血管生成素与绿色荧光蛋白融合蛋白的表达及纯化

目的:表达并纯化血管生成素(ANG)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白,以进一步探讨血管生成素的生物学功能。方法:PCR扩增人ANG基因,将其与EGFP基因融合后克隆到高表达载体pMFHT,构建了原核表达质粒pHIS鄄ANG鄄EGFP。该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并用金属螯合亲和层析纯化目的蛋白。激光共聚焦显微镜和Westernblot鉴定融合蛋白的表达情况。结果:重组蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,并从破菌上清中一步纯化目的蛋白,纯度可达95%以上。Westernblot分析表明表达产物具有良好的抗原性和特异性。诱导表达的菌体在激光共聚焦显微镜下可发射明亮的绿色荧光。结论:成功的表达并纯化了ANG鄄EGFP融合蛋白,利用EGFP的荧光示踪作用,该融合蛋白可用于血管生成素核转位和胞内共定位蛋白质研究。     

增强型绿色荧光蛋白原核表达纯化与多克隆抗体的制备

目的：进行增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的克隆、原核表达和纯化以及多克隆抗体的制备，为以后纯化EGFP融合蛋白奠定基础。方法：构建pGEX-4T3—EGFP重组质粒，在大肠杆菌BL21中进行原核表达，用亲和层析法纯化GST—EGFP，免疫BAB／c小鼠制备EGFP多克隆抗体。结果：①目的蛋白GST—EGFP表达量为8g／L。②获得纯抗体溶液5m1。浓度为0．4g／L。③EGFP抗体在1：100000稀释度时，Western blot检测条带清晰，背景干净。结论：通过优化诱导条件，利用大肠杆菌可低成本获得大量GST—EGFP。直接使用GST—EGFP融合蛋白免疫BAB／c小鼠，可在较短时间内大量制备EGFP多克隆抗体。     

增强型绿色荧光蛋白兔多克隆抗体的制备

目的:制备增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的兔多克隆抗体.方法:用谷胱甘肽-增强型绿色荧光蛋白(GST-EGFP)融合抗原加福氏完全佐剂背部皮内注射首次免疫新西兰大白兔,第28天用GST-EGFP融合抗原加福氏不完全佐剂同样剂量加强免疫,第35天时再次免疫.第49天心脏采血30 mL,4℃静置过夜,收集血清,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗血清中EGFP多克隆抗体的效价;免疫印迹法检测EGFP多克隆抗体的特异性;利用荧光免疫细胞化学检测该抗体和观察转染EGFP贴壁生长的大鼠脑皮层混合培养细胞中EGFP的表达.结果:ELISA检测EGFP多克隆抗体滴度最高为1:9 549;免疫印迹检测结果显示该抗体特异性高;荧光免疫细胞化学检测显示存混合培养细胞中EGFP呈阳性表达.结论:直接使用GST-EGFP融合蛋白免疫新西兰大白兔,可在较短时间内制备大量EGFP多克隆抗体.     

致病性大肠杆菌绿色荧光蛋白标记

目的:用增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记致病性大肠杆菌(enteropathogenic escherichia coli,EPEC),以方便研究细菌的黏附。方法:以真核表达载体p EGFP-C1为模板设计引物,采用PCR方法扩增EGFP基因并测序后,克隆入原核表达质粒载体p Trc99a,转染EPEC,用荧光显微镜观察IPTG诱导后EPEC对Hep-2细胞的黏附及荧光表达情况。结果:成功构建原核表达质粒p Trc99a-EGFP和菌株EPEC/EGFP,黏附到Hep-2细胞表面的细菌克隆能够表达绿色荧光蛋白。结论:对EPEC进行了EGFP标记,为计数细菌的黏附提供方便。     

瘦素与绿色荧光蛋白融合基因的合成及其高效表达

目的: 为了便于追踪瘦素(Leptin)在体内的去向,对其进行体内定位,设计合成Leptin荧光分子蛋白探针.方法:用PCR技术将Leptin cDNA与绿色荧光蛋白cDNA构建成融合基因LG,然后将其克隆进原核表达载体pET3c中,构建成原核表达工程菌BL21(DE3)/pET3c-LG.用Western-blot杂交检测重组蛋白的免疫原性,用荧光显微镜观察融合蛋白及其诱导菌休的发光活性.结果:DNA测序结果证实设计合成的融合基因与预期一致;构建的工程菌BL21(DE3)/pET3c-LG获得了表达,融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的40%以上;Western-blot杂交检测表明重组蛋白具有Leptin的免疫原性;经IPTG诱导后的菌体及蛋白粗提液在荧光显微镜下可观察到其能发射出强烈的绿色荧光.结论:融合基因在大肠杆菌中实现了高效表达,表达的融合蛋白具Leptin的免疫原性和GFP的发光特性.为利用绿色荧光蛋白标记Leptin在动物体内的药物治疗的研究提供了一种新的途径.     

大鼠肝脏F蛋白基因的克隆和表达

目的获得大鼠肝脏F蛋白基因克隆(F-protein’s cDNA);利用原核(大肠杆菌)表达系统表达大鼠肝脏F蛋白。方法提取大鼠肝脏总RNA,对其进行反转录和PCR(RT-PCR)扩增出目的基因(F-protein’s cDNA),然后将其与pUCm-T载体进行连接获得克隆质粒pUCm-T-F并转化到大肠杆菌DH5α中;将测序结果正确的克隆片断重新与表达载体pET-15b连接,获得F抗原表达质粒pET15b-F并将其转化到表达菌株BL21(DE3)pLysS中,用1mmol/L IPTG诱导其表达。结果RT-PCR扩增出的目的基因(F-protein’s cDNA),经测序证明与Gene-bank上提供的F蛋白cDNA序列完全一致;表达后的全菌蛋白进行SDS-PAGE电泳检测,目的蛋白分子量大小约为43 kD,与预期值相符,表达量可达全菌总蛋白量的40%。结论表达的目的蛋白经His-tag柱进行亲和层析纯化,SDS-PAGE检测得到了不含其他杂蛋白的单一F蛋白条带,与豚鼠抗人F蛋白抗血清反应成阳性,说明我们经基因工程方法得到的纯化的F蛋白有免疫活性。     

杜氏盐藻核基质附着区结合蛋白基因的克隆及原核表达

目的:构建杜氏盐藻核基质附着区(MAR)结合蛋白的原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),表达并纯化融合蛋白.方法:根据GenBank上杜氏盐藻MAR结合蛋白的cDNA全长序列设计出含有特定酶切位点的引物,PCR法获得MAR结合蛋白基因序列全长,将其克隆至载体pMD18-T中.酶切连接到pET-28a(+)上构建原核表达载体pET-MBP,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)诱导其表达,Western blotting检验其表达结果.结果:重组质粒经酶切、PCR、测序鉴定,成功构建了原核表达载体pET-MBP,对表达的融合蛋白的Western blotting分析结果表明表达的蛋白质为目的蛋白.Ni2+亲和层析法纯化蛋白质,纯化后目的蛋白在总蛋白中的含量约为70%.结论:成功地克隆杜氏盐藻MAR结合蛋白基因的全长并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,且纯化了MAR结合蛋白的融合蛋白.     

人GST-OPGL融合蛋白的原核表达与抗体制备

目的:克隆人骨保护素配体(OPGL)编码区基因,构建融合表达载体,在大肠杆菌中表达,并制备抗体。方法:采用RT-PCR法得到人骨保护素配体(OPGL)编码区cDNA,克隆入原核表达载体pGEX-4T-3,转化大肠杆菌感受态细胞JM 109,0.1mMβ-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后收集菌体蛋白,行SDS-PAGE电泳。将此融合蛋白免疫新西兰兔,W estern b lot鉴定。结果:获得人骨保护素配体编码区cDNA,构建原核表达载体pGEX-OPGL,转化菌株可表达人GST-OPGL蛋白,蛋白分子量约为43KD,蛋白表达量约为菌体总蛋白的21%。W estern b lot检测表明获得了免疫活性强的兔抗人的多克隆抗体。结论:获得人骨保护素配体编码区cDNA,在大肠杆菌中表达了人GST-OPGL融合蛋白,并获得了高效多抗。     

TAT-EGFP融合蛋白表达载体的构建及表达

目的:构建TAT-EGFP原核表达载体,在E.coli BL21中高效表达并纯化.方法:人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a后得到pET28a-TAT重组质粒,再连接绿色荧光蛋白(EGFP)基因,组成pET28a-TAT-EGFP重组表达子.转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达.表达产物用十二烷基硫钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白.结果及结论:成功地构建了TAT-EGFP融合蛋白的原核表达载体,在诱导后获得了高效表达并纯化,为进一步研究TAT的蛋白转导作用奠定了基础.     

增强型绿色荧光蛋白原核表达载体的构建及表达

目的 构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为标记的原核表达栽体,并观察EGFP基因在大肠杆菌中的表达情况.方法 据已知的EGFP基因序列,设计引物,并引入Nde Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点.采用PCR技术从含有EGFP的质粒pEGFP-C1中克隆EGFP编码序列;将其亚克隆入表达载体pTWIN1,得到以EGFP为标记的原核表达载体pTWIN-EGFP.转化大肠杆菌ER2566菌株,IPTG诱导EGFP基因表达.结果 经过IPTG诱导后,细菌培养物在长波紫外线的照射下,发出明亮的绿色荧光.结论 成功构建了原核表达载体pTWIN-EGFP,为应用EGFP作为报告基因和筛选标记奠定了实验基础.     

Egr-1启动子辐射诱导的基因表达特性

目的:研究电离辐射作用下早期生长反应因子1(Egr-1)启动子调控增强绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因在人结肠癌细胞SW480中的表达。方法:利用基因重组手段构建质粒Egr-1-EGFP;阳离子脂质体介导转染人结肠癌细胞SW480,给予不同剂量γ射线照射,流式细胞仪检测照射后不同时间点EGFP的表达。结果:电离辐射能够诱导Egr-1启动子调控下游基因的表达,且6 Gy照射后最为明显,在照射后24 h达到高峰。结论:Egr-1启动子具有电离辐射诱导特性。     

SARS病毒E蛋白基因与EGFP基因在BHK-21细胞中的融合表达

目的：构建SARS病毒E蛋白基因的真核表达载体，观察E蛋白基因在BHK-21细胞中的正常表达及定位。方法：用PCR方法扩增E蛋白基因，上、下游引物两端分别设计EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点，产物双酶切后定向克隆于pEGFP-N1载体，构建真核表达载体pEGFP-E，脂质体法转染BHK-21细胞，荧光显微镜观察E蛋白基因的表达。结果：经酶切和DNA序列测定鉴定，E蛋白基因正确插入到增强绿荧光蛋白EGFP基因上游，荧光显微镜显示E蛋白表达于细胞浆内，包膜上也有分布。结论：在BHK-21细胞中成功表达了SARSCovE-EGFP融合蛋白，蛋白定位于细胞浆内。     

增强型绿荧光蛋白基因修饰永生化大鼠肝细胞的实验研究

目的：建立携带示踪标记的永生化大鼠肝细胞系。方法：用脂质体转染法将增强型绿荧光蛋白（EGFP）基因转入永生化大鼠肝细胞中。结果：转染3d后，在荧光显微镜下观察，对照组肝细胞不发荧光；实验组肝细胞发绿荧光，转染率为41%，经G418筛选后得到稳定表达的肝细胞。结论：应用基因转染技术将EGFP基因转入永生化大鼠肝细胞中并获得稳定表达。     

pQE-EGFP原核表达载体的构建及其表达和鉴定

目的:利用分子克隆技术构建原核表达载体pQE-EGFP,在大肠埃希菌中高效表达与鉴定。方法:以质粒pEGFP-N2为模板,采用PCR方法特异性扩增增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因序列,将其克隆于原核表达载体pQE-31,所构建的重组质粒经测序鉴定后转化大肠埃希菌JM109,用异丙基巯基半乳糖(IPTG)诱导表达;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting鉴定表达蛋白质。结果:PCR扩增得到了EGFP全长结构基因。所构建的pQE-EGFP重组质粒经酶切及测序鉴定结果与设计序列一致;转化大肠埃希菌JM109,经IPTG诱导后,目的蛋白表达率约为25%;SDS-PAGE、Western blotting初步测定目的蛋白的相对分子质量约为28 500,与理论预期值一致。结论:pQE-EGFP重组质粒的成功构建、表达和鉴定为TAT-EGFP融合蛋白穿透细胞能力的研究奠定了基础。     

超声联合微泡促进大鼠损伤跟腱及肉芽组织局部基因转染的实验研究

目的 探讨超声联合微泡促进基因局部转染大鼠损伤跟腱及肉芽组织的最适超声转染条件。方法 建立双侧大鼠跟腱损伤模型,在大鼠双侧损伤跟腱内局部注射微泡与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)质粒混合溶液,应用不同输出功率、占空比及超声辐照时间的超声辐照双侧损伤处跟腱,根据荧光染色及免疫组化染色下EGFP表达结果判断转染效果。根据基因转染效果最高,同时正常组织损伤坏死最小筛选出最合适的照射条件。将大鼠分为4组:①质粒+微泡+超声辐照组,②质粒+微泡组,③质粒+超声辐照组,④单纯质粒组。根据前几步所选取的条件辐照损伤跟腱,观察跟腱及肉芽组织内的EGFP表达情况及正常组织损伤情况。 结果 在超声输出功率2 W/cm2、占空比20%、超声辐照10 min条件下,跟腱及肉芽组织内EGFP表达明显,且无明显正常组织损伤。超声辐照+微泡+质粒组跟腱及肉芽组织内EGFP表达高于其余3组（P<0.05）,其余各组间差异无统计学意义。结论 在适合的超声辐照条件下,超声联合微泡能明显增强损伤肌腱及肉芽组织的基因转染效果,且不损伤正常组织,这为肌腱损伤的基因治疗的可行性提供了实验基础。     

针对Toll样受体4基因的小发夹结构RNA对RAW264.7细胞炎症因子分泌的抑制作用

目的构建针对Toll样受体(TLR)4 mRNA的小发夹结构RNA(shRNA)真核表达载体pEGFP-siRNA/TLR4,检测该shRNA诱导的RNA干扰(RNAi)对脂多糖刺激RAW264.7细胞分泌炎症因子的抑制作用,以探讨针对TLR4基因的RNAi对RAW264.7细胞炎症反应的抑制作用.方法构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)及shRNA克隆位点的质粒pEGFP-H1/siRNA,运用网络工具siRNA Wizard(http//www.simawizard.com/)设计针对TLR4 mRNA的寡核苷酸片段.将其克隆入pEGFP-H1/siRNA,构建表达EGFP及TLR4-shRNA的真核表达质粒pEGFP-H1/TLR4-siRNA.运用脂质体转染技术将pEGFP-H1/TLR4-siRNA转染至培养的小鼠巨噬细胞系RAW264.7,观察细胞系中荧光蛋白的表达强度;再运用脂多糖刺激转染的RAW264.7细胞,运用ELISA方法检测该细胞系分泌炎症因子水平的变化.结果质粒pEGFP-H1/siRNA及pEGFP-H1/TLR4-siRNA分别用Bbs Ⅰ和MluⅠ酶切电泳后,前者出现4.9 kb和340 bp的的条带,后者出现5.0 kb和220 bp的条带,与实验设计的质粒长度一致,且测序证实克隆序列正确.将pEGFP-H1/TLR4-siRNA转染至RAW264.7细胞后,EGFP的表达率为50%±8%.用脂多糖刺激后,TLR4-SiRNA转染组细胞培养液TNF-α水平(2 h825 pg/ml±136 pg/ml;8 h2190 pg/ml±359 pg/ml)明显低于对照siRNA转染组(2 h1179 pg/ml±240 pg/ml;8 h4720 pg/ml±227 pg/ml,均P＜0.01).结论针对TLR4 mRNA的shRNA可能通过RNAi机制对脂多糖诱导的RAW264.7细胞炎症因子的分泌有明显的抑制作用.     

肿瘤基因靶向治疗载体的构建和鉴定

目的构建并鉴定人端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transeriptase,hTERT)基因核心启动子调控的EGFP基因表达载体。方法从体外培养的HepG2细胞中提取全基因组DNA,以此为模板,克隆得到hTERT基因启动子核心区基因片段(hTERTp)。设计引物以质粒pEGFP-N1为模板利用PCR扩增得到EGFP基因片段,将两者通过搭桥PCR扩增得到hTERTp-EGFP片段,经SacⅠ、XbaⅠ双酶切定向插入到pGL3-Enhancer载体中,得到重组表达载体pGL3-hTERTp-EGFP。将该表达载体瞬时转染HELF细胞和HeLa细胞后观察EGFP蛋白表达情况。结果重组质粒经测序后确认插入序列正确无误,瞬时转染48h后在HeLa细胞中可以看到EGFP蛋白的大量表达,而在HELF细胞中未见表达。结论成功构建了可以通过hTERT核心启动子调控治疗基因在肿瘤细胞中特异表达的重组表达载体pGL3-hTERTp-EGFP。     

绿色荧光蛋白与鼠盘状结构域受体2融合基因的构建与表达

目的: 构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组表达质粒DDR2/pEGFP-N3 并分析该融合基因在活细胞中的表达.方法: 利用反转录PCR扩增鼠盘状结构域受体2(DDR2)cDNA,并重组于pEGFP-N3载体.脂质体体外瞬时转染培养的COS-7细胞,RT-PCR和Western Blot分析该融合基因的表达.结果: 从NIH3T3细胞中克隆到DDR2基因的cDNA,并成功构建DDR2-EGFP融合表达载体.以该质粒转染细胞48 h后,RT-PCR和Western Blot分析表明该融合基因能够在COS-7细胞中正确表达.结论: DDR2/pEGFP-N3融合基因真核表达载体构建成功.该融合蛋白具有DDR2和EGFP双重特性,为进一步研究DDR2的功能提供了工具.     

survivin基因启动子驱动的肿瘤特异性腺病毒载体的构建

目的:构建肿瘤特异性启动子驱动的腺病毒载体,检测survivin基因启动子在喉癌细胞中的特异表达活性。方法:PCR扩增survivin启动子,构建分别携带survivin启动子和CMV启动子的真核表达载体pCMV-EGFP和pSurp-EGFP,体外连接法制备重组腺病毒Ad-SP-EGFP和Ad-CMV-EGFP,后转染Hep-2细胞及血管内皮细胞ECV304,荧光显微镜下观察EGFP表达。结果:成功构建survivin基因启动子的腺病毒载体;Ad-SP-EGFP转染后荧光镜下见Hep-2细胞发出较强的绿色荧光,而ECV304细胞无表达。结论:成功制备肿瘤特异性survivin启动子驱动的腺病毒,为进一步开发肿瘤的特异性基因治疗奠定了实验基础。