TNFα，LPS，oxLDL和AngⅡ诱导U937细胞PDGF-B基因转录

在动脉粥样硬化等重要血管疾病的发生过程中 ,内皮细胞与循环血细胞之间的相互作用无疑起着关键的作用。许多致病因素除对内皮细胞直接作用外 ,还可通过作用于循环血细胞而引起放大效应。血小板源生长因子Ｂ链基因 (ＰＤＧＦ -Ｂ)是普遍存在的促有丝分裂剂 ,与动脉粥样硬化关系密切。我室前期工作观察到ＴＮＦ -α等可刺激内皮细胞ＰＤＧＦ -Ｂ基因表达。目的 :观察心血管疾病相关因素对Ｕ937单核细胞中ＰＤＧＦ -Ｂ链基因转录的影响及ＰＫＣ与ＭＡＰＫ通路可能参与的调节作用。方法 :培养的Ｕ937细胞以 2 0 0Ｕ/ｍＬＴＮＦ ,1 0 0ｎｇ/ｍＬ…     

TNFα对血管内皮细胞PDGF-B链基因转录的影响

ＴＮＦα主要由巨噬细胞、Ｔ细胞和ＮＫ细胞产生,是一种在急、慢性炎症过程中均有重要作用的炎症介质。动脉粥样硬化（ＡＳ）是以动脉壁内皮结构、功能损害和平滑肌细胞增殖变化为主的慢性炎症过程。ＡＳ时ＴＮＦα合成增多,且与ＡＳ的严重程度成正比。ＰＤＧＦ是以二聚体（ＡＡ,ＢＢ和ＡＢ）形式存在的促分裂剂。其中,ＰＤＧＦ－Ｂ链由ＰＤＧＦ－Ｂ链基因编码,该基因ｍＲＮＡ在ＡＳ血管内皮细胞中表达明显增高。因此,研究在ＴＮＦα作用下,血管内皮细胞ＰＤＧＦ－Ｂ链基因表达调控的分子机制对于阐明动脉粥样硬化的发病机制具有重要…     

AngⅡ对ECV304细胞增殖作用的相关基因表达谱研究

目的 :探讨血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )对ECV3 0 4细胞增殖作用的相关基因表达谱。方法 :体外培养人脐静脉内皮细胞株 (ECV3 0 4) ,实验分AngⅡ处理组、NAC干预组和正常对照组。采用改良MTT法、Fen ton反应和硝酸酶还原法分别观察不同浓度AngⅡ在4h、1 2h和 2 4h时对ECV3 0 4细胞的增殖率和细胞产生ROS(·OH和NO)的量。应用基因芯片技术和光镜分别检测 0 .0 62 5和 1 μmol/LAngⅡ作用 1 2h时ECV3 0 4细胞增殖作用的相关基因表达谱和细胞形态学变化。结果 :实验结果发现 :①一定浓度的AngⅡ(0 .0 3 1 2 5～ 1 μmol/L)作用 1 2h时E…     

IFN-γ、IFN-α和TNF对ECV304细胞TRAIL、DR4、DR5和Fas表达的调节作用

病毒感染常导致血管内皮细胞发生凋亡 ,引起机体出现发热、出血、休克等临床症状。TRAIL、DR4、DR5和Fas是肿瘤坏死因子及其受体超家族中参与细胞凋亡的重要分子。我们用IFN α、IFN γ和TNF刺激ECV30 4细胞 ,研究其对膜型TRAIL、DR4、DR5和Fas表达的调节作用 ,以此为模型 ,探讨急性病毒感染等疾病体内所诱导产生大量细胞因子与内皮细胞凋亡发生的关系。将ECV30 4细胞用 10 %FCSRPMI16 4 0培养基培养。调整细胞浓度为 5×10 4 /ml,铺于 2 5cm2 的细胞培养瓶中 ,培养 5h后分别加入IFN γ(5U/ml)、IFN α(2 0U/ml)和TNF…     

α-黑色素细胞刺激素对ECV304细胞与U937细胞黏附作用的影响

研究α-黑色素细胞刺激素(α-MSH)对人脐静脉内皮细胞系ECV304细胞黏附作用的影响,以探讨α-MSH的抗炎与免疫调节机制。以U937细胞与ECV304细胞相互黏附作为实验模型,观察LPS或TNF-α刺激ECV304细胞,以及α-MSH干预后,对U937细胞黏附于ECV304细胞的影响。用不同浓度α-MSH处理ECV304细胞,或在LPS/TNF-α处理的同时加不同浓度的α-MSH培养ECV304细胞,以FACS检测ICAM-1,RT-PCR检测骨桥蛋白(OPN)mRNA,Westernblot检测OPN蛋白表达。结果显示,LPS或TNF-α处理ECV304细胞可增加ECV304细胞与U937细胞的黏附,而α-MSH降低这种黏附作用。α-MSH抑制ECV304细胞表达ICAM-1和OPN蛋白;LPS或TNF-α刺激后,ECV304细胞表达OPN mRNA上调,而α-MSH能抑制LPS或TNF-α的上调作用。这些结果提示,α-MSH可通过降低ICAM-1和OPN的表达抑制炎症时血管内皮细胞与白细胞的黏附。     

血小板对ECV304细胞PTA1表达和PDGF释放的影响

目的:探讨血小板对妊高征患者血清刺激下的ECV304细胞(ECV304)表达人血小板/T细胞活化抗原1(PTA1)和释放血小板衍生生长因子(PDGF)的影响。方法①用间接免疫荧光染色结合流式细胞仪分析观察血小板与妊高征患者血清刺激的ECV304细胞孵育前后PTA1的表达②用ELISA方法检测血小板与妊高征患者血清刺激的ECV304细胞孵育前后PDGF的量。结果:①血小板与妊高征患者血清刺激(24h、48h)的ECV304细胞孵育后PTA1表达的百分率(6.32%、4.13%)明显低于对照组(15.51%、5.64%)(P<0.05)。②妊高征患者血清刺激ECV304细胞8h、24h、48h释放PDGF的量(1593、2625、2175ng/L)明显高于正常孕妇组(235、405、133.5ng/L)差异显著(P<0.01)。③血小板与妊高征患者血清刺激的ECV304细胞孵育后,24h、48h细胞培养上清液中PDGF-B的量又进一步增加(3266、2360ng/L),与对照组比差异显著(P<0.05)。结论:ECV304细胞与血小板之间的黏附可能是通过PTA1分子发挥作用的,同时导致了PDGF的进一步释放。     

TNFα、LPS诱导EA、hy926细胞一氧化氮合酶基因的转录

一氧化氮 (ＮＯ)由一氧化氮合酶 (ＮＯＳ)催化Ｌ -精氨酸生成。诱导型一氧化氮合酶 (ｉＮＯＳ)是ＮＯＳ三种亚型中催化产生ＮＯ较多的一种 ,可被多种炎症因子诱导 ,而诱导环节多在基因转录水平。目的 :观察肿瘤坏死因子α(ＴＮＦα)、脂多糖 (ＬＰＳ)对内皮细胞系ＥＡ .ｈｙ92 6细胞ｉＮＯＳ基因转录的影响 ,并探讨蛋白激酶Ｃ(ＰＫＣ)和丝裂素活化蛋白激酶 (ＭＡＰＫ)的作用。方法 :传代培养的ＥＡ .ｈｙ92 6细胞用ＴＮＦα ,ＬＰＳ处理 1 8小时 ,并同时加入或不加蛋白激酶Ｃ抑制剂Ｈ - 7、Ｃａｌｐｈｏｓｔｉｎ和丝裂素原活化蛋白激酶抑制…     

α-黑色素细胞刺激素对ECV304细胞产生促炎因子的调节作用

研究α-黑色素细胞刺激素(α-MSH)对人脐静脉内皮细胞系ECV304细胞产生促炎因子的调节作用,探讨α-MSH的抗炎与免疫调节机制。用不同浓度α-MSH处理ECV304细胞,或在LPS/TNF-α处理的同时加不同浓度的α-MSH培养ECV304细胞。用ELISA检测上清中TNF-α和IL-8,以Greiss法测定NO,RT-PCR检测组织因子(TF)mRNA,Westernblot检测TF蛋白表达。结果显示,α-MSH抑制ECV304细胞产生NO、TNF-α,但促进IL-8的释放。LPS或TNF-α能上调ECV304细胞表达TF mRNA,而α-MSH抑制这种上调作用,并抑制ECV304细胞表达TF蛋白。上述结果提示α-MSH可通过调节血管内皮细胞表达促炎因子而发挥抗炎和免疫调节作用。     

α-黑色素细胞刺激素对ECV304细胞产生促炎因子的调节作用

研究α-黑色素细胞刺激素（α—MSH）对人脐静脉内皮细胞系ECV304细胞产生促炎因子的调节作用，探讨α—MSH的抗炎与免疫调节机制。用不同浓度α—MSH处理ECV304细胞，或在LPs／TNF-α处理的同时加不同浓度的α—MSH培养ECV304细胞。用ELISA检测上清中TNF-α和IL-8，以Greiss法测定NO，RT-PCR检测组织因子（TF）mRNA，Western blot检测TF蛋白表达。结果显示，α-MSH抑制ECV304细胞产生NO、TNF-α，但促进IL-8的释放。LPS或TNF-α能上调ECV304细胞表达TFmRNA，而α—MSH抑制这种上调作用，并抑制ECV304细胞表达TF蛋白。上述结果提示α—MsH可通过调节血管内皮细胞表达促炎因子而发挥抗炎和免疫调节作用。     

碱性成纤维细胞成长因子对ECV304细胞迁移的影响

目的：观察不同浓度的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对体外培养中划痕损伤后ECV304细胞迁移的影响。方法： 在体外细胞划痕损伤模型中应用显微电视电脑图像处理系统定量测定不同浓度(0、5、10、15 μg/L)bFGF引起的ECV304细胞迁移的变化，用光镜与扫描电镜观察bFGF引起的迁移细胞的形态变化。结果： 与不加bFGF的对照组比较，低浓度(5 μg/L)时bFGF对ECV304细胞的迁移呈促进作用；高浓度时(15 μg/L)呈抑制作用。迁移细胞表面有众多丝状伪足。结论： bFGF对体外培养的ECV304细胞的迁移有双相调节作用，低浓度时(5 μg/L)促进细胞迁移，高浓度时(15 μg/L)抑制细胞迁移。迁移细胞表面伪足丰富，以丝状伪足为主。     

尿酸对ECV304细胞的NO-NOS通路及ADMA-DDAH系统的影响

目的：观察尿酸（uric acid，UA）对ECV304细胞的NO-NOS通路及ADMA-DDAH系统的影响。 方法： ①浓度依赖性分组：对照组、UA 200 μmol/L（UA2）组、UA 400 μmol/L（UA4）组、UA 600 μmol/L（UA6）组与ECV304细胞共同孵育24 h。②时间依赖性：UA6组分别观察1、3、5、7 d。检测培养液NO2-/NO3-浓度、NOS活性、非对称二甲基精氨酸（ADMA）浓度、二甲基精氨酸二甲胺水解酶（DDAH）活性以及SOD活性和Ang Ⅱ浓度，细胞裂解液DDAH表达。 结果： ① 3种浓度UA组NO2-/NO3-明显高于对照组，NOS、DDAH、SOD活性则在UA4、UA6两组明显高于对照组，而ADMA浓度在UA4、UA6两组降低，Ang Ⅱ浓度和DDAH表达则无显著差异。② UA6组各时段NO2-/NO3-浓度和NOS、DDAH、SOD活性均高于相应对照组，而ADMA浓度低于对照组；Ang Ⅱ浓度、DDAH表达则无明显差异。除NOS活性在第7 d明显下降外，其余指标在不同时段组没有明显的差异。 结论： ① 短期UA刺激使ECV304细胞分泌NO2-/NO3-增多，且呈浓度依赖，无时间依赖。② UA通过增加DDAH活性、加速ADMA的降解,使NOS活性增加而致NO2-/NO3-生成增多。③尿酸使SOD活性增加而不增加AngⅡ浓度。     

钠泵抑制剂哇巴因对ECV304细胞连接相关分子表达的影响

目的:探讨钠泵抑制剂哇巴因对细胞连接相关分子表达的影响.方法:以不同浓度哇巴因作用ECV304细胞,用倒置相差显微镜和透射电镜观察细胞形态变化;通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞生长抑制作用;用Hoechst33342/PI双荧光染色、荧光显微镜分析细胞死亡特征;应用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞连接相关分子钠泵β1亚单位、内皮钙黏蛋白、 P120连环蛋白1A和P120连环蛋白3A mRNA的表达.结果:哇巴因以浓度和作用时间依赖的方式抑制ECV304细胞生长;10 μmol/L哇巴因作用24 h,引起细胞坏死;0.1 μmol/L哇巴因作用24～48 h,细胞明显脱落,细胞间连接丧失,细胞出现染色质凝集、边移、凋亡小体形成等凋亡特征.RT-PCR结果显示钠泵β1亚单位、内皮钙黏蛋白和P120连环蛋白1A表达下降,P120连环蛋白3A表达上调.结论:哇巴因调节ECV304细胞连接相关分子表达从而影响其黏附和存活.     

活性氧对ECV304细胞生长和凋亡的相关基因表达谱研究

目的： 探讨活性氧（ROS）对ECV304细胞生长和凋亡作用的相关基因表达谱。 方法： 采用MTT法分别观察不同浓度AngⅡ在4 h、12 h和24 h时对ECV304细胞生长率和ROS生成量的影响。应用基因芯片技术和光镜分别检测0.0625和1 μmol/L AngⅡ作用12 h时ECV304细胞生长作用的相关基因表达谱和细胞形态学变化。 结果： 一定浓度的AngⅡ作用12 h时ECV304细胞生长率明显增加（P<0.05）；基因芯片技术分析显示，在0.0625 μmol/L AngⅡ作用ECV304细胞12 h时，与细胞生长相关的ERK、CDK、CCN、PCNA等25个基因普遍上调，而与细胞凋亡相关的DR6、caspase-6、BAK1、PDCD8等12个基因普遍下调，在1 μmol/L AngⅡ作用12 h时，呈相反结果。 结论： AngⅡ是ECV304细胞产生ROS(·OH)的诱导剂，可引起多种与ECV304细胞生长和凋亡的靶基因表达；N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）可以明显抑制AngⅡ对ECV304细胞的生长作用；ROS(·OH)可能是AngⅡ诱导ECV304细胞生长和凋亡的主要信号转导分子和基因表达调节分子。     

真核生物Ⅱ类基因转录起始的调控

真核生物Ⅱ类基因的转录起始是一个极其复杂并受到严格调控的过程。有两种转录起始复合物：一种是包含 Ｔ Ｂ Ｐ, Ｔ ＦⅡ和ｐｏｌ Ⅱ的分步组装复合物;另一种是 Ｒ Ｎ Ａ 聚合酶Ⅱ全酶。两条调控途径：一是组蛋白对基因的封闭作用;二是顺式作用元件与反式作用因子的相互作用。目前有关蛋白质 Ｄ Ｎ Ａ 识别的立体化学规律、蛋白质因子 Ｔ ＦⅡ Ｄ（ Ⅱ类基因转录因子 Ｄ） 以及 Ｓｗｉ／ Ｓｎｆ 蛋白在转录起始中的作用的研究均已取得一定进展。当前对转录激活机制的一种新观点为三分体模式。     

蛋白激酶C对HMGI调节PDGF-B链基因转录的影响

血小板源生长因子B -链 (PDGF -B)基因表达与正常细胞的分裂、增殖 ,肿瘤血管内皮的发生 ,动脉粥样硬化过程中血管平滑肌的增殖和向内皮下迁移等体内许多重要的生理和病理过程有关。高迁移率蛋白I(HMGI)是细胞核内调节染色体结构和基因转录结构最灵活的“分子胶”之一。我们曾观察到HMGI在体外可与PDGF -B链基因上游调控序列结合并可被蛋白激酶C(PKC)磷酸化。目的 :观察HMGI对PDGF -B链基因转录的调节作用和PKC位点磷酸化对其调节作用的影响。方法 :构建HMGI的高表达质粒和其PKC磷酸化位点突变的表达质粒 ;脂质体法转染EC…     

α-干扰素刺激基因的信号转换和转录调控

α-干扰素(IFN-α)与高亲和膜受体结合后刺激基因表达。目前为止所有克隆出的IFN-α刺激基因的特点是都有一个DNA元件存在,该元件叫做IFN刺激应答元件(ISRE),常位于基因的5′上游区。紧随着IFN与受体结合启动的信号转换,一种或几种核因子结合到ISRE上,这为IFN-α信号的快速转换提供了一个方便的检测方法。其转换过程利用了PLA_2产生的能调节ISRE结合因子的第二信号分子。克隆表达确定了两个可能作为信号受体的特异ISRE结合蛋白。深入研究IFN作用的分子机理可以应用酵母遗传学方法,酵母中表达的人P68激酶具有生长抑制表型,从而提供了分析IFN刺激途径的成分的另一有用手段。     

杭白菊总黄酮对ECV304细胞内钙信号的影响

目的 :杭白菊是我国传统的栽培药用植物。药物分析表明 ,杭白菊内含黄酮类、菊甙及多种维生素和微量元素。我们的前期研究表明 ,杭白菊总黄酮 (FDM)可以增加大鼠心脏的收缩力和冠脉流量 ,并且能对抗由缺血 /复灌引起的心脏收缩力下降和冠脉流量的下降。血管环实验证明FDM具有舒张大鼠胸主动脉环的作用 ,但是尚无直接证据表明FDM可直接影响细胞内钙水平。本实验观察了FDM对人脐静脉内皮细胞株ECV30 4细胞内钙的影响。方法 :将人脐静脉内皮细胞株ECV30 4细胞接种于含有 1mLDMEM培养基的培养板内的盖玻片上。用Fura - 2 /AM(1μmol/…     

反式脂肪酸对ECV304细胞HNP-1mRNA表达和氧自由基的作用

目的:探讨反式脂肪酸(TFAs)对ECV304细胞氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)的作用及其机制。方法:按常规方法传代培养ECV304细胞,用实时荧光定量PCR检测不同浓度TEAs刺激(TFA处理组)后ECV304细胞中HNP-1的表达;采用流式细胞仪检测ECV304细胞中氧自由基(ROS)的生成;用脂质氧化产物丙二醛(MDA)生成量描述ECV304细胞LDL氧化能力的变化。并与未行TFAs处理的ECV304细胞对照组比较其组间差异。结果:与对照组比较,TFAS处理组HNP-1mRNA表达水平显著升高(0.220±0.030vs 0.429±0.090,P0.05);与对照组比较,1mmol/L TFAS刺激ECV304细胞12h其ROS水平显著升高(11.30±1.67vs 66.70±6.53,P0.05),在加入不同钙离子拮抗剂后ROS水平明显下降(P0.05);与LDL处理组比较,1mmol/L TFAS+LDL处理组MDA水平也显著升高(0.134±0.027vs 0.155±0.025,P0.05)。结论:反式脂肪酸能促进HNP-1的表达,提高钙离子依赖的自由基水平,从而提高ECV304细胞氧化LDL的能力。     

人类T细胞抗原受体的α、β和γ链编码基因

T细胞的识别具有抗原特异性,并为一种称之为T细胞抗原受体的复合体所介导。此受体是蛋白质异二聚体,存在于T细胞表面,由二硫键连接α和β链组成。多年来企图从分子结构上去研究T细胞识别抗原的应答作用,但都没有成功。直到这几年我们和其他的实验室才分离出T细胞抗原受体的α和β     

脱氢表雄酮对抗LDL和OX-LDL所致ECV304细胞的损伤

目的：观察脱氢表雄酮（DHEA）对抗LDL及OX-LDL所致ECV304细胞的损伤作用，探讨DHEA可能的抗AS作用机制。 方法: 采用培养的ECV304细胞, 应用硝酸还原酶、放免及SABC免疫组化等方法观察经DHEA预处理及与LDL或OX-LDL混合作用后的细胞培养液中NO2-/NO3-、ET-1水平及细胞表面ICAM-1的表达。 结果: LDL可明显地减少培养液中NO2-/NO3-的含量，增加细胞ICAM-1的表达，但不影响ET-1的分泌；OX-LDL可明显减少培养液中NO2-/NO3-的含量、升高ET-1的水平，同时上调细胞表面ICAM-1的表达； 在预处理条件下，DHEA可升高LDL作用后细胞培养液中NO2-/NO3-的含量、下调ICAM-1的表达，但在混合培养条件下无此作用；在预处理及混合培养条件下，DHEA均可升高OX-LDL作用后细胞培养液中NO2-/NO3-的含量、减少细胞ET-1分泌以及下调ICAM-1的表达。 结论: LDL和OX-LDL对ECV304细胞具有明显的毒性作用，两者作用机制不尽相同。DHEA可能通过对ECV304细胞内部结构和功能的调节或通过其对OX-LDL分子的直接作用而发挥保护作用。