微小RNA-30a-5p调控喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖和凋亡的机制探讨

目的　探讨miR-30a-5p对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖凋亡的影响及其机制。方法 用实时荧光定量PCR检测喉癌及癌旁组织中miR-30a-5p的表达;将Hep-2细胞分为NC组（转染miR-30a-5p mimics阴性对照）、miR-30a-5p组（转染miR-30a-5p mimics）、anti-NC组（转染miR-30a-5p inhibitor阴性对照）和anti-30a-5p组（转染miR-30a-5p inhibitor）,MTT实验、平板克隆形成实验和Annexin V-FITC/PI 双染实验分别检测细胞增殖、克隆形成和细胞凋亡情况。双荧光素酶报告基因实验检测miR-30a-5p和SOX9的靶向关系。结果　与癌旁组织表达量（1.00±0.10）相比,喉癌组织中miR-30a-5p的表达水平（0.37±0.03）显著降低（P <0.05）。与NC组相比,miR-30a-5p组细胞活性（48小时：0.42±0.03 vs 0.58±0.04）降低,细胞克隆数（75.36±6.85 vs 136.25±10.50）降低,细胞凋亡率[（23.86±2.21）% vs（9.95±1.16）%]升高（P <0.05）。双荧光素酶报告实验结果显示,转染SOX9-WT质粒的Hep-2细胞荧光素酶活性明显降低（P <0.05）,而转染SOX9-MUT质粒的Hep-2细胞荧光素酶活性无显著变化。anti-miR-30a-5p组对He p -2细胞的作用与miR-30 a -5p组相反。结论  miR-30a-5p可能通过靶向下调SOX9抑制喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖并促进细胞凋亡。     

长链非编码RNA KCNIP4-IT1通过靶向miR-181c-5p对喉癌细胞增殖和迁移的影响

目的　探讨长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）KCNIP4-IT1/miR-181c-5p分子轴对喉癌TU177细胞增殖和迁移的调控作用。方法　采用qPCR检测30对喉癌组织和癌旁组织、喉癌细胞系（TU159、TU686、AMC-NH-8、TU177、TU138）和支气管上皮细胞系（16HBE）中KCNIP4-IT1表达水平。通过RNA干扰技术将KCNIP4-IT1的小干扰RNA转染到TU177细胞（si-KCNIP4-IT1组），建立KCNIP4-IT1低表达细胞系，另设置阴性Ctrl组（Ctrl组，转染阴性对照序列）。MTT法、划痕愈合实验检测敲低KCNIP4- IT1后TU177细胞增殖和迁移的变化。双荧光素酶报告基因实验验证KCNIP4-IT1与miR-181c-5p之间的靶向调控关系。qPCR检测细胞中miR-181c-5p和人纤溶酶原激活物抑制剂1（SERPINE1）mRNA的表达水平。Western blotting检测细胞迁移蛋白（β-catenin、N-Cadherin）和增殖蛋白（CDK3、PCNA）的表达水平。结果　KCNIP4-IT1在喉癌组织中表达水平高于癌旁组织（t =9.297，P<0.01）。KCNIP4-IT1在喉癌细胞系中表达水平高于16HBE细胞（t分别为4.620、7.502、4.944、8.665、9.139，P 均<0.01），以TU177细胞中KCNIP4-IT1表达水平最高（F =17.819，P<0.01）。与Ctrl组相比，敲低KCNIP4-IT1显著抑制TU177细胞增殖（P 均<0.05）和迁移（t=3.740，P<0.01）。双荧光素酶报告基因实验证实KCNIP4-IT1靶向调控miR-181c-5p（t=5.838，P<0.01）。与Ctrl组相比，敲低KCNIP4-IT1明显上调miR-181c-5p的表达水平（t=6.214，P <0.01），下调SERPINE1基因的表达水平（t =8.190，P<0.01）。与Ctrl组相比，敲低KCNIP4-IT1明显下调细胞迁移蛋白（β-catenin、N-Cadherin）和增殖蛋白（CDK3、PCNA）的表达水平。结论　KCNIP4-IT1在喉癌组织和细胞系中呈高表达状态，敲低KCNIP4-IT1抑制喉癌TU177细胞的增殖和迁移，其分子机制可能与靶向调控miR-181c-5p并抑制SERPINE1表达有关。     

miR-218-5p靶向聚腺苷二磷酸核糖聚合酶9对喉鳞状细胞癌细胞增殖和凋亡影响

目的　探讨miR-218-5p对喉鳞状细胞癌（简称喉鳞癌）细胞的增殖和凋亡的影响及其作用机制。方法  实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和蛋白质印记（Western blot）检测人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞和正常喉上皮细胞NPEC中miR-218-5p和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶9（Poly ADP-Ribose polymerase 9,PARP9）的表达水平。构建过表达miR-218-5p或敲减PARP9的Hep-2细胞株,MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡。双荧光素酶报告基因实验和Western blot验证miR-218-5p和PARP9的靶向 调控关系。结果　与NPEC细胞相比,Hep-2细胞中miR-218-5p的表达水平显著降低（t =19.540,P <0.05）,PARP9的表达水平显著升高（t =25.381,P <0.05）。与miR-con组比较,miR-218-5p组Hep-2细胞存活率显著降低（F =37.167,P <0.05）,凋亡率显著升高（F =670.506,P <0.05）。与si-con组比较,si-PARP9组Hep-2细胞存活显著降低（F =61.813,P <0.05）,凋亡率显著升高（F =650.225,P <0.05）。miR-218-5p靶向负性调控PARP9表达。与miR-218-5p+pcDNA-con组比较,miR-218-5p+pcDNA-PARP9组Hep-2细胞存活显著升高（F =44.216,P <0.05）,凋亡率显著降低（F =329.517,P <0.05）。结论　miR-218-5p通过靶向PARP9抑制喉鳞癌 细胞增殖,诱导细胞凋亡。     

微小RNA-548c-3p通过靶向调控PCNA基因表达对喉癌细胞增殖及凋亡影响的研究[论著]

目的　探讨微小RNA-548c-3p（miR-548c-3p）对喉癌细胞增殖及凋亡的影响及其作用机制。方法　用miR-548c-3p mimic、增殖细胞核抗原（PCNA）-siRNA及其阴性对照分别或同时转染喉癌TU686和M4e细胞,用qRT-PCR与Western blot法检测miR-548c-3p和PCNA的表达;MTT法和流式细胞术分别检测转染细胞的增殖和凋亡;双荧光素酶报告基因实验观察miR-548c-3p和PCNA的靶向关系。Western blot法检测PCNA、细胞周期蛋白1（CyclinD1）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白（Bax）的表达。结果　miR-548c-3p的表达量在癌旁组织（0.74±0.10）、喉癌组织（1.94±0.16）,TU686细胞（0.35±0.07）和M4e细胞（0.41±0.03）中均呈低表达,而PCNA mRNA和蛋白均呈高表达,差异有统计学意义（P 均＜0.05）。证实PCNA上存在miR-548c-3p的结合位点。上调miR-548c-3p可抑制细胞增殖及CyclinD1、Bcl-2的表达,并可促进细胞凋亡及Bax的表达,差异有统计学意义（P 均＜0.05）;上调miR-548c-3与抑制PCNA对细胞增殖及凋亡的作用相似。pcDNA-PCNA显著减弱miR-548c-3p mimic对细胞增殖和凋亡的作用。结论　miR-548c-3p通过抑制PCNA表达而降低喉癌细胞增殖能力并诱导细胞凋亡。     

miR-182-5p调控FHIT对喉鳞癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响

目的探讨miR-182-5p调控脆性组氨酸三联体(fragile histidine triad,FHIT)对喉鳞癌细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响及其作用机制。方法选取喉鳞癌组织和癌旁正常组织标本各39例,将anti-miR-NC、anti-miR-182-5p、miR-NC、miR-182-5p载体质粒分别转染至FD-LSC-1喉鳞癌细胞中,分别记为anti-miR-NC组、anti-miR-182-5p组、miR-NC组、miR-182-5p组;将anti-miR-182-5p质粒分别与si-NC、si-FHIT载体质粒共转染至FD-LSC-1细胞中,分别记为anti-miR-182-5p+si-NC组、anti-miR-182-5p+si-FHIT组;转染均采用脂质体法。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测喉癌组织、癌旁组织中的FHIT及miR-182-5p表达水平;蛋白质印迹(Western Blot)法检测FHIT、细胞周期素D1(CyclinD1)、p21、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)的表达;四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞活性;流式细胞术检测细胞凋亡;Transwell检测细胞迁移和侵袭;双荧光素酶报告基因检测miR-182-5p和FHIT的靶向关系。结果与癌旁组织相比,喉鳞癌组织中miR-182-5p表达水平显著升高,FHIT表达水平显著降低。抑制miR-182-5p表达可降低细胞活性和迁移、侵袭数量,提高细胞凋亡率,降低CyclinD1、Bcl-2、MMP-2表达水平,提高p21、Bax、E-cadherin表达水平。miR-182-5p可靶向调控FHIT,抑制FHIT能逆转抑制miR-182-5p对喉鳞癌细胞FD-LSC-1增殖、迁移、侵袭的抑制和凋亡促进作用。结论抑制miR-182-5p表达可抑制喉鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡,其机制可能与FHIT表达相关。     

RNAi沉默miRNA-224-5p对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响

目的通过慢病毒载体介导的RNA干扰技术,来探讨沉默miRNA-224-5p对人喉鳞状细胞癌（简称喉鳞癌）Hep-2细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。方法针对目标序列合成特异性siRNA干扰片段并克隆入慢病毒载体,将重组miRNA-224-5p-RNAi-LV3转染喉鳞癌Hep-2。设为干扰组（miRNA-224-5p-siRNA,SI组）、阴性对照组（NC组）和空白对照组（BC组）,分别采用聚合酶链反应方法检测miRNA-224-5p的表达情况,用CCK8法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况、Transwell侵袭实验检测细胞侵袭情况。结果 miRNA-224-5p-RNAi-LV3可显著降低miRNA-224-5p的表达,转染后Hep-2细胞增殖能力显著降低,细胞侵袭能力明显减弱,细胞周期及细胞凋亡均未见明显影响。结论 RNAi沉默miRNA-224-5p可以抑制Hep-2细胞增殖,并降低其侵袭能力。     

LncRNA SNHG12靶向结合miR-206对甲状腺乳头状癌增殖、凋亡及AKT3蛋白的作用机制CSCD

目的 研究lncRNA SNHG12靶向结合miR-206对甲状腺乳头状癌增殖、凋亡及AKT3蛋白的作用机制。方法选取2020年1月～2021年1月于新乡市中心医院接受治疗的甲状腺乳头状癌患者的癌组织与癌旁组织标本各10例作为研究对象。将甲状腺乳头状癌细胞系TPC-1细胞分成3组：实验组（TPC-1常规培养无处理组）、转染组（SNHG12基因沉默组）和对照组（转染不相关序列组）。RT-PCR检测lncRNA SNHG12、miR-206水平，CCK-8检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞凋亡，免疫印迹检测AKT3，双荧光素酶报告检测lncRNA SNHG12靶向miR-206，双荧光素酶报告检测向miR-206靶向AKT3。结果 lncRNA SNHG12在甲状腺乳头状癌组织中的表达量高于癌旁组织（t=11.240,P<0.05）,miR-206在甲状腺乳头状癌组织中的表达量低于癌旁组织（t=6.795,P<0.05）。lncRNA SNHG12在正常甲状腺细胞Nthy-ori 3-1中的表达水平最低，在TPC-1中的表达量高于在K1、BCPAP细胞中的表达（t=5.753,P<0.05）。miR-206在正常甲状腺细胞Nthy-ori 3-1中的表达水平最高，在TPC-1细胞中的表达低于在K1、BCPAP细胞中的表达（t=11.000,P<0.05）。与对照组相比，转染组lncRNA SNHG12表达水平、细胞凋亡率、AKT3蛋白表达降低（t=5.306,P <0.05;t=19.850,P <0.001;t=12.440,P <0.001），而miR-206表达升高（t=2.504,P<0.05），转染组在24、48、72 h的细胞增殖低于对照组（F=42.000、69.740、52.510,P<0.01）。结论 低表达的lncRNA SNHG12通过靶向上调miR-206表达、抑制AKT3蛋白，从而抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖并促进其凋亡。     

Caveolin-1对喉鳞状细胞癌抑制作用的体内外研究

目的探讨caveolin-1对喉鳞状细胞癌（简称鳞癌）细胞生长的影响。方法通过脂质体法转染喉鳞癌细胞株Hep-2细胞，筛选出稳定高表达caveolin-1的克隆，并用实时定量逆转录-聚合酶链反应和免疫印迹法鉴定；用四甲基偶氮唑蓝法检测细胞的体外增殖能力；免疫印迹法检测细胞中表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、磷酸化EGFR、细胞外信号调节激酶1、2（extracellular signal-regulated kinase，Erk1、2）、磷酸化Erk1、2，caveolin-1蛋白的表达；免疫共沉淀法检测caveolin-1和EGFR的结合情况；转染后的细胞接种至裸鼠皮下，观察肿瘤的生长情况，裸鼠移植瘤中caveolin-1、磷酸化EGFR、磷酸化Erk1、2的蛋白表达用免疫组织化学法检测。结果成功筛选到稳定高表达caveolin-1的克隆；与对照组相比，转染后的细胞体外增殖能力明显减弱；细胞接种到裸鼠皮下，未转染组和转染空载组中裸鼠均形成肿瘤（100％，4／4），稳定转染caveolin-1的Hep-2-CAV1-2组中裸鼠未形成实体肿瘤（0％，0／4），Hep-2-CAVl-3组中4只裸鼠中只有3只形成肿瘤（75％，3／4），但肿瘤生长缓慢，最终生成肿瘤的重量与未转染组相比明显减小（t=3．05，P〈0．05）；免疫共沉淀显示caveolin-1与EGFR在Hep-2细胞中是结合的；免疫印迹法和免疫组织化学法发现转染caveolin-1后细胞中EGFR和Erk1、2的磷酸化水平降低。结论caveolin-1能够抑制喉鳞状细胞癌细胞株Hep-2的生长，抑制EGFR-MAPK信号通路可能与其抑癌作用相关。     

miR-30c对鼻咽癌CNE-1细胞增殖、周期和凋亡的影响

目的 观察miR-30c对鼻咽癌CNE-1细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响。方法 过表达miR-30c质粒载体转染CNE-1细胞,同时设立空质粒载体转染阴性对照组和无处理的空白对照组。荧光定量PCR检测miR-30c表达水平,CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡。结果 鼻咽癌组织中miR-30c的表达量为0.23±0.05,显著低于癌旁非肿瘤鼻咽组织的0.37±0.08（P <0.01）。过表达miR-30c组表达量（0.46±0.12）显著高于空白对照组（0.17±0.03）和阴性对照组（0.18±0.04）（P 均<0.01）。在24、48、72小时过表达miR-30c组OD值显著低于空白对照组和阴性对照组（P 均<0.01）。过表达miR-30c组G1期细胞比例（90.36±10.23）% 显著高于空白对照组（74.46±9.14）%和阴性对照组（75.25±9.23）%（P <0.01）。过表达miR-30c组凋亡细胞比例（31.06±5.12）%显著高于空白对照组（3.18±0.72）%和阴性对照组（3.56±0.78）%（P <0.01）。结论 过表达miR-30可以现在抑制鼻咽癌细胞增殖、细胞周期以及诱导细胞凋亡。     

RNAi干扰Twist基因对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞株增殖与侵袭力及E-钙黏蛋白甲基化的影响

目的探讨RNAi干扰Twist基因对喉鳞状细胞癌Hep 2细胞株增殖、侵袭力及E 钙黏蛋白甲基化的影响。方法培养人喉鳞状细胞癌Hep 2细胞株，分别转染siRNA Twist（siRNA Twist组）、阳性对照siRNA GAPDH（阳性对照组）和阴性对照错义链（阴性对照组），利用实时荧光定量PCR技术检测各转染组细胞中Twist和E cad基因表达，Western blot法检测各转染组细胞中Twist和E cad蛋白表达，MTT比色法检测各转染组细胞增殖情况，Transwell小室检测细胞迁移和侵袭能力，甲基化特异性聚合酶链式反应（MSP）检测不同转染组细胞中E cad甲基化表达。结果siRNA Twist组细胞中Twist mRNA和Twist蛋白表达量均低于阳性对照组和阴性对照组，差异均具有统计学意义（P<0.05）；siRNA Twist组细胞中E cad mRNA和E cad蛋白表达量均高于阳性对照组和阴性对照组，差异均具有统计学意义（P<0.05）；与阳性对照组和阴性对照组相比，siRNA Twist组细胞转染48 h～96 h时细胞增殖能力明显减弱，差异均具有统计学意义（P<0.05）；siRNA Twist组细胞迁移细胞数和侵袭细胞数均低于阳性对照组和阴性对照组，差异均具有统计学意义（P<0.05）；MSP 检测结果显示，siRNA Twist组细胞中E cad甲基化扩增条带呈弱阳性，表达强度显著低于阳性对照组和阴性对照组，而非甲基化扩增条带呈阳性。结论特异性抑制Twist基因表达可能通过影响E cad甲基化而上调E cad表达，从而抑制细胞增殖及侵袭能力，有望为喉鳞状细胞癌基因治疗提供新的靶点。     

Survivin反义寡核苷酸对喉癌Hep-2细胞放疗的增敏作用

目的探讨SUrvivin在放疗诱导喉癌细胞凋亡中的作用以及Survivin反义寡核苷酸（antisenseoligonucleotide,ASODN）技术对HeP-2细胞株增殖、凋亡及其放疗敏感性的影响。方法人工合成硫代SurvivinASODN,通过脂质体法转染人喉鳞状细胞癌Hep一2细胞株后,采用：①流式细胞法测定SurvivinASODN转染Hep一2细胞的转染率;②RT-PCR法检测基因转染后SurvivinmRNA的表达情况变化;③流式细胞仪检测射线照射后细胞凋亡率及Survivin蛋白的变化。结果①各浓度带FITC标记的SurvivinASODN转染细胞后6小时,取转染细胞制成的单细胞悬液,于流式细胞仪进行检查,发现转染效率均为94％～98％;②各浓度SurvivinASODN作用于Hep-2细胞24小时后,均出现SurvivinmRNA的表达下调,并呈剂量依赖关系,同时伴有细胞凋亡率的升高;③放疗~DSurvivinASODN转染组细胞凋亡率均显著高于单纯放疗组细胞凋亡率（P〈0．05）,随着SurvivinASODN剂量的增加,细胞凋亡率逐渐增加（P〈O．01）。放疗加ASODN转染组细胞Survivin蛋白表达率低于单纯放疗各组细胞Survivin蛋白表达率（P〈0．05）。各实验组与对照组中凋亡率的变化与Survivin蛋白荧光指数的变化呈负相关。结论喉癌细胞对放疗的抵抗作用与Survivin蛋白的表达水平有关,Survivin反义寡核苷酸转染Hep-2细胞株能够提高细胞对放疗的敏感性。     

MicroRNA-24对人喉鳞癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨MicroRNA-24(miR-24)对喉鳞状细胞癌(LSCC)Hep-2、AMC-HN-8细胞增殖、侵袭及凋亡等生物学行为的影响。 方法 应用Lipofectamine^TM 2000转染上调Hep-2、AMC-HN-8细胞中miR-24的表达,通过荧光定量PCR验证转染效率;然后分别采用MTT法、克隆形成实验、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验流式细胞分析技术分析外源上调miR-24后Hep-2、AMC-HN-8细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响。 结果 miR-24质粒稳定转染Hep-2、AMC-HN-8细胞后miR-24表达明显上调。与转染miR-NC组和空白对照组相比,转染miR-24能明显降低Hep-2细胞的增殖、迁移和侵袭能力;同时,转染miR-24能明显增加Hep-2、AMC-HN-8细胞的凋亡能力。 结论 miR-24异常表达与LSCC Hep-2、AMC-HN-8细胞的生物学行为密切相关,可能发挥抑癌作用。     

人喉鳞癌组织中c-myc蛋白的表达及c-myc siRNA下调喉癌Hep-2细胞中c-myc的表达对细胞增殖的影响

目的:检测喉鳞状细胞癌组织中c-myc的表达及利用RNA干扰(RNAi)技术特异性地抑制喉癌Hew2细胞中c-myc的表达对细胞增殖及抗凋亡的影响,探讨在喉癌治疗中将c-myc作为基因治疗靶点的价值.方法:免疫组织化学法检测80例喉鳞状细胞癌和30例声带息肉组织中的c-myc和Rb蛋白的表达;利用RNAi技术将c-myc siRNA转染到喉癌Hep-2细胞中,Western Blotting法检测c-myc蛋白的表达,RT-PCR法检测c-myc mRNA的表达;MTT法检测转染c-myc siRNA 24、48、72 h后,或转染不同浓度的c-myc siRNA(25、50、75 nmol/L)培养72 h,或在转染后加入不同浓度的5-Fu培养48 h,细胞增殖情况;流式细胞仪检测c-myc siRNA与5-Fu联合应用对喉癌细胞凋亡的影响.结果:免疫组织化学结果显示c-myc蛋白在喉鳞状细胞癌组织中表达增强,Rb蛋白表达下降,二者存在负相关;Hep-2细胞转染c-myc siRNA后,c-myc蛋白和tuRNA的表达水平逐渐下调;MTT结果显示随着转染c-myc siRNA浓度的增加,Hep-2细胞的存活率受到明显的抑制,具有浓度依赖性;当转染c-myc siRNA(50 nmol/L)后Hep-2细胞的抑制效率随时间的延长而增加,具有时间依赖性;当联合使用5-Fu时,在同一浓度5-Fu作用下,转染c-myc siRNA组细胞的增殖活性明显受到抑制;凋亡检测结果显示,当c-myc siRNA与5-Fu联合使用时,可明显提高Hep-2细胞对5-Fu的敏感性,在较低剂量时凋亡细胞显著增加,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05).结论:喉鳞状细胞癌组织中存在c-myc的高表达,c-myc siRNA可以特异性地下调Hew-2细胞中c-myc的表达,抑制喉癌细胞的增殖,增加细胞对5-Fu的敏感性,表明c-myc或许可以成为喉癌基因治疗中一个重要的分子靶点.     

Survivin基因在喉鳞状细胞癌中的表达及与bcl-2和p53基因表达的相关性

研究表明，肿瘤的发生不仅与细胞增殖有关，而且与细胞凋亡有关。细胞凋亡即程序性细胞死亡，受一系列基因的调控。Survivin(SVV)是新近发现的一种凋亡抑制基因，具有抑制细胞凋亡的作用，在已检测的几种肿瘤组织中表达上调。本研究采用免疫组织化学S-P法对喉鳞状细胞癌、喉不典型增生和喉息肉组织中SVV基因及bcl-2、p53蛋白进行检测，借以探讨SVV基因在喉癌发生发展中的作用及与bcl-2、p53基因表达的相互关系和意义。     

HIF-1α反义寡核苷酸对喉鳞状细胞癌hep-2细胞放疗的增效作用

目的：通过HIF-1α反义寡核苷酸转染hep-2细胞株,观察细胞凋亡及对放疗的反应情况。方法：体外培养人喉鳞状细胞癌hep-2细胞株,脂质体介导反义寡核苷酸转染,6h后4Gy7射线照射。低氧培养24h后RT—PCR检测HIF-1α mRNA表达,流式细胞仪检测HIF-1α蛋白水平及细胞凋亡率,MTT检测细胞存活情况。结果：低氧使人喉鳞状细胞癌hep-2细胞株对放射的敏感性下降;低氧并未影响HIF-1αmRNA的表达,HIF-1α蛋白在低氧6h时表达已开始升高,低氧36h时达高峰,之后表达逐渐下降;放射刺激对HIF-1α蛋白表达差异无统计学意义（P〉0．05）;各浓度的反义寡核苷酸转染组降低HIF-1α的转录及蛋白水平;MTT结果显示随反义核苷酸浓度增高,其增殖抑制效应越强（P〈0．05）,正义对照核苷酸及脂质体对照没有显著的抑制效应（P〉0、05）,但转染浓度在400nmol／L以上时,正义对照也表现出一定的增殖抑制作用（P〈0．05）;放疗后反义寡核苷酸转染组蛋白表达下降明显,较对照组及单纯放射组细胞凋亡率增加（P〈0．01）。结论：低氧环境下人喉鳞状细胞癌hep-2细胞株对放射有抵抗作用,这种抵抗作用与低氧时HIF-1α蛋白表达上调有关,而放射本身并未上调HF-1α蛋白的表达;HIF-1α反义寡核苷酸转染hep-2细胞株能够降低HIF-1α蛋白表达,提高低氧环境下人喉鳞状细胞癌hep-2细胞株对放疗的敏感性。     

程序性细胞死亡因子4在喉鳞状细胞癌中的表达及其与肿瘤细胞增殖和凋亡的关系

目的:探讨喉鳞状细胞癌中程序性细胞死亡因子4(PDCD4)蛋白表达与肿瘤细胞增殖和凋亡的关系及其临床意义。方法:采用免疫组织化学技术检测60例喉鳞状细胞癌组织及21例正常喉黏膜上皮组织中PDCD4和Ki-67的表达,原位末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡,以细胞增殖指数(PI)和细胞凋亡指数(AI)表示增殖与凋亡。结果:喉鳞状细胞癌组织中PDCD4蛋白阳性表达率低于癌旁正常喉黏膜组织(P<0.01),喉鳞状细胞癌组织中PDCD4蛋白阳性表达和喉鳞状细胞癌临床分型(肿瘤部位)、TNM分期无关,与病理分级、淋巴结转移有关(P<0.05);喉鳞状细胞癌组织细胞PI明显高于癌旁正常喉黏膜组织(P<0.01),细胞PI与喉鳞状细胞癌临床分型(肿瘤部位)、病理分级、淋巴结转移无关,与TNM分期有关(P<0.05);喉鳞状细胞癌组织细胞AI明显高于癌旁正常喉黏膜组织(P<0.01),细胞AI与喉鳞状细胞癌临床分型(肿瘤部位)、TNM分期、淋巴结转移无关,与病理分级有关(P<0.01);喉鳞状细胞癌PDCD4阳性表达的细胞PI低于阴性组(P<0.05),细胞AI高于阴性组(P<0.05)。结论:PDCD4在喉鳞状细胞癌中低表达,可能与喉鳞状细胞癌细胞的增殖和凋亡均有一定的关联。     

Hsa-miR-15a/16-1靶向抑制Bcl-2基因对鼻咽癌CNE-2细胞的抑制作用

目的观察Hsa-miR-15a/16-1靶向抑制B细胞淋巴瘤/白血病-2基因（B-cell lymphoma gene 2,Bcl-2gene）表达对鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）CNE-2细胞的生长抑制作用。方法将构建成功的重组质粒pENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-15a/16-1经Lipofectamine 2000转染CNE-2细胞,RT-qPCR检测miR-15a/16-1、Bcl-2 mRNA表达水平,流式细胞术和WesternBlot检测Bcl-2、caspase-3蛋白表达水平,CCK-8法分析细胞生长抑制情况,4,6-二脒基-2-苯基吲哚（4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）染色观察细胞凋亡状况。结果转染后miR-15a表达增高（F=547.525,P均〈0.001）;miR-16-1表达增高（F=99.979,P均〈0.001）;Bcl-2 mRNA表达无明显差别（F=0.220,P〉0.05）;Bcl-2蛋白表达下调,caspase-3蛋白表达增高;细胞在体外凋亡明显;细胞增殖受到抑制,作用呈明显的时效关系。结论 Hsa-miR-15a/16-1对Bcl-2基因的靶向抑制,可体外对CNE-2细胞产生增殖抑制和促进凋亡作用。