莱菔硫烷对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的:探讨莱菔硫烷(sulforaphane,SFN)对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。方法:H9C2心肌细胞随机分为3组:正常对照组、缺氧/复氧组(H/R组)和SFN预处理组(10μmol/L SFN预处理细胞12 h后,进行缺氧/复氧处理)。采用倒置显微镜观察各组细胞形态及凋亡程度,CCK8法检测各组H9C2心肌细胞存活率,Western blot法检测血红素氧化酶1(HO-1)、醌氧化还原酶1(NQO1)、Bcl-2和Bax蛋白的表达水平。结果:与正常对照组相比,H/R组和SFN预处理组心肌细胞存活率均降低(P均0.01),HO-1、NQO1、Bcl-2和Bax蛋白表达水平及Bcl-2/Bax均升高(P均0.01)。与H/R组相比,SFN预处理组的细胞生长状态较好,细胞存活率明显提高[(76.00±0.52)%对(55.73±0.43)%,P0.01],HO-1(3.24±0.01对1.86±0.01,P0.01)、NQO1(1.67±0.01对0.95±0.01,P0.01)和Bcl-2(0.70±0.00对0.48±0.01,P0.01)蛋白表达水平及Bcl-2/Bax(1.22±0.01对0.56±0.00,P0.01)均明显升高,Bax蛋白表达水平明显降低(0.57±0.00对0.85±0.01,P0.01)。结论:SFN对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤有保护作用,可能与促进HO-1、NQO1、Bcl-2蛋白表达,抑制Bax蛋白表达有关。     

缺氧与缺氧/复氧诱导心肌细胞凋亡的比较及意义

目的 :研究单纯缺氧与缺氧复氧对体外培养的新生大鼠心肌细胞凋亡的影响 ,探讨凋亡在心肌细胞缺氧 /复氧损伤中的作用。方法 :取体外培养的新生大鼠心肌细胞 ,分两组 ,均置于 95 0 ml/ L N2 ,5 0 ml/ L CO2 孵箱中培养16 ,32 ,4 8h,其中一组缺氧后再恢复正常条件培养 6 h,分别造成缺氧和缺氧 /复氧损伤的细胞模型 ,TUNEL 染色观察凋亡细胞形态学变化 ,流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率。结果 :心肌细胞经历缺氧和缺氧 /复氧损伤后 ,TU NEL 染色可见凋亡阳性细胞 ;应用流式细胞仪定量检测 ,心肌细胞缺氧培养 16 ,32 ,4 8h后 ,其凋亡率分别为 :（2 .9± 0 .5 ） % ,（6 .2± 0 .8） %和 （2 6 .6± 3.0 ） % ;心肌细胞在缺氧 16 ,32和 4 8h后复氧 6 h,其凋亡率分别为 :（5 .5± 0 .7） % ,（11.0± 1.1） %和 （14 .2± 1.6 ） %。结论 :心肌细胞凋亡率随着缺氧时间的延长而增高 ;缺氧 /复氧较单纯缺氧可进一步加重心肌细胞的损伤     

调控自噬对H9c2心肌细胞缺氧／复氧损伤的影响

目的探讨调控自噬水平对H9c2心肌细胞缺氧／复氧（H／R）损伤的影响及意义。方法将H9c2心肌细胞缺氧2h／复氧4h,建立H／R损伤模型。以3-甲基腺嘌呤（3-MA）为自噬特异抑制剂和雷帕霉素为自噬增强剂,试验随机分为四组：正常对照组（C组）、H／R组、H／R＋100mol／L3-MA组（M＋H／R组）、H／R＋100nmol／L雷帕霉素（R＋H／R组）,应用MTT法检测细胞活力,透射电镜检测心肌细胞自噬小体,流式细胞技术检测细胞凋亡比例,Westernblot法检测自噬相关蛋白LC3、Beclin1,凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及下游活性片段Caspase-9、Caspase-3蛋白表达。结果H／R组明显诱导H9c2心肌细胞自噬发生、细胞活力下降、凋亡增加（P〈O．01）．Westernblot检测发现,Bax、Caspase-9、Caspase-3活性片段蛋白表达明显增加,Bcl-2表达明显抑制,Bax／Bcl-2比值、活化蛋白Caspase-3、Caspase-9表达增加（P〈O．01）;M＋H／R组H／R损伤作用明显减弱,线粒体凋亡通路及下游蛋白表达抑制（P〈O．01）;而R＋H／R组线粒体凋亡通路进一步激活,促进细胞凋亡发生（P〈O．01）。结论自噬在H9c2心肌细胞H／R损伤中起到致命性作用,抑制自噬可保护心肌细胞H,R氧化应激损伤,其机制与抑制线粒体凋亡通路有关。     

辛伐他汀对缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡的拮抗作用及其作用机制

目的: 探讨辛伐他汀对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的拮抗作用及潜在机制。方法: 分离培养 Sprague-Dawley(SD)大鼠(乳鼠)心肌细胞,随机分为对照组、缺氧2h/复氧4h(H/R4h)组、不同浓度(0.1、1.0及10 μmol/L)的辛伐他汀干预组及Toll样受体4(TLR4)中和性抗体MTS510组(浓度为10 μg/L)。H/R4h组给予缺氧2 h后,随即复氧4 h。细胞处理后,进行PI-AnnexinV染色用流式细胞仪检测心肌细胞的凋亡率,用ELISA法检测心肌乳酸脱氢酶(LDH)的活性;用免疫印迹法测TLR4蛋白的含量。结果:与H/R4h组相比,辛伐他汀干预组可显著降低心肌细胞的凋亡率(16.0% vs. 28.6%,P<0.01)及LDH 的活性(P<0.01),并呈剂量依赖性。中浓度的辛伐他汀组开始出现拮抗作用,峰值出现在高浓度辛伐他汀组, 加入MTS510阻断剂可降低心肌细胞的凋亡率及LDH的活性(P<0.01)。结论:辛伐他汀对H/R造成的心肌细胞损伤具有拮抗作用,并呈剂量依赖性,其作用机制可能与TLR4信号通路有关。     

缺氧预处理对乳兔心肌细胞缺氧复氧损伤的保护研究

目的：观察预处理（ＰＣ）对乳兔心肌细胞缺氧复氧（Ａ－Ｒ）损伤的影响。方法：采用心肌细胞Ａ－Ｒ模型，用短暂缺氧进行预处理。结果：缺氧预处理能提高Ａ－Ｒ后心肌细胞存活率（７７．２１±３．１０ＶＳＡ－Ｒ组５９．８３±２．１０．Ｐ＜０．０１）．减少ＭＤＡ产生（０．７５±０．０２ＶＳＡ－Ｒ组１．６１±０．０８ｎｍｏｌ／ｍｇｐｒ，Ｐ＜０．０１）及乳酸脱氢酶的漏出（Ｐ＜０．０１）。结论：离体乳兔心肌细胞存在ＰＣ保护现象。     

福辛普利拉预处理对心肌细胞缺氧/复氧损伤的预防作用

目的:探讨福辛普利拉对培养乳鼠心肌细胞缺氧/复氧(A/R)损伤的预防作用。方法:取SD新生大鼠(1~3 d),培养成心肌细胞,在培养的第4天随机分为5组:①正常对照组,②A/R组,③0.2 mmol/L福辛普利拉预处理组(F1组),④0.6 mmol/L福辛普利拉预处理组(F2组),⑤1.8 mmol/L福辛普利拉预处理组(F3组)。分别观察各组心肌细胞搏动频率、细胞存活率、培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性、心肌细胞肌浆网钙泵(SERCA)mRNA的表达水平和心肌细胞内游离[Ca2 ]浓度。结果:①细胞搏动频率:A/R组比正常对照组明显减低(P<0.01);福辛普利拉各剂量组比A/R组显著加快(P<0.01),比正常对照组稍慢(P>0.05)。②细胞存活率:A/R组比正常对照组明显降低(P<0.01);福辛普利拉各剂量组比A/R组明显增高(P<0.01),而与正常对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。③LDH活性:A/R组比正常对照组明显升高(P<0.01);福辛普利拉各剂量组比A/R组明显降低(P<0.01),与正常对照组相比虽有升高但差异无统计学意义(P>0.05)。④SER-CA mRNA的表达水平:A/R组比正常对照组mRNA表达下调,为正常对照组的(0.78±0.30)倍(P<0.01);福辛普利拉各剂量组比A/R组显著上调(P<0.01)。⑤心肌细胞内游离[Ca2 ]浓度:A/R组比正常对照组明显升高(P<0.01);福辛普利拉各剂量组比A/R组明显降低(P<0.01),而与正常对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论:福辛普利拉预处理后对A/R心肌细胞损伤具有预防作用,其机制可能与SERCA表达上调、减轻细胞内Ca2 超载有关。     

circPRKCI靶向miR-217对缺氧/复氧诱导心肌细胞损伤的影响

目的探讨circPRKCI对缺氧/复氧(H/R)诱导的心肌细胞氧化应激、凋亡的影响及其对miR-217的调控作用。方法采用H/R诱导大鼠心肌细胞H9c2建立细胞损伤模型,pcDNA、pcDNA-circPRKCI、anti-miR-NC、anti-miR-217、pcDNA-circPRKCI与miR-NC、pcDNA-circPRKCI与miR-217 mimics分别转染至心肌细胞后进行H/R处理;采用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)实验检测circPRKCI、miR-217表达量;采用试剂盒检测丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量;采用流式细胞术检测细胞凋亡率;双荧光素酶报告实验检测circPRKCI与miR-217的靶向关系;免疫印迹法检测Bcl-2、Bax蛋白表达量。结果H/R诱导的H9c2细胞中circPRKCI表达水平降低(P<0.05),miR-217、MDA、凋亡率及Bax蛋白水平升高(P<0.05),SOD、GSH-Px活性及Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)。H/R诱导的H9c2细胞中转染pcDNA-circPRKCI或转染anti-miR-217后可降低MDA含量、凋亡率及Bax蛋白水平(P<0.05),提高SOD、GSH-Px活性及Bcl-2蛋白水平(P<0.05)。双荧光素酶实验显示circPRKCI可靶向结合miR-217;miR-217过表达可逆转circPRKCI过表达对H/R诱导的H9c2细胞氧化应激及凋亡的作用。结论circPRKCI过表达通过下调miR-217表达抑制氧化应激及其诱导的细胞凋亡,从而减轻心肌细胞氧化损伤。     

异丙酚对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤后凋亡的影响

目的探讨异丙酚对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤后凋亡的影响及其作用机制。方法把培养的18孔乳鼠心肌细胞随机分成3组:对照组、单纯缺氧/复氧组、异丙酚处理组。培养3 d的乳鼠心肌细胞给予1 h缺氧和3 h复氧处理（单纯缺氧/复氧组）。复氧期间给予异丙酚（25μmol/L）处理（异丙酚处理组）,复氧结束后采用DNA原位末端缺口标记技术（TUNEL）测定心肌细胞凋亡比例同时用免疫组化法测定心肌细胞内抗凋亡分子Akt、Bcl-2和促凋亡分子p38 MAPK的表达。结果与对照组相比,异丙酚显著降低了缺氧/复氧诱导的心肌凋亡（10.1%±3.2%vs25.3%±6.2%,P<0.01）,并改变了缺氧/复氧过程中凋亡介导因子的活性。免疫组化的结果显示,异丙酚增加了心肌细胞内抗凋亡蛋白pAkt和Bcl-2的形成,降低了促凋亡蛋白p38的活性。结论异丙酚对培养心肌细胞缺氧损伤后的凋亡有显著的保护作用,该作用与其对pAkt、Bcl-2和p38的影响密切相关。     

RNA干扰程序性细胞死亡因子4表达对缺氧/复氧H9C2心肌细胞凋亡的影响及其机制

目的 探讨RNA干扰程序性细胞死亡因子4（PDCD4）表达对缺氧/复氧（H/R）H9C2心肌细胞凋亡的影响及其机制。方法 将H9C2心肌细胞分为对照组、H/R组、H/R+NC组和H/R+siPDCD4组。采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白质印迹法（Western blot）分别检测4组H9C2心肌细胞中PDCD4 mRNA和蛋白水平,流式细胞仪检测其凋亡率,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测其上清液中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、乳酸脱氢酶（LDH）水平,Western blot检测磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号通路相关蛋白水平。结果H/R组H9C2心肌细胞PDCD4 mRNA和蛋白、活化的Caspase-3、Bcl-2相关X(Bax)蛋白、上清液中LDH、MDA水平及凋亡率均高于对照组,而上清液中SOD水平、H9C2心肌细胞Bcl-2和p-AKT蛋白水平均低于对照组（P<0.05）。H/R+siPDCD4组H9C2心肌细胞PDCD4 mRNA和蛋白、活化的Caspase-3、Bax蛋白、上清液中LDH、MDA水平及凋亡率均低于H/R组,而上清液中SOD、H9C2心肌细胞Bcl-2和p-AKT蛋白水平均高于H/R组（P<0.05）。结论 RNA干扰PDCD4表达可抑制H/R引起的H9C2心肌细胞凋亡,其作用机制可能与激活PI3K/AKT信号通路进而降低氧化应激反应有关。     

内皮素-1对缺氧/复氧所致心肌细胞凋亡的影响

目的探讨在缺氧/复氧过程中不同时期给予内皮素-1（ET-1）对缺氧/复氧所致心肌损伤与凋亡的影响。方法乳鼠心肌细胞缺氧/复氧模型,流式细胞仪检测心肌细胞凋亡,Hoechst 33258染色计算凋亡率,试剂盒检测乳酸脱氢酶（LDH）的活性。结果ET-1预处理组（EP）细胞生存率较缺氧复氧组（HR）提高,凋亡率下降,LDH活性下降;ET-1缺氧即刻处理组（EH）细胞生存率较HR组降低,凋亡率升高,LDH释放量增加;ET-1复氧处理组（ER）的细胞生存率、凋亡率及LDH活性与HR组均无统计学差异。结论ET-1预处理有心肌细胞保护作用,ET-1缺氧时有促进心肌细胞损伤和凋亡的作用。     

西洛他唑对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的:研究西洛他唑(Cilostazol,CIL)对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤的影响及机制。方法:①分离培养SD乳鼠心肌细胞,建立H/R模型。心肌细胞随机分4组:对照组;H/R组,缺氧2 h,复氧4 h;H/R CIL组,缺氧前1 h予以CIL(10μmol.L-1)随即缺氧2 h,复氧4 h;H/R CIL Wort mannin(H/R CIL W)组,CIL处理前30 min予磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase PI3K)特异性抑制剂——渥曼青霉素(Wort mannin 0.1μmol.L-1);②检测各组培养液中乳酸脱氢酶、肌酸激酶同工酶含量,流式细胞术检测心肌细胞凋亡率,Western blot检测丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)及磷酸化丝氨酸/Akt(p-Akt)的表达。结果:CIL明显抑制H/R损伤导致的心肌细胞凋亡,并使p-Akt/Akt比值明显增加;Wort mannin可使p-Akt/Akt比值明显减少,抑制CIL的抗凋亡作用。结论:H/R损伤可导致心肌细胞凋亡,CIL可能通过PI3K-Akt途径发挥抗凋亡作用。     

一氧化氮对培养乳鼠心肌细胞低氧复氧损伤的影响

目的 :研究 NO对乳鼠心肌细胞低氧 /复氧 （A/R）损伤的影响。方法 :建立心肌细胞 A/R损伤模型 ,随机分为6组 :A组 ,正常对照组 ;B组 ,单纯低氧 /复氧 （A/R低氧 2 h,复氧 1h） ;C组 ,低氧预处理 ,低氧 2 0 m in后复氧 2 0min,然后 A/R;D、E、F组为 NO预处理组 ,加入 S-亚硝基 -已酰青酶胺 （SNAP）分别使其终浓度为 0 .5、1、2 mm ol/L,预处理 4 0 min后 A/R。于复氧后测定各组培养液中肌酸激酶 （CK）、蛋白漏出量的变化及细胞内丙二醛 （MDA）含量和细胞存活率。结果 :单纯低氧 /复氧组和 2 m mol/L SNAP组 CK、蛋白漏出量、MDA水平显著升高 （P<0 .0 1vs正常组 ） ,细胞存活率显著降低 （P<0 .0 1vs正常组 ）。0 .5和 1mmol/L SNAP预处理组和低氧预处理组上述变化明显减轻 （P<0 .0 1vs低氧复氧组 ）。结论 :NO预处理对乳鼠心肌细胞 A/R损伤具有保护作用 ,并具有浓度依赖性。     

胰高血糖素样肽1对H9c2心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用及机制研究

目的 研究胰高血糖素样肽1(GLP-1)对H9c2心肌细胞缺氧复氧(H/R)损伤的保护作用及机制.方法 培养H9c2心肌细胞,随机分为常规处理的对照组、H/R组及1、5、10mol/L GLP-1组以验证GLP-1的保护作用,随机分为 si-NC 组、si-NC+H/R 组、si-NC+H/R+10 μmol/L GL...     

FLIP protects cardiomyocytes from apoptosis induced by simulated ischemia/reoxygenation, as demonstrated by short hairpin-induced (shRNA) silencing of FLIP mRNA

Cardiomyocytes exposed to ischemia followed by reperfusion undergo apoptosis, some of which is induced via the mitochondrial pathway, and some of which is induced via the death-receptor ligand pathway. FLICE-inhibitory protein (FLIP) is a cellular protein that, in overexpression experiments in other cell types, has been shown to be capable of either inducing or protecting from death-receptor-mediated apoptosis, depending on the extent of overexpression. To examine the role of endogenous FLIP in neonatal cardiomyocytes we have used short hairpin-induced (shRNA) silencing generated from a transfected plasmid. Silencing of FLIP increases the background level of apoptosis detected by TUNEL assay in primary cardiomyocytes and sensitizes the cells to apoptosis induced by simulated ischemia/reoxygenation (IR). This result indicates that previous observations of decreased FLIP levels and increased apoptosis in cardiac infarcts is more than just correlative, but reflects an innate protective role of FLIP in cardiomyocytes. We also found that mitochondrial activity, as determined by MitoTracker red staining, is reduced in the absence of FLIP, and further decreases after exposure to simulated IR. Conversely, overexpression of FLIP somewhat prevents the decrease in mitochondrial activity after simulated IR. Thus, FLIP may confer protection from simulated ischemia/reperfusion through more than one pathway.     

番茄红素减轻H9C2心肌细胞缺氧/复氧致内质网应激的相关机制

目的 探讨番茄红素减轻H9C2心肌细胞缺氧/复氧(H/R)致内质网应激(ERS)的相关机制。方法 H9C2心肌细胞随机分为:①空白对照组、②番茄红素组、③H/R组、④番茄红素+H/R组、⑤4-苯基丁酸（4-phenyl butyric acid,4-PBA）+H/R组、⑥毒胡萝卜素内酯（thapsigargin,TG）组、⑦番茄红素+TG组。流式细胞术检测H9C2心肌细胞凋亡比例;Western blot检测葡萄糖调节蛋白(glucose-regulated proteins,GRP)78、C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun-N-terminal protein kinase,JNK)、磷酸化JNK（p-JNK）及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Casepase)-12的表达。结果 与对照组相比,H/R组及TG组细胞的细胞凋亡比例、GRP78、CHOP、p-JNK和Caspase-12蛋白表达量明显增加（P<0.01）;与H/R组相比,细胞凋亡比例及上述蛋白表达在番茄红素+H/R组与4-PBA+H/R组明显下降（P<0.01）;与TG组相比,细胞凋亡比例及上述蛋白表达在番茄红素+TG组也明显下降（P<0.01）;而番茄红素+H/R组与4-PBA+H/R组相比差异不具有统计学意义。JNK蛋白总量表达无明显变化。结论 番茄红素通过抑制ERS致凋亡的相关信号通路CHOP、p-JNK和Caspase-12对H/R H9C2心肌细胞起到保护作用。     

比索洛尔对缺氧/复氧内皮细胞一氧化氮生成的影响

目的 :观察比索洛尔对培养的人脐静脉内皮细胞 （HU VECs）在缺氧 /复氧 （A/ R）过程中一氧化氮 （NO）生成的影响。方法 :将 HUVECs暴露于缺氧环境中 30 m in后复氧 ,并加入比索洛尔 （1,5 0和 5 0 0 μmol/ L）或空白对照 ,测量复氧前、复氧后 1和 4h培养液上清 NO含量。结果 :对照组 NO产量在复氧后 1h,4h与复氧前相比有显著下降 （均 P<0 .0 1）。比索洛尔 5 0 μm ol/ L 组和 5 0 0 μmol/ L 组 NO产量在复氧后 1h,4h与复氧前相比无显著差异 （均P>0 .0 5 ） ,而与对照组和 1μmol/ L 组同一时间相比均有显著增加 （均 P<0 .0 1）。结论 :比索洛尔可以阻止 A/ R期间内皮细胞 NO产量的下降 ,因此 NO可能参与了 β阻滞剂减少缺血再灌注损伤的过程。     

缺氧复氧损伤诱导内皮细胞凋亡及卡托普利的晚期干预作用

目的 探讨缺氧复氧对血管内皮细胞凋亡的影响及卡托普利延迟预处理机制.方法 建立人脐静脉内皮细胞缺氧复氧损伤模型,用流氏细胞仪检测不同的缺氧和复氧时间以及卡托普利晚期预处理,应用缓激肽β2受体阻断剂、PKC阻断剂、一氧化氮合酶阻断剂和NF-κB阻断剂,分别与卡托普利共同孵育细胞,24 h后再对内皮细胞行缺氧复氧损伤,观察不同条件下内皮细胞DNA周期和Annexin V染色率及细胞凋亡情况的变化.结果 单纯缺氧和缺氧复氧均可引起血管内皮细胞凋亡,并且随着单纯缺氧和缺氧后复氧时间的延长,凋亡峰面积和Annexin V染色率逐渐增加.卡托普利晚期预处理后,细胞凋亡明显减少,并且在本实验特定的浓度中（10-2～10-4 mmol/L）,凋亡峰面积随卡托普利剂量的增加而逐渐增强.但给予上面4种阻断剂后,卡托普利的晚期预处理抗凋亡作用均部分消失.结论 单纯缺氧和缺氧复氧均可以导致细胞凋亡,且具有时间依赖性.卡托普利晚期预处理可以减轻内皮细胞凋亡,此作用具有剂量依赖性.这一过程涉及缓激肽β2受体、PKC途径、一氧化氮和核因子的转录等多种因素的参与.