人精子超低温冻贮技术的研究(一)——不同的冻贮方法、冷平衡时间对精子存活率的影响

关于精液冻贮技术虽国外已做了大量的研究,但一些研究结果不无矛盾。为了寻找适合我国使用的简便、有效的精液冻贮方法,我库从1984年12月开始,以液氮为致冷源,用自行研制的精液冷冻设备,对人精子超低温冻贮技术进行了一系列比较性研究。从1985年2月至1986年2月,共做冻精人工授精118例,181周期。确知怀孕和已生育者33例,周期成功率为18.23%(另文报道)。现将精子冻贮技术的实验研究结果报道如下。     

人精子超低温冻贮技术的研究(三)——不同的甘油浓度、初冻温度和药物对精子存活率的影响

材料和方法基本材料和方法同上文研究(一)。不同之处在各实验栏中注明。一、不同的甘油浓度对冻贮复温后的精子存活率的影响实验用10份精液标本。每份精液液化后均分为5份,按精液:保护剂=1:1之比,分别添加五种不同的保护剂,细管法分装,冷平衡30分钟,-110℃初冻温度冷冻,保护剂按甘油浓度不同分 A、B、C、D、E 五组,与精液混合后甘油最终浓度依次为3%、     

复温方法及保护剂对人冷冻精液复温后精子存活率的影响

作者对冷冻精液的四种复温方法及两种保护剂分别进行了202例和194例次的对比观察。结果表明:冷冻的复温效果受复温方法影响.快复温比慢复温效果好,37℃水浴和48℃水浴复温效果明显优于室温(22℃)空气中和孵箱(37℃)内放置(P<0.001),并结合观察结果,对快速复温及效果良好的机制进行了讨论。甘油和甘油-卵黄-柠檬酸钠复合剂两种冻精复温后,精子存活率十分接近(P>0.05).表明两种保护剂对精子的保护效能大致相同.     

T-G型CPM及速缓冻贮法对人精子的影响

Ｔ Ｇ型冷冻保护剂 (ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅｍｅｄｉｕｍ ,ＣＰＭ )是一种新型无卵黄复合型ＣＰＭ ,我们采用Ｔ Ｇ型ＣＰＭ ,以速缓冻法冻贮 45份人精液近 1年 ,探讨Ｔ Ｇ型ＣＰＭ及其保护下速缓冻法对人精子结构和功能的影响。材料与方法　已育健康男子精液45份。 10份精液不加ＣＰＭ ,35份加Ｔ Ｇ型ＣＰＭ ,均以速缓冻法分别进行冻贮。每份精液冷冻前后行精液常规对比分析、精尾低渗肿胀试验、精子穿卵试验、精子染色体分析及精子超微结构观察。缓冻法ＣＰＭ 4℃预冷 ,与精液 1∶1混匀 ,4℃ 2 0ｍｉｎ后 ,置液氮蒸气距液面2ｃ…     

硝普钠对冷冻复温人精子顶体反应的影响

本文目的是研究复温温度和硝普钠(SNP)对冷冻精子复温后成活率和顶体反应的影响和机制，结果表明：对冻融精子37℃水浴复温效果优于41℃，高浓度SNP可减少精子成活率和顶体反应率，低浓度(0.2nmol/L)可促进精子成活率和顶体反应率，低浓度SNP可使Na+-K+-ATP酶活性增加，而对丙二醛(MDA)无影响     

冷冻复温后低温保护剂和精子激活剂对精子功能影响的研究

本文对冷冻复温后精子的功能进行了研究观察，发现精液保护剂对冷冻复温后精子的存活有明显的保护作用，而单纯应用卵黄或甘油溶液却对精子功能存在不利的影响。体外处理精子时应用ＡＴＰ，肌苷对精子的功能无任何的改善。     

冷冻复温后低温保护剂和精子激活剂对精子功能影响的研究

本文对冷冻复温后精子的功能进行了研究观察，发现精液保护剂（甘油－卵黄－枸橼酸钠）对冷冻复温后精子的存活有明显的保护作用，而单纯应用卵黄或甘油溶液却对精子功能存在不利的影响。体外处理精子时应用ＡＴＰ、肌苷对精子的功能无任何的改善。两种浓度的苯甲酸钠咖啡因（１２ｍＭ和４ｍＭ）对冷冻复温后精子在不同时间内的存活和ＣＭ穿透力均有明显的提高作用     

不同复温方法对液氮保存人主动脉瓣活性影响的实验研究

寻找一种能量大程度保持液氮贮存人同种主动脉瓣活性的复温方法。方法同种主动脉瓣随机分为６组Ⅰ组为新鲜同种主动脉瓣,Ⅱ－Ⅳ组经液氮保存３月后,分别采用４２℃水浴复温,。（２）（１．０±０．２）℃／ｍｉｎ（Ⅲ组）,     

不同复温方法对液氮保存人同种瓣活性影响的实验研究

寻找一种能最大程度保持液氮贮存人同种主动脉瓣活性的复温方法。方法同种主动脉瓣（ｎ＝３６）随机分为６组，Ⅰ组为新鲜同种主动脉瓣，Ⅱ～Ⅵ组经液氮保存３月后，分别采用①４２℃水浴复温（Ⅱ组），②（１．０±０．２）℃／ｍｉｎ（Ⅲ组），③（４．０±０．５）℃／ｍｉｎ（Ⅳ组），④（１０．０±２．０）℃／ｍｉｎ（Ⅴ组）；⑤（３０．０±４．５）℃／ｍｉｎ（Ⅵ组）。将同种主动脉瓣复温至４℃，对所有同种主动脉瓣进行台盼蓝染色活细胞计数、２４小时葡萄糖代谢率测定，氰化胸腺嘧啶脱氧核甙（３Ｈ－ＴｄＲ）参入、瓣膜组织培养。结果上述指标Ⅰ组显著优于其余各组（Ｐ＜０．０５），Ⅳ组优于Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ组（Ｐ＜０．０５）。组织培养Ⅰ组细胞生长优于其余各组，且早于各组３～４天。结论不同复温方法对同种主动脉瓣活性影响不同，以４℃／ｍｉｎ匀速复温法对同种主动脉瓣活性影响最轻。     

冷冻复温后处理对精子功能影响的研究Ⅰ．不同介质处理的影响

本文对冷冻复温后精子在不同介质中进行了离心孵育处理，结果显示∶精子营养液可使低温冷冻保存后复温的精子在较长时间内保持良好的活动率；细胞培养液１６４０能显著提高复温后精子的人宫颈粘液的穿透力（Ｐ＜０．０５）。细胞培养液Ｍ１９９、Ｈａｍ＇ｓＦ１０和正常精浆对复温后精子功能无明显改善作用。离心处理（２０００ｒ／ｍｉｎ）对复温后精子功能无损害作用。     

冷冻复温后处理对精子功能影响的研究：I.不同介质处理的影响

本文对冷冻复温后精子在不同介质中进行了离心孵育处理，结果显示：精子营养液可使低温冷冻保存后复温的精子在较长时间内保持良好的活动率；细胞培养液１６４０能显著提高复温后精子的人宫颈粘液的穿透力（Ｐ〈０．０５）。细胞培养液Ｍ１９９、Ｈａｍ’ｓＦ１０和正常精浆对复温后精子功能无明显改善作用。离心处理（２０００ｒ／ｍｉｎ）对复温后精子功能无损害作用。     

不同冷冻方法对人睾丸精子冷冻保存效果的研究

目的比较不同冷冻保护剂和不同冷冻载体对人睾丸精子的冷冻保存效果。方法选取在兰州大学第一医院生殖医学专科医院进行诊断性睾丸穿刺获得成熟活动精子的患者,以及行睾丸精子ICSI术后的患者,在知情同意下将剩余睾丸组织冷冻保存,共46例。将每例睾丸组织分为4份,随机分成4组进行冷冻:1.8ml冷冻管+甘油复合冷冻剂(A组,46例);1.8ml冷冻管+Fasrun冷冻保护剂(B组,46例);0.25 ml麦管+Fasrun冷冻保护剂(C组,46例);超微量冷冻麦管+Fasrun冷冻保护剂(D组,46例)。冷冻标本经液氮熏蒸后投入液氮,比较各组复苏后精子活力和复苏率。结果冷冻前各组的活动睾丸精子能够满足ICSI操作所用精子量;冷冻复苏后,C组和D组能够容易找到正常活动精子(≥0.1/200倍视野)的例数显著高于A组、B组(P0.05);D组解冻后运动精子复苏率显著高于A组、B组(P0.05),C组解冻后运动精子复苏率显著高于A组(P0.05)。结论应用改良的超微量冷冻麦管+Fasrun冷冻保护剂能够提高睾丸精子的冷冻复苏率。     

不同吸入麻醉药对人精子运动功能和体外获能的影响

目的 探讨不同吸入麻醉药对人精子运动功能和体外获能的影响.方法 成年男性精液经Percoll梯度离心法处理后,沉淀精子置于人精子体外获能培养基,调节精子密度(30～50)×106/ml,随机分为5组(n=7):对照组(C组)正常培养,2%、4%七氟醚组(SEV1、2组)和1.1%、2.2%异氟醚组(ISO1、2组)在37℃孵箱中分别暴露于2%、4%七氟醚和1.1%、2.2%异氟醚5 h,采用计算机辅助精子分析系统评价精子运动功能,记录精子运动活力[(a+b)%]、曲线速度(VCL)、直线速度(VSL)、平均速度(VAP)和头部侧向运动平均振幅(ALH),采用金霉素荧光染色技术评价精子体外获能情况.计算吸入麻醉药组各指标的相对抑制率.结果 与C组比较,SEV1组、SEV2组和ISO2组(a+b)%、VCL、VSL、VAP降低,SEV2组ALH、SEV2组和ISO1、2组精子获能程度降低(P＜0.05);与SEV1组比较,SEV2组(a+b)%、VCL、VSL、VAP降低,ISO1组(a+b)%、VCL、VSL、VAP的相对抑制率降低(P＜0.05);与ISO1组比较,ISO2组(a+b)%、VCL、VSL、VAP降低(P＜0.05);与SEV2组比较,ISO2组(a+b)%、VCL、VSL、VAP和ALH的相对抑制率降低(P＜0.05).结论 七氟醚和异氟醚均可呈剂量依赖性地抑制人精子运动功能和体外获能;七氟醚抑制精子运动功能的作用较异氟醚强.     

不同精液处理方法对精子动态参数和受孕率的影响

1 临床资料 不孕不育症78对,女方平均年龄29.1岁,男方平均年龄31.1岁,其中因排卵障碍经促排卵治疗后所致宫颈粘液不良者34例,阴道炎、宫颈炎所致不孕者14例,少精、弱精症者12例,免疫因素不育者11例,不明原因者7     

ZK 93426对小鼠和人精子获能的影响研究

目的探究小分子化合物ZK 93426对小鼠和人精子获能的影响及作用机制。方法采用蛋白质印迹技术(Western Blot)检测ZK 93426对小鼠精子和人精子获能相关的酪氨酸磷酸化的影响;运用Western Blot检测ZK 93426在正常以及缺少HCO3-,BSA,Ca~(2+)的获能缓冲液(modified Krebs-Ringer bicarbonate medium,HMB)中对获能的作用;选取精子特异钙离子通道CatSper抑制剂NNC 55-0396及PKA通路抑制剂H89进一步探索ZK 93426对于精子获能的机制。结果 ZK 93426对小鼠精子和人精子获能相关蛋白酪氨酸磷酸化均有促进作用,且在缺少Ca~(2+)的获能缓冲液中具有更明显的促进蛋白酪氨酸磷酸化作用。NNC 55-0396不会抑制ZK 93426对于获能相关的酪氨酸磷酸化的促进作用,而PKA抑制剂H89可抑制其作用。结论 ZK 93426对精子获能相关的蛋白酪氨酸磷酸化的促进作用不依赖CatSper通道,可能通过作用于PKA通路的上游发挥相应的作用。     

人精子体外氧化损伤对线粒体tRNA~(LeuUUR)基因的影响

目的:探讨活性氧(ROS)对人类精子线粒体tRNALeuUUR基因的氧化损伤。方法:采用Percoll梯度离心法筛选具有正常生理功能的精子,作为正常精子模型,并分为损伤组20例和对照组20例,分别加入次黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系或不予处理,37℃有氧环境中孵育60min。分别提取精子DNA,以Fpg酶切损伤碱基并采用接头介导PCR(LM-PCR)检测线粒体tRNALeuUUR基因的氧化损伤。采用Rhodamine(Rh123)荧光探针标记精子,通过流式细胞仪检测线粒体膜电位,观察精子的功能。结果:与对照组相比,损伤组精子孵育后线粒体膜电位明显降低[(116.27±11.72)%vs(64.00±4.88)%,P<0.05]。Fpg酶切和LM-PCR显示精子线粒体tRNALeuUUR基因损伤。结论:ROS可能通过对精子线粒体tRNALeuUUR基因氧化损伤而影响精子功能(线粒体膜电位明显降低),从而引起不育。     

体外rhTNF-a对人精子运动、线粒体功能影响的实验研究

~~体外rhTNF-α对人精子运动、线粒体功能影响的实验研究@边疆$三峡大学医学院男科学研究所!湖北宜昌443003 @郭贤坤$三峡大学医学院男科学研究所!湖北宜昌443003 @熊承良$华中科技大学同济医学院计划生育研究所!湖北武汉430030 @黎家华$三峡大学医学院病理学教研室!湖北宜昌443003 @田永红$华中科技大学同济医学院计划生育研究所!湖北武汉430030 @马华刚$华中科技大学同济医学院附属同济医院生殖医学中心!湖北武汉430030 @张燕$三峡大学医学院男科学研究所!湖北宜昌443003 @聂勇$三峡大学医学院男科学研究所!湖北宜…     

多巴胺再摄取抑制剂对小鼠和人精子运动的影响研究

目的 探究多巴胺再摄取抑制后对小鼠和人精子运动的影响及其作用机制.方法 精子经多巴胺再摄取抑制剂GBR 12909和GBR 12935处理后,应用计算机辅助精液分析系统(Computer-Assisted Semen Analysis,CASA)评估精子活力;伊红-苯胺黑染色检测精子存活率;通过荧光探针分别检测细胞内p...     

不同复温温度对-10℃处理的体外培养人成纤维细胞形态和Ⅰ型胶原代谢的影响

目的探讨不同复温温度对低温处理人成纤维细胞形态和Ⅰ型胶原代谢的影响。方法将体外培养的人成纤维细胞制成悬液后接种于培养皿中,随机分为对照组、20℃复温组、37℃复温组。将两个复温组培养细胞渐冷冻至-10℃制成冻伤模型,然后各自于20、37℃下复温,再与对照组一起继续培养,于伤前及伤后即刻、24、48、72、96h进行观察,每组各时相点9个培养皿。采用噻唑蓝法观察细胞活力的变化,以波长570nm下的吸光度(A)值表示;倒置相差显微镜观察细胞形态变化;免疫组织化学染色法及IMAGE-J图像分析软件测定细胞内胶原含量变化,以灰度值表示;双抗夹心亲和素-生物素酶联免疫吸附测定法测定细胞外胶原含量,以A值表示。结果20℃复温组细胞活力伤后先降低后升高,各时相点明显低于伤前值(0.95±0.16,P<0.05或0.01);细胞伤后即刻脱水,胞浆丢失、核浆比例增大,伤后72、96h细胞增生活跃,核分裂相增多,部分细胞出现漂浮后再贴壁现象,细胞排列杂乱;细胞外胶原含量较伤前值(96.4±2.9)呈先升高后降低再缓慢升高的趋势,细胞内胶原含量则较伤前值(0.0479±0.0027)呈先降低后逐渐升高趋势,与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05或0.01)。37℃复温组伤后细胞活力各时相点与伤前值相近(P>0.05);与对照组比较,其细胞形态、胶原代谢基本无变化(P>0.05).结论低温处理后细胞脱水是一种保护机制,适宜的复温条件能使细胞复苏;与20℃相比,37℃复温对细胞的损伤较轻。