hnRNPA2B1通过抑制转铁蛋白受体增强胰腺癌细胞对铁死亡的抵抗

目的:探讨异质核核糖核蛋白A2B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2B1,hnRNPA2B1)对胰腺癌细胞铁死亡的影响及其潜在机制。方法:将3种胰腺癌PaTu8988、MIA-paca2、PANC1细胞用不同浓度Erastin处理3 d, CCK8法检测细胞活性,计算3种细胞Erastin半数抑制浓度(IC₅₀)并比较其对Erastin的抵抗力;荧光实时定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹法分别检测3种胰腺癌细胞中hnRNPA2B1 mRNA和蛋白的相对表达。通过GEPIA平台分析hnRNPA2B1在胰腺癌组织和正常组织中的差异性表达,通过GEO数据库下载临床数据集分析差异性表达hnRNPA2B1患者的预后。在PaTu8988细胞中干扰hnRNPA2B1表达,分别转染sh-Control、sh-hnRNPA2B1质粒;在PANC1细胞中过表达hnRNPA2B1,分别转染Vector、Flag-hnRNPA2B1质粒;分别采用qRT-PCR和蛋白免疫印迹检测转染效率,通过Transwell实验检测hnRNPA...     

二甲双胍逆转低氧诱导的胰腺癌细胞铁死亡抵抗及潜在的作用机制

目的: 探讨二甲双胍是否能够逆转低氧诱导胰腺癌细胞对铁死亡诱导剂的抵抗,并进一步明确其作用机制。方法: 人胰腺癌Patu8988细胞分别在常氧和低氧下培养不同时间（0、12、24、48 h）,CCK-8法检测细胞增殖,免疫印迹法检测缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor 1α,HIF 1α）蛋白表达;用不同浓度铁死亡诱导剂Erastin分别处理常氧和低氧培养的Patu8988细胞,CCK-8法检测细胞活性;低氧培养的Patu8988细胞分别给予以下处理：对照组、二甲双胍、Erastin、二甲双胍联合Erastin,用CCK 8法检测细胞活性,免疫印迹法检测谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4,GPX4）蛋白表达;用不同浓度二甲双胍处理低氧培养的Patu8988细胞,免疫印迹法分别检测腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）,雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）,HIF-1α等蛋白表达。结果： 与常氧组相比,低氧抑制细胞增殖,且呈时间依赖性,在48 h差异最显著（P<0.05）;Erastin浓度为10 μmol/L时,低氧组细胞活性明显低于常氧组（P<0.05）,为最佳实验浓度;低氧条件下,与单药处理组相比,二甲双胍联合Erastin可以显著抑制细胞活性,降低GPX4蛋白表达水平（P均<0.05）;二甲双胍能够激活AMPK,抑制mTOR磷酸化以及HIF-1α蛋白水平（P均<0.05）。结论： 二甲双胍能够通过AMPK mTOR轴减少HIF 1α表达,从而逆转低氧诱导的胰腺癌细胞铁死亡抵抗。     

长链非编码RNA ABHD11-AS1对结直肠癌细胞生长和转移的影响及调控机制

目的 探讨长链非编码RNA(lncRNA)α/β水解酶域11反义RNA1(ABHD11-AS1)对结直肠癌细胞生长和转移的影响,并基于miR-133a/真核起始因子4A1(EIF4A1)轴分析其可能的调控机制。方法 (1)取人结直肠癌细胞HT-29、SW480、DLD-1、HCT116、LOVO、SW620,以及正常结直肠黏膜细胞FHC,检测细胞中lncRNA ABHD11-AS1的表达情况。(2)分别通过miRcode、TargetScan数据库预测ABHD11-AS1与miR-133a、miR-133a与EIF4A1的靶向关系,并进行双荧光素酶报告基因实验以验证。(3)将HT-29细胞分为NC组(转染Negative Control)、siABHD11-AS1组(转染lncRNA ABHD11-AS1 siRNA)、miR-133a inhibitor组(转染miR-133a inhibitor)、siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor组(转染lncRNA ABHD11-AS1 siRNA和miR-133a inhibitor)和siABHD11-AS1+m...     

甲基化结合蛋白2对人胰腺癌PANC1细胞增殖和迁移的影响

目的: 探讨甲基化结合蛋白2 (methyl-CpG-binding protein 2, MeCP2)对人胰腺癌PANC1细胞增殖和迁移能力的影响。方法: 采用qRT-PCR和免疫印迹法检测MeCP2在PANC1、PaTu8988、SW1990 3种胰腺癌细胞株中的表达水平;将干扰质粒shMeCP2(实验组)与对照质粒shEGFP(对照组)分别转入PANC1细胞中,CCK-8和克隆形成实验检测细胞增殖能力,Transwell检测细胞迁移能力。结果： MeCP2在3种胰腺癌细胞中差异性表达。与对照组相比,实验组PANC1细胞中MeCP2 mRNA和蛋白表达明显降低(t分别为6.58,8.42,P均<0.05);细胞相对增殖率、细胞克隆形成数及迁移能力明显降低(P均<0.05)。结论： 下调MeCP2表达可降低胰腺癌PANC1细胞的增殖和迁移能力。     

HDAC2 siRNA转染对人胰腺癌细胞增殖及凋亡的影响

［摘要］目的: 探讨RNA干扰沉默组蛋白去乙酰化酶2(histone deacetylase 2,HDAC2)基因表达对人胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法: 培养人胰腺癌PaTu8988细胞株,并将其随机分为5组:空白对照组,20 nmol／L HDAC2 siRNA阴性组,40 nmol／L HDAC2 siRNA阴性组,20 nmol／L HDAC2 siRNA组,40 nmol／L HDAC2 siRNA组。合成针对HDAC2基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),利用阳离子脂质体将HDAC2 siRNA瞬时转染人胰腺癌PaTu8988细胞,分别采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹法检测HDAC2基因及蛋白的表达;MTT比色法检测细胞的增殖率;流式细胞术测定细胞凋亡率。结果: 与空白对照组和阴性siRNA 组对比,HDAC2 siRNA组的HDAC2基因和蛋白的表达水平均明显下降(P均<0.05),细胞增殖率减慢(P<0.01),凋亡率明显升高(P<0.01)。结论: 采用RNA干扰沉默人胰腺癌细胞HDAC2基因表达,可抑制癌细胞增殖和诱导其凋亡。     

siRNA干扰人宫颈癌基因(HCCR)的表达对胰腺癌PANC1细胞增殖?凋亡和侵袭的影响

目的:建立稳定转染人宫颈癌癌基因(human cervical cancer oncogene,HCCR)siRNA真核表达质粒的人胰腺癌PANC1细胞株,探讨siRNA干扰HCCR的表达后对人胰腺癌PANC1细胞增殖、凋亡和侵袭的影响.方法:通过脂质体转染法将含HCCRsiRNA的真核表达质粒pGCsi-HCCR稳定转染至人胰腺癌细胞株PANC1,抗生素G418筛选获得稳转细胞株;Western blot检测PANC1细胞中HCCR的表达,同时检测肿瘤相关基因p53蛋白表达的变化;流式细胞仪检测PANC1细胞的细胞周期和凋亡率变化;MTT比色法检测siRNA干扰后对PANC1细胞增殖能力的影响:Transwell侵袭实验观察siRNA干扰后对PANC1细胞侵袭能力的影响.结果:Western blot证实siRNA稳转组的PANC1细胞株和空载体稳转组比较HCCR蛋白表达水平下调,稳转细胞株建立成功.siRNA稳转组p53蛋白表达下降.siRNA稳转组的S期细胞数目减少而G0/G1期细胞数目增加,细胞凋亡增加.MTT结果显示siRNA稳转组1和稳转组2细胞吸光度分别为空载体组细胞的0.65倍和0.68倍,细胞增殖能力下降.Transwell侵袭实验显示siRNA稳转组细胞和空载体组细胞穿膜数分别为24.4±9.9和49.1±15.4(P＜0.01),稳转组细胞侵袭能力下降.结论:siRNA干扰HCCR的表达后能抑制胰腺癌PANC1细胞增殖和侵袭,促进其凋亡.     

小干扰RNA沉默OCT4 基因表达对胰腺癌细胞株PANC1增殖与凋亡的影响

摘要：目的运用RNA干扰(RNA inteference,RNAi)技术阻断胰腺癌细胞株PANC1中OCT4基因表达,并研究该基因沉默
后对细胞增殖与凋亡的影响。方法利用阳离子脂质体LipofectamineTM2000 将化学合成的人Octamer binding factor 4
（OCT4）的小干扰RNA转染入胰腺癌细胞株PANC1 中。RT-PCR法测定胰腺癌细胞内OCT4 mRNA的表达。Western
Blot测定OCT4、PARP。CCK8法测定细胞生长曲线观察细胞增殖的抑制情况。流式细胞仪测定细胞凋亡率的变化。结
果化学合成的人OCT4siRNA能有效地抑制PANC1细胞中OCT4的表达(P<0.05)。OCT4 siRNA组中细胞增殖减慢,凋
亡率较对照组明显增加(P<0.05)。干扰OCT4能够激活PARP的表达。结论体外实验初步证明OCT4基因在胰腺癌细
胞株增殖分化与凋亡方面扮演重要角色。通过沉默其表达可抑制胰腺癌细胞株PANC1增殖并诱导其凋亡。     

LncRNA GABPB1-AS1调控miR-150-5p表达对高糖诱导人肾小球系膜细胞纤维化的影响

目的 探究长链非编码RNA(LncRNA)GABPB1-AS1调控miR-150-5p表达对高糖诱导人肾小球系膜细胞（HMC）纤维化的影响。方法 采用qRT-PCR法检测高糖诱导的HMC细胞中LncRNA GABPB1-AS1、miR-150-5p表达情况,将对数期HMC细胞分为对照组（5.5 mmol/L葡萄糖）、高糖组（30 mmol/L葡萄糖）、高糖+pcDNA3.1-NC组、高糖+pcDNA3.1-GABPB1-AS1组、高糖+pcDNA3.1-GABPB1-AS1+mimic NC组、高糖+pcDNA3.1-GABPB1-AS1+miR-150-5p mimic组,培养48 h后,CCK-8法检测各组细胞增殖率;qRT-PCR法检测细胞中纤维连接蛋白（FN）、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、纤维结缔组织生长因子（CTGF）mRNA表达水平;ELISA法检测细胞上清液白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平;Western blot法检测FN、ICAM-1、CTGF蛋白表达水平;双荧光素酶报告基因验证LncRNA GABPB1-AS1、miR-150-5p靶向...     

杆状病毒介导的DNA甲基转移酶1 siRNA对人胰腺癌细胞凋亡的影响

目的: 观察杆状病毒介导的DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1, DNMT1) siRNA(小干扰RNA)对人胰腺癌PaTu8988细胞凋亡的影响。方法： 人胰腺癌细胞PaTu8988用6孔板培养并随机分成5组：空白组、阴性组、病毒r-Bac-si-DNMT1-D1组(D1组)、r-Bac-si-DNMT1-D2组(D2组)、r-Bac-si-DNMT1-D3组(D3组)。空白组仅加10%胎牛血清和DMEM培养基培养,阴性组、D1组、D2组、D3组加血清和DMEM培养基培养24 h后,分别加入空白载体r-Bac-CMV-EGFP和重组杆状病毒r-Bac-si-DNMT1-D1、r-Bac-si-DNMT1-D2、r-Bac-si-DNMT1-D3, 150 μL/孔。72 h后收集5组细胞,用流式细胞术测肿瘤细胞凋亡,蛋白质印迹法检测抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的表达情况。结果：D1组、D2组和D3组的细胞凋亡率明显高于空白组和阴性组(P<0.05)。与空白组和阴性组相比,D1组、D2组和D3组Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.05),Bax蛋白表达显著增加(P<0.05)。结论： 杆状病毒介导的DNMT1 siRNA通过抑制Bcl-2蛋白表达,增加Bax蛋白表达,诱导胰腺癌细胞的凋亡。     

反义核苷酸抑制人高迁移率族蛋白1表达对胰腺癌细胞的影响

目的　构建高迁移率族蛋白 1(HMGB1)基因的反义真核表达载体 ,寻找胰腺癌基因治疗新途径。方法应用分子克隆技术构建HMGB1基因反义真核表达载体 pcDNA3 1/antisense HMGB1,转染胰腺癌细胞株PANC 1,通过逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)、免疫印迹法 (Westernblot)、噻唑蓝 (MTT)比色法检测转染 4 8h后胰腺癌细胞HMGB1基因表达和体外增殖活性的变化。结果　成功构建 pcDNA3 1/antisense HMGB1反义真核表达载体。所获反义表达载体 pcDNA3 1/antisense HMGB1转染可使PANC 1细胞HMGB1mRNA和蛋白表达水平显著降低 (P <0 0 1)。反义 pcDNA3 1/antisense HMGB1的导入能有效抑制PANC 1增殖活性 (P <0 0 1)。 结论　应用反义RNA技术阻断HMGB1基因的表达 ,能有效抑制癌细胞的体外增殖活性 ,为基因治疗提供了新思路     

胰腺癌细胞株SPARC基因启动子区甲基化状况的研究

目的检测6种胰腺癌细胞株中SPARC基因启动子区5’CpG岛甲基化状况。方法以ASPC、BX-PC3、CFPAC、PANC1、SW 1990、PaTu8988等胰腺癌细胞株及正常人胚肾细胞AD293标本为研究对象,采用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测细胞株SPARC基因启动子区5’CpG岛甲基化状况。结果6例胰腺癌细胞株中3例(ASPC、CFPAC-1、BxPC3)细胞株发生完全甲基化;3例(PANC-1、Patu8988、SW 1990)发生部分甲基化,正常人胚肾上皮细胞AD293未发生甲基化。结论SPARC基因启动子区5’CpG岛甲基化改变是胰腺癌SPARC基因的一种重要失活方式,SPARC基因启动子区的高甲基化是胰腺癌细胞区别于正常细胞的分子事件之一,可能在胰腺癌的发生、发展中起重要作用。检测SPARC基因高甲基化可能会成为一种新的诊断胰腺癌的肿瘤标志物。     

低氧诱导胰腺癌细胞通过外泌体途径分泌高迁移率族蛋白1

目的: 研究低氧诱导条件下胰腺癌细胞中高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1 protein,HMGB1)的分泌途径。方法: 经GEO和TCGA数据库分析HMGB1在胰腺癌样本中的表达;低氧处理胰腺癌PaTu8988细胞0,6,12,24,48 h,免疫印迹法检测培养上清液中HMGB1的含量;采用外泌体提取试剂盒分离常氧和低氧培养液中的外泌体,运用透射电镜观察外泌体膜结构,运用免疫印迹法检测外泌体中的HMGB1以及外泌体标志蛋白CD9、CD63、CD81以及HSP70的表达;利用免疫荧光法和激光扫描共聚焦显微镜观察HMGB1在PaTu8988细胞中的定位情况。结果： 数据库分析结果表明,与健康胰腺组织相比,HMGB1在胰腺癌组织中呈高表达(P<0.01),且高表达者生存期明显短于低表达者(P<0.05)。低氧处理48 h,细胞培养上清液中的HMGB1含量最多,明显高于6,12,24 h。透射电镜观察到培养上清液中有微囊泡结构,直径在100 nm左右,蛋白质免疫印迹法检测到外泌体膜标志蛋白CD9,CD63,CD81,HSP70的表达和外泌体中HMGB1的表达。免疫荧光结果显示,低氧情况下HMGB1和外泌体共定位增多。 结论： 低氧处理条件下,胰腺癌细胞中HMGB1可通过外泌体途径释放到细胞外。     

HT22细胞系铁死亡敏感性研究

目的 检测HT22细胞系可否作为研究神经元铁死亡的良好细胞模型,在细胞水平上为研究神经元铁死亡的机制提供基础。方法 用经典铁死亡诱导剂Erastin和RSL3处理HT22细胞系,显微镜下观察细胞存活情况;使用CCK-8法检测细胞存活率;使用丙二醛法或菲罗嗪法分别检测细胞内脂质活性氧（reactive oxygen species,ROS）、Fe²⁺浓度;实时定量聚合酶链反应（quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR）法检测细胞铁死亡关键基因SLC7A11（solute carrier family 7 member 11）、PTGS2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2）的mRNA水平。结果 Erastin或RSL3处理HT22后,显微镜下发现细胞发生明显死亡,加入铁死亡抑制剂Ferrostatin-1后,细胞死亡显著减少。Erastin或RSL3诱导后HT22细胞内的Fe²⁺浓度无明显变化（P>0.05）,脂质过氧化水平明显增加（P<0.05）;Erastin或RSL3导致细胞SLC7A11、PTGS2的mRNA表达水平增加（P<0.05）,进一步验证了处理后细胞发生铁死亡。结论 HT22细胞系是一种铁死亡敏感细胞系,Erastin或RSL3诱导HT22铁死亡,HT22细胞系可用于研究神经元中铁死亡的发生及胞内脂质过氧化物蓄积机制。     

隐丹参酮可能具有诱导人肝癌HepG2细胞铁死亡的作用

目的 观察隐丹参酮在人肝癌HepG2细胞铁死亡中的作用。方法 体外培养HepG2细胞,采用CCK-8法检测细胞活力并计算半数抑制浓度(IC₅₀),倒置相差显微镜观察细胞形态,DCFH-DA探针检测活性氧(ROS)水平变化,谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒检测GSH水平变化,Western blot法检测铁死亡相关蛋白胱氨酸谷氨酸逆转运体轻链蛋白(xCT)和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)蛋白表达。以铁死亡抑制剂Ferrostain-1(Fer-1)、铁螯合剂去铁胺(DFO)、ROS清除剂乙酰半胱氨酸(NAC)进行干预,同样检测细胞活力、ROS水平、GSH水平及xCT和GPX4表达。结果 隐丹参酮可显著抑制HepG2细胞活力,并引起HepG2细胞形态学变化和死亡,IC₅₀为93.73 μmol/L。隐丹参酮可显著诱导HepG2细胞ROS累积,降低GSH水平,并下调xCT和GPX4表达。Fer-1、DFO、NAC均可不同程度恢复隐丹参酮引起的HepG2细胞活力下降。Fer-1可抑制隐丹参酮诱导的ROS累积,并恢复GSH水平及xCT和GPX4表达。 结论 隐丹参酮可能通过抑制GPX4和xCT表达使HepG2细胞中ROS累积,导致细胞发生铁死亡。     

人胰腺癌细胞株HHIP基因甲基化状态检测和分析

目的:探讨人胰腺癌细胞株HHIP表达与其甲基化的关系,为胰腺癌发生机制的研究提供新的信息。方法:以人胰腺癌细胞株 BxPC-3、CFPAC-1、PANC-1、AsPC-1和PaTu8988s为研究对象,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫细胞化学染色(S-P)法检测去甲基化制剂——DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR) 处理前后各胰腺癌细胞株HHIP mRNA/蛋白表达的变化,用甲基化特异性 PCR(MSP)结合测序检测HHIP基因CpG岛甲基化状态。结果:5-Aza-CdR处理前,胰腺癌细胞株BxPC-3、CFPAC-1、PANC-1、AsPC-1和PaTu8988s无HHIP mRNA/蛋白表达;经5-Aza-CdR处理后,HHIP mRNA/蛋白重新表达。MSP结合测序显示上述胰腺癌细胞株HHIP基因CpG岛存在高甲基化。结论:人胰腺癌细胞株HHIP表达抑制与其基因CpG岛高甲基化相关。HHIP 基因CpG岛高甲基化可能在胰腺癌的发生、发展中起一定作用。     

二甲双胍诱导铁死亡抑制胶质瘤细胞增殖作用机制的研究

目的 探讨二甲双胍通过诱导铁死亡抑制胶质瘤细胞增殖的作用和机制。方法 常规培养正常人神经胶质细胞和胶质瘤细胞,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞脂质过氧化产物[5-、12-和15-羟二十碳四烯酸（HETE）]的变化,Western blot检测细胞铁死亡标志蛋白谷胱甘肽过氧化物酶（GPX4）和链脂肪酸-CoA连接酶（ACSL-4）表达;二甲双胍处理胶质瘤细胞U87,细胞计数试剂盒（CCK-8）检测细胞活力改变,克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒检测细胞LDH释放量,5-乙炔基-2’-脱氧尿苷（EdU）染色检测细胞增殖,丙二醛（MDA）试剂盒检测细胞MDA水平,流式细胞术检测细胞活性氧（ROS）水平,Western blot检测细胞铁死亡标志蛋白GPX4和ACSL-4蛋白表达;二甲双胍联合铁死亡抑制剂（ferrostatin-1）处理U87细胞,进一步验证胶质瘤细胞铁死亡机制。结果 与正常胶质细胞比较,胶质瘤细胞脂质过氧化产物5-、12-和15-HETE水平降低,铁死亡标志蛋白GPX4表达增多,ACSL-4蛋白表达减少;二甲双胍处理U87细胞后,铁死亡蛋白G...