋巴细胞 Tca8113组 ,单独Tca8113组作对照。行形态学观察 ,免疫细胞化学检测DC的CD1a、CD83、HLA DR表达状况 ,MTT法检测Tca8113的存活率。结果进行统计学分析。结果 :( 1)加入TNF α组更高表达CD83 ,不加入TNF α组经肿瘤抗原刺激后 ,CD83表达急剧增加。 ( 2 )DC激活的淋巴细胞可显著抑制舌癌细胞的生长。结论 :GM CSF IL 4诱导的单核细胞来源的DC ,能体外摄取肿瘤抗原而进一步成熟 ,通过激活淋巴细胞抑制舌癌细胞生长 ;TNF α能促DC成熟 ,诱发更强的抑制作用。     

程序性死亡分子1及其配体在口腔鳞状细胞癌患者外周血中的表达及临床意义

目的 检测口腔鳞状细胞癌患者外周血中程序性死亡分子1（PD-1）及其配体（PD-L1）的表达水平,探讨其生物学及临床意义。方法 选取82例口腔鳞状细胞癌患者（口腔鳞癌组）和25例健康对照者（对照组）为研究对象,收集研究对象的外周血,采用流式细胞术检测外周血T淋巴细胞表面PD-1、PD-L1的表达及T淋巴细胞亚群计数,采用酶联免疫吸附方法检测血清中可溶性PD-1（sPD-1）和可溶性PD-L1（sPD-L1）的表达水平。采用SPSS 17.0软件对数据进行检验和相关性分析。结果 口腔鳞癌组外周血CD8+ T淋巴细胞百分数明显高于对照组（P<0.05）,而CD3+、CD4+T淋巴细胞百分数及CD4+/CD8+T亚群百分数比值均低于对照组（P<0.05）。口腔鳞癌组外周血CD4+、CD8+ T淋巴细胞表面PD-1、PD-L1的阳性表达率均高于对照组（P<0.01）。口腔鳞癌组血清sPD-L1水平高于对照组（P<0.05）,而sPD-1水平二者差异无统计学意义（P>0.05）。sPD-L1的表达与临床分期、肿瘤分化程度及淋巴结转移状态相关（P<0.05）,与性别、年龄、肿瘤部位及大小无关。结论 口腔鳞状细胞癌患者外周血T淋巴细胞亚群存在不同程度的免疫功能抑制,CD4+和CD8+ T淋巴细胞表面PD-1及PD-L1表达显著升高。异常升高的sPD-L1可能与口腔鳞状细胞癌的发生发展有关。     

腺样囊性癌细胞凋亡抗原负载的树突状细胞诱导抗肿瘤效应的体外研究

目的 探讨负载腮腺腺样囊性癌细胞凋亡肿瘤抗原的树突状细胞,诱导淋巴细胞介导的免疫反应,观察其体外杀伤腺样囊性癌细胞的细胞毒性效应.方法 外周血单核细胞,在粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor GM-CSF) 白细胞介素-4(Interleukin-4 IL-4)的诱导下体外培养,用凋亡肿瘤细胞抗原冲击后,流式细胞仪检测树突状细胞抗原负载前后CD1a、CD83表达量的变化.采用MTT比色法检测同种混合淋巴细胞反应和诱导细胞毒性T细胞(Cytotoxic T lymphocyte CTL)反应.结果 凋亡肿瘤抗原刺激后,CD83 表达急剧增加(P＜0. 01),而CD1a表达量下调(P＜0.01).负荷凋亡肿瘤抗原树突状细胞体外诱导出明显的细胞毒性反应,并刺激同种T淋巴细胞增殖.结论 GM-CSF IL-4 诱导的单核细胞来源的树突状细胞 ,能在体外摄取凋亡肿瘤抗原而进一步成熟,通过激活淋巴细胞杀伤癌细胞.     

唇癌微血管密度和血管内皮生长因子表达的意义

目的　研究唇鳞状细胞癌组织中微血管密度 (MVD)和血管内皮生长因子 (VEGF)的表达和意义。方法　采用CD34和VEGF单克隆抗体 ,用免疫组化S P法对 4 2例唇鳞状细胞癌标本进行免疫组化染色。结果　唇癌组织MVD显著高于正常对照唇组织MVD(P <0 .0 0 1)。有淋巴结转移唇癌的MVD高于无淋巴结转移的MVD ,但两者之间无显著性差异 (P >0 .0 5 )。唇癌组织和正常组织中VEGF表达阳性率分别为 6 1.90 %和 10 .0 0 % ,两者间有显著性差异 (P <0 .0 0 1)。有淋巴结转移组VEGF阳性率 (80 .0 0 % )高于无淋巴结转移组VEGF阳性率 (5 6 .2 5 % ) ,但两者间无显著性差异 (P >0 .2 5 )。VEGF阳性表达唇癌的MVD高于VEGF阴性表达唇癌的MVD ,两者间有显著性差异 (P <0 .0 2 )。结论　唇癌中VEGF的表达与MVD有密切的联系 ,说明VEGF能较好地反映唇癌微血管生成的活跃程度 ,是一个重要促血管生成因子     

Porphyromonas gingivalis fimbriae induce unique dendritic cell subsets via Toll-like receptor 2

Backgound and Objective:  Dendritic cells (DCs) play a critical role in the activation of T cells as well as in shaping immune responses. We have reported previously that Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharides ( Pg LPS) induced a CD14⁺CD16⁺ DC subset with a weak immuno-stimulatory activity. In contrast, Escherichia coli LPS ( Ec LPS) induced fully matured DCs with strong immunostimulatory activities. Since Pg LPS as well as Pg fimbriae have been indicated to work as Toll-like receptor (TLR) 2 ligands, we speculate that the TLR usage of bacterial antigens may be critical for DC maturation.
Material and Methods:  We investigated the effect of Pg fimbriae on the phenotype and function of human peripheral blood DCs in comparison with a TLR2 ligand, peptidoglycan, and a TLR4 ligand, Ec LPS.
Results:  Flow cytometry revealed that Pg fimbriae and peptidoglycan but not Ec LPS induced CD14 and CD16 expression on peripheral blood DCs (CD14⁻CD16⁻). A monoclonal antibody against TLR2 abrogated this induction, but an antibody against TLR4 had no effect. Dendritic cells stimulated with Pg fimbriae had a weaker capability to induce allogenic T cell proliferation and exhibited a weaker production of interleukin-8 and regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted (RANTES) than DCs stimulated with Ec LPS.
Conclusion:  These results indicate that different TLR usage affects mature DC phenotype and function and is thus crucial to the regulation of immunity to the pathogen.     

口腔鳞癌引流区淋巴结中树突状细胞特征性表型的免疫组化分析

目的:探讨OSCC的DLN中DC的功能状态。方法:免疫组化标记OSCC的DLN和扁桃体组织中DC的CD1 a,CD83分子。统计CD1 a DC和CD83 DC的浸润程度,以及CD83 DC/CD1 a DC的比值。结果:CD1 a DC在OSCC的DLN中的浸润程度显著高于扁桃体组织(P<0.01),在鳞癌转移的淋巴结中显著低于未转移的淋巴结(P<0.01)。CD83 DC浸润程度在OSCC的DLN中明显低于扁桃体(P<0.01),但鳞癌转移的淋巴结与未转移者无显著差异(P>0.05)。OSCC的DLN中CD83 DC/CD1 a DC的比值显著低于扁桃体组织(P<0.05)。结论:OS-CC的DLN中,DC以不成熟DC为主,难以实现其激活T淋巴细胞反应的能力。     

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目的    研究不同年龄阶段口腔癌患者外周血单核细胞来源的树突状细胞（dendritic cell,DC）的形态、表型差异并分析其临床意义。方法    将2007—2010年兰州大学第一医院及第二医院口腔科住院的口腔鳞癌初诊患者30例,分为40～50岁及≥60岁2组,每组各15例。取患者外周血单核细胞经重组人粒细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、重组人白细胞介素4（rhIL-4）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导培养,获取成熟树突状细胞,光镜观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞表面协同刺激分子CD1a、CD83、CD80、CD86的表达。结果    培养7d后,2组均诱导出典型形态和表型的树突状细胞,其中≥60岁组DC培养过程中细胞逐渐死亡,培养至第7天大部分细胞死亡,获得的DC数量较少,有3例未能培养出DC;而40～50岁组培养细胞的活力保持较好,至第7天均可获得数量较多的DC。结论    2组口腔鳞癌患者外周血单核细胞来源的DC经细胞因子诱导培养,均能扩增出成熟DC,但较40～50岁组,≥60岁组外周血培养的DC体外生长活力明显降低,可能与老年患者免疫功能明显降低有关。     

B7-1、B7-2在牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导的T淋巴细胞反应中的作用

目的：研究B7?1、B7?2分子对牙龈卟啉单胞菌（ Porphyromonas gingivalis,P． g）脂多糖诱导的T淋巴细胞反应的影响。方法：分别从基因敲除小鼠（ B7?1 KO组、B7?2 KO组、B7?1／2 KO组）和野生小鼠（ WT组）骨髓培养获得原代树突状细胞（ dendritic cell,DCs）并经P． g脂多糖刺激后,与T细胞混合培养。 CCK8试剂盒评价T细胞增殖,ELISA检测培养液中IFN?γ、IL?4及IL?17的水平,荧光定量PCR检测T细胞IFN?γ、IL?4、IL?17、GATA?3、T?bet及RORγt的转录水平。结果：CCK8检测显示各组T细胞增殖水平无差异。 ELISA及荧光定量PCR显示与WT组比较,B7?1 KO组IFN?γ降低,IL?4升高,IL?17无变化,T?bet降低,GATA?3升高,RORγt无变化;B7?2 KO组IFN?γ升高,IL?4降低,IL?17降低,T?bet升高,GATA?3降低,RORγt降低;B7?1／2 KO组各因子变化趋势介于B7?1 KO组和B7?2 KO组之间。结论：B7?1及B7?2分子对P． g脂多糖刺激的T细胞增殖无明显影响。但B7?1分子可促进T细胞向Th1型分化,抑制Th2型分化,与Th17型分化相关性不大;而B7?2分子抑制T细胞向Th1型分化,促进Th2型及Th17型分化。     

Antigen-presenting cells in human immunosuppressive drug-induced gingival enlargement

An immunoperoxidase technique was used to compare the number of CD1a+ and factor XIIIa+ dendritic cells (DCs), and CD68+ Macrophages (M) in 30 gingival samples from subjects with clinically healthy periodontitium (HP) and 10 samples from subjects with drug-induced gingival enlargement (DIGE). Fewer CD1a+ and factor XIIIa+ DCs were found in areas with inflammatory infiltration (II) of the lamina propria (LP) in the group with immunosuppressed DIGE (IDIGE) compared to the group with HP. In the sulcular and junctional/pocket epithelia, the number of CD1a+ DCs was decreased in the group with IDIGE ( p < 0.05). There was a tendency toward a reduced number of CD1a+ DCs and CD68+ M in areas without inflammatory infiltrate of the LP in the group with IDIGE. The alterations in the number of antigen-presenting cells (APCs) may be the reason for the decreased periodontal inflammation and breakdown clinically observed in subjects who are immunosuppressed.     

A possible CD1a Langerhans cell–mast cell interaction in chronic hyperplastic candidosis

AIMS: T lymphocyte-antigen-presenting cell (APC) interaction plays a central role in T lymphocyte activation and APC maturation. We therefore studied the CD1a-positive Langerhans cells with respect to receptor activator of nuclear factor kappa B ligand (RANKL)-positive cells in chronic hyperplastic candidosis (CHC). MATERIALS AND METHODS: Tissue sections of CHC were compared with leukoplakia and healthy oral mucosa using RANKL and CD1a monoclonal antibodies in an avidin-biotin peroxidase complex protocol. Two different antigen-retrieval protocols, pepsin preincubation and Tris-EDTA heat treatment, were used. RESULTS: CD1a-positive Langerhans cells were in healthy and leukoplakia epithelium found in the middle layer, but in CHC in all layers of the epithelium, at the basement membrane and as mononuclear round cells in the lamina propria. Use of pepsin digestion enabled studies of mast cells and their activation in the form of degranulation of RANKL. CONCLUSIONS: The numerical, morphological and topographical versatility of the CD1a-positive Langerhans cells in CHC can be clarified by dendritic cell (DC) recruitment into the epithelium. RANK-positive and RANKL-sensitive DCs have ample opportunity to interact with local T lymphocytes. Use of an optimized antigen-retrieval protocol enabled demonstration of an active engagement (degranulation) of mast cells, which represent a rapidly available source of soluble RANKL.