基于磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白信号通路小干扰RNA沉默微小RNA-373对喉癌细胞的影响#br#

目的　探讨磷脂酰肌醇3激酶（Phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K）/蛋白激酶B（Protein kinase B,Akt）/雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）信号通路小干扰RNA（Small interfering RNA,siRNA）沉默微小RNA-373（Microrna-373,miR-373）对喉癌细胞生物学行为的影响。方法　喉癌TU212细胞株经常规培养后分为空白组、空白转染组、过表达组和沉默组,四组细胞分别培养。检测各组细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭能力及PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表达。结果　与过表达组相比,沉默组miR-373、P13K、AKT、mTOR表达量较低（P＜0.05）;沉默组24、48、72 h细胞增殖率较低,72 h细胞凋亡率较高（P＜0.05）;沉默组细胞迁移率较少、侵袭数较少（P＜0.05）。结论　沉默miR-373可能通过作用于PI3K/AKT/mTOR信号通路,下调P13K、AKT、mTOR表达,抑制喉癌细胞增殖、迁移、侵袭,促进凋亡。     

3-溴丙酮酸对鼻咽癌细胞CNE-1增殖和凋亡的影响及其机制研究

目的 观察3-溴丙酮酸(3-B r PA)对鼻咽癌细胞CNE-1增殖和凋亡的影响,并初步探讨其作用机制.方法 用不同浓度的3-BrPA处理CNE-1细胞,24 h后CCK-8法检测细胞增殖活性,PI染色法流式检测细胞凋亡情况,Western blot检测mTOR和S6及其相应磷酸化蛋白的表达水平.结果 50、100、1...     

Cyclin D1在EGCG抗鼻咽癌中表达的变化及意义

目的：探讨Cyclin D1基因在表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）抗鼻咽癌中表达的变化及意义,揭示EGCG的抗鼻咽癌作用机制。方法：体外培养低分化鼻咽癌细胞株CNE-2并以不同浓度EGCG处理,倒置显微镜下观察不同浓度EGCG作用48h后CNE-2细胞的形态变化,采用MTT比色法检测细胞增殖抑制率,流式细胞仪检测细胞周期,半定量逆转录PCR检测细胞中Cyclin D1mRNA的表达变化。结果：EGCG处理后,CNE-2细胞的数量及密度逐渐降低,分裂象减少,贴壁差,部分细胞变圆且体积变小,漂浮及凋亡细胞不断增多;细胞增殖明显受到抑制,CNE-2细胞被阻滞在G0/G1期,呈时间和剂量依赖性（P〈0.05）;Cyclin D1mRNA表达明显下调,且EGCG作用浓度与时间依赖性（P〈0.05）。结论：EGCG抑制CNE-2细胞的增殖,可能与其呈浓度与时间依赖性下调Cyclin D1mRNA的表达相关。     

环状RNA BCRC-3对鼻咽癌细胞增殖和迁移的影响研究

目的　观察鼻咽癌组织和细胞株中环状RNA（circular RNA,circRNA）BCRC-3的表达,探讨环状RNA BCRC-3对细胞周期依赖性激酶抑制蛋白B（cyclin dependent kinase inhibitors B,DKNIB）基因表达的调控及对鼻咽癌细胞增殖和迁移的影响。方法 荧光实时定量聚合酶链式反应（qPCR）分别检测circRNA BCRC-3在83例鼻咽癌组织及62例慢性鼻咽炎组织、鼻咽癌细胞株及人永生化鼻咽上皮细胞中的表达。以circRNA BCRC-3表达最低的细胞株为转染对象,分别转染阴性对照质粒（对照组） 或载有circRNA BCRC-3序列的质粒（实验组）。MTS法和细胞划痕实验分别检测上调circRNA BCRC-3对细胞增殖和迁移能力的影响。qPCR检测上调环状RNA BCRC-3对DKNIB基因mRNA表达的影响,Western blot检测DKNIB蛋白和PI3K/AKT信号通路蛋白的表达。结果 与慢性鼻咽炎组织相比,circRNA BCRC-3在鼻咽癌组织中表达显著降低（P <0.01）。与人永生化鼻咽上皮细胞相比,环状RNABCRC-3在鼻咽癌细胞株中表达显著降低（P <0.01）,在HONE-1细胞中的表达最少（P <0.01）。与对照组比较,实验组HONE-1细胞增殖能力从第2天开始明显下降（P <0.05）,HONE-1细胞迁移能力明显降低（P <0.01）,HONE-1细胞中DKNIB在mRNA和蛋白水平的表达明显上升（P <0.01）,PI3K/AKT信号通路蛋白PIP3、PDK1、p-AKT和AS160表达明显下降。结论 circRNA BCRC-3在鼻咽癌组织和细胞株中呈低表达,上调circRNA BCRC-3可抑制鼻咽癌HONE-1细胞的增殖和迁移能力,其机制可能是circRNA BCRC-3通过上调DKNIB基因表达,抑制PI3K/AKT信号通路转导。     

联合靶向阻断EGFR和mTOR信号通路对鼻咽癌细胞生长影响的研究

目的观察联合阻断表皮生长因子受体（EGFR）和雷帕霉素靶蛋白（mTOR）介导的信号通路对鼻咽癌细胞株CNE-1及CNE-2的影响。方法EGFR酪氨酸激酶拮抗剂（Tarceva）、mTOR抑制剂（Rapamycin）单独（单独处理组）和联合处理（联合处理组）鼻咽癌细胞株CNE-1及CNE-2后,CCK-8法检测细胞生长抑制率,流式细胞法检测细胞周期和凋亡率。结果①Tarceva、Rapamycin单独处理组对CNE-1和CNE-2细胞株均产生剂量依赖性抗增殖作用。②联合用药组CNE-1和CNE-2细胞生长抑制率显著大于两者单独处理组生长抑制率之和（P〈0.05）。③联合处理组的G1期细胞比例大于单独处理组之和（P〈0.05）。联合处理组的细胞凋亡率高于单独处理组（P〈0.05）。结论Tarceva及Rapamycin联合靶向治疗能协同性地抑制鼻咽癌细胞生长,这种效应可能通过增加G1期细胞阻滞及凋亡来实现。     

田基黄对人鼻咽癌细胞CNE-2生长和凋亡的影响

目的探讨田基黄对人鼻咽癌细胞CNE-2的抑制和凋亡作用,为其临床应用提供实验依据。方法SRB法检测田基黄对CNE-2细胞生长的抑制作用,PI分析细胞周期的变化、Annexin V检测细胞凋亡的发生。结果田基黄抑制CNE-2细胞的生长,引起细胞死亡;田基黄诱导CNE-2细胞发生凋亡和坏死;田基黄作用人鼻咽癌细胞后S期细胞的比例增加,G2/M期细胞的比例减少。结论一定浓度的田基黄可明显抑制人鼻咽癌细胞CNE-2生长,并诱导其凋亡,机制可能与阻滞细胞停留在S期有关。     

EGCG对鼻咽癌细胞增殖抑制和凋亡诱导时NF-κB和caspase-3的表达变化

目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate,EGCG）作用于鼻咽癌CNE-2细胞后,对转录因子NF-κB和凋亡效应酶caspase-3表达的影响,以及这两个基因的表达与鼻咽癌细胞凋亡和增殖的关联性。方法体外培养鼻咽癌细胞CNE-2,MTT法检测细胞增殖的抑制作用;Hoechst染色检测细胞凋亡;流式细胞仪分析细胞周期的改变。RT-PCR检测NF-κB和caspase-3的表达。结果EGCG能明显的抑制鼻咽癌细胞增殖,诱导其凋亡,并表现为浓度依赖性：流式分析显示,EGCG干预鼻咽癌细胞CNE-2在48小时后,细胞被阻滞于G1期。80mg/L EGCG处理鼻咽癌细胞24小时和48小时后,均能下调NF-κB表达,上调caspase-3表达。结论EGCG可能通过抑制NF-κB和诱导caspase-3的表达来发挥其抗鼻咽癌细胞的生物学作用。     

美洛昔康对人鼻咽癌CNE-1细胞株的作用

目的探讨美洛昔康对鼻咽癌细胞株CNE-1生长抑制及诱导凋亡的作用。方法应用肿瘤细胞培养技术,随机分组和空白对照设计,培养不同时间后,用MTT法、AO＋EB染色法、流式细胞仪检测法,观察美洛昔康对CNE-1生长抑制的剂量和时间效应,分析细胞凋亡发生率,细胞免疫荧光法检测细胞内COX-2蛋白的表达。结果美洛昔康能抑制CNE-1细胞的生长。美洛昔康处理CNE-1细胞后,细胞呈凋亡特征性改变。流式细胞分析显示美洛昔康呈浓度依赖性诱导CNE-1细胞凋亡。细胞免疫荧光结果表明美洛昔康处理细胞后,随药物浓度的增加,COX-2蛋白表达下降。结论美洛昔康具有抑制CNE-1细胞生长,诱导CNE-1细胞凋亡的作用,其机制可能与COX-2蛋白有关。     

细胞周期蛋白依赖性激酶2抑制对人鼻咽癌细胞株CNE-2衰老的影响及机制研究

目的　研究抑制细胞周期蛋白依赖性激酶2（cyclin dependent kinase,CDK2）对人鼻咽癌细胞株CNE-2衰老的影响并探讨其分子机制。方法　实验分为Control组、Control siRNA组、CDK2-siRNA组、CVT-313组,分别用PI单染流式细胞仪检测各组细胞增殖情况,衰老相关β-半乳糖苷酶染色法检测细胞衰老情况,流式细胞仪检测细胞活性氧（ROS）含量,Annexin-PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡情况;进一步通过Western blot法检测衰老相关蛋白表达情况。结果　人鼻咽癌细胞株CNE-2中,CDK2-siRNA组和CVT-313组细胞增殖指数明显降低,衰老细胞增多,活性氧含量增加,与对照组相比较差异具有统计学意义（P <0.05）,而细胞凋亡率无显著性变化（P >0.05）。CDK2-siRNA组和CVT-313组p53、p21、p16蛋白表达明显增加,而pRb蛋白表达明显减少。结论　抑制CDK2可诱导人鼻咽癌细胞株CNE-2的衰老,其机制可能是通过促进衰老相关蛋白的表达来实现的。     

microRNA抑制鼻咽癌hTERT基因表达的实验研究

目的观察microRNA对鼻咽癌CNE-2细胞hTERT基因表达的调控效应，探讨microRNA在鼻咽癌基因治疗的应用前景。方法构建靶向hTERT基因的microRNA表达质粒，脂质体法转染鼻咽癌CNE-2细胞，RT-PCR检测转染细胞中hTERT基因的mRNA水平，Western Blotting观察microRNA对hTERT蛋白表达水平的调控效应，CCK-8比色法检测microRNA对细胞生长的抑制作用，流式细胞学检测miRNA诱导细胞凋亡的作用。结果在mcroiRNA表达质粒转染CNE-2细胞后，hTERT的mRNA表达水平下调，蛋白表达水平降低，细胞周期在G0～G1期受阻，并诱导细胞凋亡。结论microRNA可在鼻咽癌中有效下调hTERT基因的表达水平，抑制鼻咽癌细胞增殖并诱导其凋亡，为鼻咽癌基因治疗研究奠定了一定的基础。     

Notch受体调控上皮-间质转化对鼻咽癌细胞顺铂耐药的影响

目的研究不同Notch受体在调控鼻咽癌顺铂耐药中的作用及相关机制。方法蛋白免疫印迹检测鼻咽癌及顺铂耐药鼻咽癌细胞(5-8F,5-8F/CDDP)Notch受体表达;流式细胞术检测不同浓度DAPT联合顺铂对5-8F/CDDP细胞凋亡影响;流式细胞术检测DAPT抑制Notch信号通路后5-8F/CDDP细胞周期变化;蛋白免疫印迹检测肿瘤耐药调控相关蛋白表达变化,统计学处理数据。结果 5-8F/CDDP细胞中Notch1和Notch4受体表达明显高于5-8F细胞(P=0.003,P=0.004);不同浓度DAPT作用5-8F/CDDP细胞后,顺铂诱导的细胞凋亡率显著上升,耐药细胞增殖受到抑制,且与DAPT浓度呈剂量效应关系(P0.05);DAPT抑制5-8F/CDDP细胞Notch信号通路后,细胞周期调控相关蛋白CyclinE和CDK-2蛋白表达明显下降,且伴有细胞周期G1/S阻滞(P0.05);同时EMT调控相关蛋白Slug及DNA切除修复蛋白ERCC1表达下降,E-Cadherin表达上调。结论 Notch1和Notch4受体表达上调与鼻咽癌细胞顺铂耐药相关,抑制Notch信号通路激活,可通过抑制肿瘤细胞EMT过程,而非细胞周期G1/S阻滞,提高耐药鼻咽癌细胞顺铂化疗敏感性。     

表皮生长因子受体信号通路调控E-cadherin表达影响喉癌细胞增殖和侵袭的机制

目的　探讨表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）信号通路调控喉癌细胞E-cadherin表达并影响细胞增殖、侵袭等生物学行为的机制。方法　采用外源性的EGFR激动剂表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）和EGFR酪氨酸激酶抑制剂厄洛替尼干预体外培养喉癌Hep-2细胞,检测细胞增殖、周期、凋亡、迁移力和侵袭力及相关蛋白表达改变。结果 EGF呈时间和浓度依赖性促进喉癌细胞增殖,并使喉癌细胞G1期比例减少而S期比例增加,细胞迁移距离及侵袭能力明显增加;厄洛替尼呈时间和浓度依赖性抑制喉癌细胞增殖,并导致喉癌细胞G1期比例增加而S期比例减少,同时增加细胞凋亡率,细胞迁移距离及侵袭能力均明显低于对照组。Western blot检测发现EGF干预使喉癌细胞E-cadherin表达下调而Vimentin表达上调,而厄洛替尼干预后喉癌细胞E-cadherin表达上调,Vimentin表达下调。结论 小分子酪氨酸激酶抑制剂阻断EGFR信号通路导致喉癌Hep-2细胞E-cadherin表达上调,并抑制细胞增殖和侵袭转移能力。     

鼻咽清颗粒对鼻咽癌CNE-2细胞周期和凋亡的影响及可能机制

目的探讨鼻咽清颗粒对鼻咽癌CNE-2细胞周期、凋亡影响及其可能作用机制。方法 CNE-2细胞Hoechst 33342-PI双染后,在荧光倒置显微镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测(flow cytometry FCM)检测细胞周期和凋亡考察鼻咽清颗粒对CNE-2细胞周期和细胞凋亡的影响,West-blot考察鼻咽清颗粒对CNE-2细胞Caspase-3和Bcl-2蛋白表达的影响。结果与阴性对照组相比,随着鼻咽清颗粒浓缩液浓度增加,细胞凋亡率增加,G1的比例增加,West-blot实验结果表明,随着培养基中鼻咽清主药浓度的增加,促进细胞凋亡的Caspase-3蛋白表达增加,抑制细胞凋亡Bcl-2蛋白表达降低。结论鼻咽清颗粒能诱导caspase-3表达,下调Bcl-2蛋白表达,将CNE-2细胞阻滞于G1期,诱导细胞凋亡。     

塞来昔布对人鼻咽癌CNE-2细胞增殖和凋亡的影响

目的：体外观察塞来昔布对人鼻咽癌CNE2细胞增殖和凋亡的影响。方法：采用MTT比色法观察其对鼻咽癌细胞生长的影响;透射电子显微镜检测细胞凋亡,应用流式细胞术观察DNA的含量和凋亡的变化情况,TUNEL染色法计数细胞凋亡指数。结果：体外塞来昔布抑制CNE-2细胞生长,呈浓度和时间依赖性。透射电镜观察到细胞皱缩、胞质丢失、核质浓缩以及凋亡小体形成等凋亡形态学改变。流式细胞术显示细胞凋亡率显著增高,在80、100gmol／L浓度下细胞凋亡率分别为（10．47±0．18）％和（20．17±0．55）％,与对照组（1．57±0．27）％比较差异均有统计学意义;塞来昔布使G0／G1期细胞比例升高,S和G2／M期比例下降,呈一定剂量效应关系。TUNEL染色法显示药物组凋亡率明显高于对照组（P〈0．01）。结论：塞来昔布能抑制人鼻咽癌CNE-2细胞增殖,并诱导其凋亡;其机制可能与诱导凋亡和阻止细胞周期进展有关。     

联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体和阻断PI3-K-Akt信号通路影响鼻咽癌细胞生长凋亡的实验研究

目的 观察联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)和阻断PI3-K-Akt信号通路,对鼻咽癌细胞株CNE-2的影响,并探索其可能的机制.方法 用TRAIL和PI3-K特异性抑制剂LY294002单独和联合处理鼻咽癌细胞株CNE-2,采用四甲基偶氮唑蓝法检测细胞存活率,流式细胞仪进行细胞凋亡率的分析,Western blot检测相关蛋白表达及Caspase活化程度.用TRAIL和LY294002单独和联合处理人良性成纤维细胞株MRC-5,检测细胞存活率.结果 TRAIL质量浓度＞1 ng/ml时,联合处理组CNE-2细胞存活率大于TRAIL单独处理组存活率(P值均＜0.05);当TRAIL质量浓度为10 ng/ml和100 ng/ml,联合处理组细胞凋亡率明显大于TRAIL单独处理组细胞凋亡率(t值为7.167和7.206,P值均＜0.05);与TRAIL单独处理组相比,联合处理组出现明显的Caspase-8、Caspase-3、Caspase-9活化增多.两组对比Akt、p-Akt、Bcl-2表达无明显改变;在MRC-5中,对照组、TRAIL单独处理组和联合处理组细胞存活率差异无统计学意义(P＞0.05).结论 联合TRAIL和阻断PI3-K-Akt信号通路对抑制鼻咽癌细胞株CNE-2生长,诱导细胞凋亡具有协同作用,其可能机制是诱导线粒体依赖途径.     

雷帕霉素靶向阻断作用对鼻咽癌细胞生长的实验研究

目的 研究雷帕霉素对鼻咽癌细胞株CNE-1、CNE-2的生长抑制作用及对细胞周期的影响.方法 采用活细胞计数试剂盒法(cellcounting kit-8,CCK-8法)观察不同浓度雷帕霉素在不同时间点对鼻咽癌细胞的生长抑制作用,光学显微镜下观察其形态学变化,流式细胞仪检测其细胞周期变化及细胞凋亡情况,反转录聚合酶链反应分析哺乳动物雷帕霉素靶蛋白基因的表达情况.结果 雷帕霉索在一定浓度范围内对鼻咽癌细胞株CNE-1、CNE-2的生长抑制作用随药物浓度的升高而逐渐增强.光镜下可观察到细胞变圆、密度降低等形态学的改变.流式细胞仪显示,150 nmol/L雷帕霉素作用48 h,CNE-1和CNE-2细胞生长周期均出现G0/G1期阻滞,且变化亦随药物浓度升高而增强;但诱导细胞凋亡作用不明显.反转录聚合酶链反应显示雷帕霉素使CNE-2细胞株哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mRNA的表达下降(t=10.625,P＜0.01).结论 雷帕霉素对鼻咽癌细胞株CNE-1、CNE-2具有生长抑制作用,可阻滞细胞周期进展,并可能通过下调哺乳动物雷帕霉素靶蛋白的表达而抑制细胞生长和细胞周期.     

EGCG诱导头颈部鳞状细胞癌细胞凋亡的初步研究

目的探讨表没食子儿茶素没食子酸脂（epigallocatechin-3-gallate,EGCG）对头颈部鳞状细胞癌（简称鳞癌）细胞凋亡的诱导作用及其分子机制。方法不同浓度EGCG处理头颈部鳞癌细胞系TU212和TU17772小时,流式细胞法检测细胞凋亡率;Western-blot检测凋亡相关蛋白的表达水平;然后用EGCG处理TU212和TU177,在不同时间点观察蛋白激酶（proteinkinase,AKT）和p-AKT的表达水平。结果EGCG呈剂量依赖性引起头颈部鳞癌细胞凋亡;caspase 9、caspase 3的活化水平和PARP的表达显著增加;同时,EGCG呈时间依赖性地降低AKT蛋白的表达活性。结论EGCG可诱导头颈部鳞癌细胞凋亡,这一过程很可能是通过AKT介导的信号通路和线粒体介导的凋亡通路来实现的。     

鼻咽癌CNE-2Z细胞株受IL-24影响的研究

目的探讨白细胞介素24(Interleukin 24,IL-24)对鼻咽癌CNE-2Z细胞株(简称CNE-2Z细胞)增殖的影响,为临床应用提供理论依据。方法取CNE-2Z细胞进行培养,用细胞计数及MTT抑制试验,检测IL-24对CNE-2Z细胞增殖的抑制作用,找出IL-24作用的峰浓度及最佳细胞增殖状况。采用碘化丙锭染色,流式细胞仪分析和细胞核形态两种方法同时检测体外培养的CNE-2Z细胞的凋亡状况。结果细胞计数及MTT法检测显示体外培养的CNE-2Z细胞在培养48 h增殖状况最差,并且存在峰浓度效应。IL-24 50 ng/ml可诱导CNE-2Z细胞的凋亡。结论IL-24可呈时间和剂量依赖性的抑制CNE-2Z细胞的增殖并诱导其凋亡。     

新福菌素对人鼻咽癌细胞株CNE-2凋亡杀伤作用的研究

目的探讨新福菌素对人鼻咽癌细胞株CNE-2的体外杀伤效应及作用机制。方法体外培养CNE-2细胞,应用MTT比色法观察新福菌素对CNE-2细胞增殖的抑制作用。倒置显微镜下观察实验组细胞的生长及结构变化,同时采用逆转录．聚合酶链反应技术（RT—PCR）检测BaxmRNA基因的表达。结果新福菌素在体外对CNE-2细胞有较强的增殖抑制作用,能诱导CNE-2细胞凋亡;同时进行BaxmRNA基因表达检测发现对照组CNE-2细胞BaxmRNA表达呈弱阳性;实验组CNE．2细胞BaxmRNA表达均呈阳性,且随着新福菌素浓度的增加而逐渐增强。结论新福菌素对CNE-2细胞有明显的杀伤效应,杀伤机制可能是诱导鼻咽癌细胞凋亡,并与凋亡相关基因BaxmRNA表达上调有关。     

Hsa-miR-15a/16-1靶向抑制Bcl-2基因对鼻咽癌CNE-2细胞的抑制作用

目的观察Hsa-miR-15a/16-1靶向抑制B细胞淋巴瘤/白血病-2基因（B-cell lymphoma gene 2,Bcl-2gene）表达对鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）CNE-2细胞的生长抑制作用。方法将构建成功的重组质粒pENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-15a/16-1经Lipofectamine 2000转染CNE-2细胞,RT-qPCR检测miR-15a/16-1、Bcl-2 mRNA表达水平,流式细胞术和WesternBlot检测Bcl-2、caspase-3蛋白表达水平,CCK-8法分析细胞生长抑制情况,4,6-二脒基-2-苯基吲哚（4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）染色观察细胞凋亡状况。结果转染后miR-15a表达增高（F=547.525,P均〈0.001）;miR-16-1表达增高（F=99.979,P均〈0.001）;Bcl-2 mRNA表达无明显差别（F=0.220,P〉0.05）;Bcl-2蛋白表达下调,caspase-3蛋白表达增高;细胞在体外凋亡明显;细胞增殖受到抑制,作用呈明显的时效关系。结论 Hsa-miR-15a/16-1对Bcl-2基因的靶向抑制,可体外对CNE-2细胞产生增殖抑制和促进凋亡作用。