抗角蛋白自身抗体对角质形成细胞凋亡的影响

目的 探讨抗角蛋白自身抗体(AK auto Ab)对角质形成细胞凋亡的影响。方法 以不同浓度AK auto Ab作用体外培养人角质形成细胞后,用光镜及透射电镜观察细胞形态变化、用流式细胞仪分析细胞周期变化以及提取角质形成细胞DNA作电泳特征分析。结果 AK auto Ab作用后培养的角质形成细胞光镜、电镜下形态发生凋亡特有的改变,出现核固缩、染色质凝聚,并形成凋亡小体;细胞周期分析图中出现凋亡峰;DNA电泳呈有一定间隔的梯状条带。结论 AK auto Ab对角质形成细胞的凋亡具有诱导作用。     

抗角蛋白K16抗体对培养角质形成细胞分化和细胞活性的影响

目的研究抗角蛋白K16抗体对培养角质形成细胞分化和细胞活性的影响。方法鼠抗人角蛋白K16的IgG单克隆抗体作用培养的角质形成细胞,分别于作用12h,24h和36h,以同种型抗体作对照,采用定量PCR,Western blot的方法分别检测抗角蛋白K16抗体对角质形成细胞分化标志蛋白（nascent polypeptide-associated complex,NACA）和Involucrin mRNA表达的影响,以及对Involucrin和肌动蛋白合成启动蛋白（actin related protein,ARP2）表达的影响。结果 12h,24h和36h后NACA mRNA升高5.93-,3.35-和3.54-倍。12h和36h后Involucrin mRNA升高2.33-和2.0-倍。36h后Involucrin蛋白升高4.5-倍,而Arp2蛋白下降1.82-倍。结论抗角蛋白K16抗体能调节角质形成细胞的分化、影响细胞的活动力,角蛋白K16可能是维持银屑病角质形成细胞高分化和表皮增殖特性的重要因素。     

天然抗角蛋白自身抗体抑制角质形成细胞及鳞状细胞癌细胞增殖的作用

目的 探索天然抗角蛋白自身抗体抑制角质形成细胞及鳞状细胞癌细胞增殖的作用机理。方法 经体外培养人角质形成细胞及鳞状细胞癌细胞,作用于不同浓度的天然抗角蛋白自身抗体,四甲基偶氮唑盐法检测活性,免疫组化检测增殖及凋亡相关蛋白变化。结果 天然抗角蛋白自身抗体对二者的增殖有着明显的抑制作用,且呈一定的浓度-效应关系。对二者P53、C-myc的表达具有促进作用,而对增殖细胞核抗原的表达则具有抑制作用。结论 天然抗角蛋白自身抗体对角质形成细胞及鳞状细胞癌细胞增殖的抑制作用,可能系通过调节细胞中增殖与凋亡相关蛋白的表达来实现。     

角蛋白的分子生物学研究及其单克隆抗体的临床应用

回顾了近年来角蛋白的分子生物学研究概况及其单克隆抗体的临床应用。综述了角蛋白的分类、表达、调节、结构、功能特点、形成和在皮肤中的功能;概述了角蛋白单克隆抗体在表皮肿瘤、皮肤附件肿瘤、皮肤淀粉样变和Paget病中的应用。同时对存在的问题作一探讨并对未来前景进行了展望。     

角蛋白K14反义寡核苷酸对角质形成细胞增殖的影响

目的：研究角蛋白K14反义寡核苷酸(ASODN)对人角质形成细胞(KC)体外增殖活性的影响。方法：利用脂质体将人工合成的正义、反义及错配K14寡核苷酸基因片段导人体外培养的角质形成细胞,应用细胞生长抑制实验、透射电镜(TEM)和流式细胞仪(FCM)检测ASODN对角质形成细胞的增生、超微结构改变和细胞增殖周期的影响。结果：脂质体介导的K14反义寡核苷酸组KC增殖活性受到明显抑制;电镜下可见KC增殖活性受到抑制的改变,角蛋白合成明显减少;流式细胞仪检测见细胞周期发生明显改变,G1期细胞百分率上升,S期细胞百分率下降。而正义寡核苷酸组、错义寡核苷酸组及空白对照组均无此改变。结论：K14反义寡核苷酸可抑制KC体外增殖活性,应用反义寡核苷酸技术封闭K14基因,有望为银屑病的基因治疗提供新的思路。     

抗角蛋白单克隆抗体对舌鳞癌细胞角蛋白酪氨酸磷酸化的作用

目的观察抗角蛋白抗体对角蛋白酪氨酸磷酸化的影响。方法以鼠抗人角蛋白的IgG单克隆抗体作用于培养中的Tca8113,以抗乙肝病毒表面抗原抗体做阴性对照,同时设置阳性对照和空白对照。细胞固定、包埋后以胶体金标记的羊抗鼠IgG抗体染色,用透射电镜观察。提取抗体作用过Tca8113细胞角蛋白,以抗乙肝病毒表面抗原抗体作用的细胞做阴性对照。不同分子量的角蛋白经SDSPAGE分离后转膜,用抗酪氨酸磷酸化抗体作用、显色。结果抗角蛋白抗体作用的Tca8133细胞胞质的中间丝有胶体金颗粒,与阳性对照组类似。阴性对照组及空白对照均未见胶体金颗粒。转膜后染色,在分子量大约58KD处出现阳性条带。阴性对照未出现条带。结论抗角蛋白抗体结合于胞浆中间丝,58KD角蛋白发生酪氨酸磷酸化。     

角蛋白及p38丝裂原活化的蛋白激酶磷酸化对角质形成细胞增殖抑制的调控

目的：研究抗角蛋白抗体对角蛋白及p38丝裂原活化的蛋白激酶（MAPK）磷酸化的影响。方法：提取抗体作用过的人舌鳞状细胞癌（Tca）细胞角蛋白,以未经抗体作用的细胞作阴性对照。角蛋白经十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离、转膜,用抗酪氨酸磷酸化抗体作用和显色。超声裂解抗体作用细胞,设置阴性对照。经SDS-PAGE分离、转膜后用抗磷酸化p38MAPK抗体作用,化学发光剂发光显影。结果：角蛋白在分子质量大约为58ku处出现阳性条带：阴性对照未出现条带。抗磷酸化p38MAPK抗体作用后在分子质量大约44ku处有阳性条带;阴性对照在相应处未出现条带。结论：角蛋白及p38MAPK磷酸化是Tca细胞增殖抑制的重要调控方式。     

亚砷酸对角质形成细胞增殖及凋亡的影响

目的：研究亚砷酸对不同角质形成细胞增殖及凋亡的影响。方法：以体外培养的角质形成细胞株为对象，不同浓度的亚砷酸处理细胞后，用MTT比色分析法反映细胞增殖变化，用光镜和电镜观察细胞形态，流式细胞仪测定细胞周期分布及凋亡峰的出现，Annexin-V染色荧光照相证实凋亡的发生。结果：0.5-10μmol/L亚砷酸对良性角质形成细胞株HaCaT细胞有明显抑制作用，并呈时间和剂量依赖关系，而该浓度砷剂对A431细胞无明显影响。光镜及HE染色后观察均显示随浓度升高、时间延长，凋亡细胞增多。高于上述范围HaCaT细胞变性死亡增多，流式细胞仪检测细胞周期分布变化，G2M期细胞比例及亚G1期凋亡明显升高，Annexin-V法显示有绿色荧光的阳性细胞。而A431细胞无明显形态和细胞周期分布变化。结论：一定浓度的亚砷酸可抑制HaCaT细胞增殖，并具有诱导凋亡作用，对皮肤鳞状细胞癌A431细胞无明显影响，提示良性表皮角质形成细胞株HaCaT对亚砷酸的处理比鳞状细胞癌A431细胞株更敏感。     

高亲和力抗角蛋白人抗体的基因工程制备

目的 制备亲和力高、性能良好的人源性抗角蛋白抗体。方法 以人表皮角蛋白为抗原从噬菌体抗体库中克隆特异性抗角蛋白抗体,采用基因随机点突变和链替换(chain-shuffing)技术对所获抗体进行亲和力成熟,并对其生物学性能进行一系列鉴定。结果 经过筛选半合成抗体库和天然抗体库,成功获得了4株能与角蛋白特异性结合的人源性抗角蛋白IgG或IgM抗体;对抗体基因的随机突变未产生预期的性能改进,又选择其中活性最好的一株IgG抗体,通过轻链替换和重链替换使抗体亲和力得到了有效提高,达到8×10¹⁰/M的理想水平。结论 用基因工程的方法可以制备高质量的人源性抗角蛋白抗体。     

抗角蛋白自身抗体对体外培养鳞癌细胞端粒酶活性的影响

目的　研究抗角蛋白自身抗体对鳞癌细胞端粒酶活性的影响 ,探讨抗角蛋白自身抗体抑制鳞癌细胞增殖的机制。方法　分别以 4mg/L、8mg/L、16mg/L抗角蛋白自身抗体作用于鳞癌细胞株Tca 3 6h ,应用端粒重复序列扩增 ELISA(TRAP ELISA)和非变性聚丙酰胺凝胶电泳方法检测鳞癌细胞端粒酶活性的改变。结果　TRAP ELISA结果显示体外培养的鳞癌细胞具有较高水平的端粒酶活性 (t=3 .53 7,P <0 .0 1) ,电泳结果显示鳞癌细胞PCR产物为显色较深的多个梯形条带 ;抗角蛋白自身抗体在浓度为 4mg/L、8mg/L、16mg/L时 ,TRAP ELISA显示鳞癌细胞株Tca端粒酶的活性显著降低 ,该抑制作用呈剂量依赖性 (r =-0 .83 58,P <0 .0 1) ,电泳结果显示梯形条带数量减少 ,信号减弱。结论　抗角蛋白自身抗体可以呈剂量依赖的抑制体外培养鳞癌细胞端粒酶的活性 ,可能在抗角蛋白自身抗体抑制鳞癌增殖机制中起着一定的作用     

几种皮肤病中角朊细胞表达Leu-7和Leu-11b抗原的研究

用ABC技术,观察到鳞状细胞癌、基底细胞癌、脂滋性角化症、色素性荨麻疹、痣细胞痣、扁平苔鲜、寻常型银屑病和类银屑病病损表皮处的角朊细胞可明显表达Leu-7和Leu-llb抗原.我们推测病损处角朊细胞可能具有MHC非限制性细胞毒作用.     

白念珠菌保护性单抗的研究

目的 探讨抗白念珠菌单克隆抗体在系统性念珠菌感染动物中的保护作用。方法 制备抗白念珠菌单抗,观察单抗对系统性念珠菌感染小鼠存活时间,组织病理改变以及组织中菌落形成单位的影响。结果 制备出3株抗白念珠菌胞壁外膜抗原单克隆抗体-1B5、3E8、4C7;1B5、3E8两株单抗能显著延长致死量白念珠菌感染小鼠存活时间,减少感染小鼠主要脏器组织中白念珠菌菌落形成单位,减轻组织病理改变;1B5单抗能识别白念珠菌胞壁外膜上相对分子质量约为32000抗原;并在体外能抑制白念珠菌孢子对人颊粘膜上皮细胞,胎儿脐静脉内皮细胞的粘附。结论 1B5、3E8是具有保护作用的抗白念珠孢子对人颊粘膜上皮细胞,胎儿脐静脉内皮细胞的粘附。结论 1B5、3E8是具有保护作用的抗白念珠菌单抗;其中1B5是抗白念珠菌胞壁外膜上相对分子质量为32000的抗原的单抗;1B5单抗可通过抑制白念珠菌对上皮细胞,内皮细胞的粘附,降低该菌的侵袭力。     

人源性抗角蛋白单链抗体的构建及表达

目的 用基因工程技术制备人源性抗角蛋白抗体单链抗体(single chainFv,ScFv),并对其抗原结合特性等进行鉴定。方法 利用基因重组技术对从半合成噬菌体抗体库中克隆的人源性抗角蛋白抗体Fab片段进行改造,获得了人源性抗角蛋白ScFv片段,并进行DNA序列分析。同时用ELISA法鉴定ScFv的抗原结合活性和特异性。结果 DNA序列分析结果表明,单链抗体表达载体(pScFv)的Vκ和VH基因序列同Fab片段的Vκ和VH基因序列完全相同,表明在Fab片段改建成ScFv过程中未发生基因突变。可溶性表达的ScFv抗体能特异性地与角蛋白结合,而与其它抗原,如铁蛋白、胃蛋白酶、HBsAg等无关抗原不结合,说明人源性抗角蛋白Fab抗体改建为ScFv后具有较好的特异性,但可溶性表达的ScFv与角蛋白的结合活性低于可溶性Fab片段。结论 成功表达并鉴定了人源性抗角蛋白的ScFv可溶性片段,为人源性抗角蛋白抗体工程化、进一步研究该抗体的生物活性并提高其临床应用价值奠定了基础。     

抗白介素10单克隆抗体抗小鼠系统性白念珠菌感染的研究

目的 探讨抗白介素10单克隆抗体在抗系统性白念珠菌感染中的作用。方法 建立环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠系统性白念珠菌感染动物模型,设置对照组(单纯白念珠菌感染组)与处理组(白念珠菌感染同时注射抗白介素10单克隆抗体)。用平皿稀释法检测肾脏,脾脏组织菌落形成单位(cfu)数目;制作肝、肾、脾脏组织病理学标本,评估其病理学分级;并通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测脾脏干扰素γ分泌水平。结果 感染后2d、3d、7d,处理组肾脏cfu值明显低于对照组(P<0.05);脾脏组织cfu值也低于对照组,但差异无显著性(P>0.05)。肾脏组织病理学评分处理组低于对照组,处理组较对照组感染程度减轻,差异有显著性(P<0.01);脾脏组织病理学评分处理组也低于对照组,但差异无显著性(P>0.05)。同时检测脾脏干扰素γ分泌水平处理组明显高于对照组,具有统计学意义。结论 抗白介素10单克隆抗体在小鼠系统性白念珠菌感染中具有治疗作用。     

抗角蛋白自身抗体对培养角朊细胞产生白细胞介素8的影响

为探讨抗角蛋白自身抗体（AKantoAb）对角朊细胞免疫功能的影响，实验以IL-1β刺激无血清培养角朊细胞及AKautoAb作用后的角朊细胞，用夹心ELISA法检测培养上清中IL－8的产量。结果表明IL-1β可刺激角朊细胞产生IL－8，并对IL－1β有浓度依赖性，AKautoAb对角朊细胞产生IL－8有明显抑制作用。提示AKautoAb在炎性皮损角朊细胞中的沉着，可能存在有益的调节作用。     

存活素反义寡核苷酸对角质形成细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨存活素反义寡核苷酸对角质形成细胞增殖和凋亡的影响。方法以脂质体介导存活素反义寡核苷酸转染体外培养的角质形成细胞。采用MTT方法观察存活素反义寡核苷酸对角质形成细胞生长曲线的影响;采用RT-PCR方法观察存活素反义寡核苷酸对角质形成细胞存活素表达水平的影响;采用流式细胞仪检测存活素反义寡核苷酸对角质形成细胞细胞周期和凋亡的影响。结果存活素反义寡核苷酸作用于角质形成细胞后,细胞增殖受到明显抑制,存活素mRNA表达水平明显下降,细胞出现明显的凋亡现象。结论存活素反义寡核苷核酸能够抑制角质形成细胞增殖,促进角质形成细胞凋亡。提示存活素可能会成为一个新的治疗银屑病的靶分子。     

他扎罗汀抑制角质形成细胞血管内皮生长因子的表达

目的　探讨他扎罗汀治疗银屑病等的作用机制。方法　用免疫组化方法检测他扎罗汀对培养的角质形成细胞血管内皮生长因子 (VEGF)表达的影响 ,用双抗体夹心ELISA法定量检测他扎罗汀对培养的角质形成细胞上清液中VEGF分泌的影响。结果　免疫组化染色表明他扎罗汀可以减少培养的角质形成细胞VEGF的产生 ,表现为角质形成细胞染色强度明显减弱。角质形成细胞培养上清液检测表明 ,他扎罗汀可明显减低角质形成细胞VEGF的分泌 ,并呈剂量依赖性 ,10 -8mol/L他扎罗汀即可使角质形成细胞VEGF分泌减少 40 %左右 (P <0 .0 1)。结论　他扎罗汀治疗银屑病的机制之一可能在于减少银屑病病人角质形成细胞VEGF分泌 ,从而改善银屑病皮损的血管扩张、增生等病理改变 ,进而减轻炎症细胞浸润及炎症反应。     

来氟米特对角质形成细胞增殖及凋亡的影响

目的 研究来氟米特对角质形成细胞增殖及凋亡的影响。方法 以良性角质形成细胞株HaCaT为研究对象．用结晶紫染色及增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化法反映细胞增殖变化；HE染色观察药物处理前后细胞形态变化：流式细胞仪测定细胞周期及凋亡率变化。结果 μmol/L来氟米特处理HaCaT细胞，24h后表现出对上皮细胞增殖的抑制作用，PCNA阳性细胞开始减少。随着时间延长和药物剂量的加大．药物的抗增殖作用愈加明显，PCNA阳性细胞进一步减少，当药物浓度达到200μmol/L时，视野中未见PCNA阳性细胞。即药物对HaCaT细胞的抑制作用呈时间、剂量依赖关系。药物处理后，细胞变小或变圆，膜皱缩，核浓缩、深染，核分裂像减少。细胞S期比例增加，G2M期比例减少，G1期之前未见与药物剂量相关的凋亡峰。结论 来氟米特可抑制haCaT细胞增殖，对细胞凋亡影响不大。