增强型绿色荧光蛋白基因在鸡胚盘细胞中的表达

从鸡胚发育为X期的鸡蛋中取胚盘细胞,经原代培养后用带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）作为标记基因的真核表达质粒pLEGFP-C1转染鸡胚细胞观察GEFP基因的表达情况,结果在不同条件下的活细胞均见有EGFP基因的稳定表达,这提示通过EGFP基因转染鸡胚盘细胞可连续且直接观察活细胞中的表达,为转基因鸡的研究提供一实用的标记基因。     

增强型绿色荧光蛋白原核表达载体的构建及表达

目的 构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为标记的原核表达栽体,并观察EGFP基因在大肠杆菌中的表达情况.方法 据已知的EGFP基因序列,设计引物,并引入Nde Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点.采用PCR技术从含有EGFP的质粒pEGFP-C1中克隆EGFP编码序列;将其亚克隆入表达载体pTWIN1,得到以EGFP为标记的原核表达载体pTWIN-EGFP.转化大肠杆菌ER2566菌株,IPTG诱导EGFP基因表达.结果 经过IPTG诱导后,细菌培养物在长波紫外线的照射下,发出明亮的绿色荧光.结论 成功构建了原核表达载体pTWIN-EGFP,为应用EGFP作为报告基因和筛选标记奠定了实验基础.     

增强型绿色荧光蛋白-C1转染示踪骨髓间充质干细胞

目的：应用增强型绿色荧光蛋白-C1（enhanced green fluorescent protein,pEGFP-C1）标记骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells,MMSCs）,以期为MMSCs的体内移植提供示踪方法。方法：在体外分离培养大鼠MMSCs,流式细胞仪检测细胞表型,以脂质体介导法转染质粒增强型绿色荧光蛋白基因,荧光显微镜观察基因表达。结果：pEGFP-C1在基因转染24 h后开始表达,48-72 h达高峰,12-14 d后有较多的表达。结论：由脂质体介导的质粒pEGFP-C1可较为安全、有效地转染MMSCs,是一种较为理想的干细胞示踪方法。     

针对增强型绿色荧光蛋白RNA干扰表达载体的构建和鉴定

目的：构建针对增强型(EGFP)的pSUPER siRNA(small interferencing RNA)表达载体,并在哺乳动物细胞COS-7细胞中观察其干扰效果．方法：设计针对EGFP编码区的寡核苷酸链,体外退火后克隆入经Bgl Ⅱ和HindⅢ双酶切线性化的干扰载体pSUPER中,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定．通过脂质体介导,将重组干扰质粒与pIRESE2-EG-FP瞬时共转染COS-7细胞,48h后荧光显微镜下观察干扰效果．结果：经酶切鉴定及DNA序列测定证实,重组质粒中已插入了目的基因片段．瞬时共转染后荧光显微镜观察结果显示：只转染pIRES2-EGFP及共转染pIRES2-EGFP和空载体pSUPER的COS-7细胞中有大量的EGFP表达．而共转染pIRES2-EGFP和pSUPER-R237、pSUPER—R304、pSUPER-R447的COS-7细胞中发出荧光的细胞数量明显减少,荧光强度也明显降低．结论：成功构建了针对EGFP的RNA干扰表达载体pSUPER—R237,pSUPER—R304和pSUPER—R447,并与pIR—ESE2一EGFP瞬时共转染COS-7细胞,有效地抑制了EGFP在哺乳动物细胞中的表达。     

LMP-1增强型绿色荧光蛋白真核表达载体的构建

目的 构建EB病毒潜伏膜蛋白-1(LMP-1)增强型绿色荧光蛋白真核表达载体.方法 用PCR的方法从EB病毒阳性的鼻咽癌组织中调取EB病毒潜伏膜蛋白-1的基因,然后定向克隆到真核表达质粒pEGFP-C3上,以此构建成重组质粒pEGFP-C3-LMP1.结果 经酶切及测序鉴定,确定已获得重组质粒pEGFP-C3-LMP1.结论 在增强型绿色荧光蛋白真核表达质粒中已成功克隆了EB病毒LMP-1基因.     

起始Met对增强型绿色荧光蛋白功能的影响

目的以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）中起始Met为例,初步探索组成EGFP的不同氨基酸对EGFP发光功能的影响,为绿色荧光蛋白的变体改造提供理论基础。方法运用分子生物学技术去掉质粒pEGFP—N1中编码EGFP的起始氨基酸Met的密码子,将beta—actin的上游的435bp序列引入突变型EGFP阅读框的上游,将此融合型质粒转染A549细胞后,运用一系列检测方法检测融合蛋白的表达水平及转染细胞的的发光强度。结果突变掉起始Met后,EGFP丧失了发光功能。结论起始Met对保持EGFP的发光功能有重要作用,提示Met作为绝大多数蛋白质的生物合成起始氨基酸,可能是维持某些蛋白质的正确的空间结构所必须的氨基酸。     

绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的克隆及高效表达

在大肠杆菌中克隆及高效表达绿色荧光蛋白基因。方法；ＰＣＲ法克隆ＧＦＰ－Ｓ６５ＴｃＤＮＡ并改造其两端的限制性内切酶位点，构建重组原核表达载体ｐＲＳＥＴ－ＧＦＰＳ６５Ｔ。结果；在ＩＰＴＧ诱导条件下，ＧＦＰ－Ｓ６５Ｔ的表达量占细菌蛋白的 上。细菌培养物及其超声上清在长波紫外线的照射下，发出明亮的绿色荧光。     

血管生成素与绿色荧光蛋白融合蛋白的表达及纯化

目的:表达并纯化血管生成素(ANG)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白,以进一步探讨血管生成素的生物学功能。方法:PCR扩增人ANG基因,将其与EGFP基因融合后克隆到高表达载体pMFHT,构建了原核表达质粒pHIS鄄ANG鄄EGFP。该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并用金属螯合亲和层析纯化目的蛋白。激光共聚焦显微镜和Westernblot鉴定融合蛋白的表达情况。结果:重组蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,并从破菌上清中一步纯化目的蛋白,纯度可达95%以上。Westernblot分析表明表达产物具有良好的抗原性和特异性。诱导表达的菌体在激光共聚焦显微镜下可发射明亮的绿色荧光。结论:成功的表达并纯化了ANG鄄EGFP融合蛋白,利用EGFP的荧光示踪作用,该融合蛋白可用于血管生成素核转位和胞内共定位蛋白质研究。     

慢病毒介导的增强型绿色荧光蛋白报告基因对间充质干细胞的标记

目的 探讨慢病毒介导的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记间充质干细胞(MSC)是否影响其细胞生物学特性,以及EGFP基因能否持久稳定表达.方法 以不同病毒感染复数(MOI)实行EGFP慢病毒对MSC的感染,通过流式细胞分析法(FACS)检测EGFP的阳性率,并在荧光显微镜下观察EGFP在MSC的表达情况;通过锥虫蓝染色、MTT比色法、Hoechst染色和FACS检测细胞活力、增殖、凋亡和周期;EGFP慢病毒感染MSC体外持续培养2、4、8、16周时通过FACS检测EGFP的阳性率和荧光强度,以评价EGFP基因在MSC表达的稳定性.结果 EGFP慢病毒以MOI=20感染MSC 96 h,EGFP阳性率达97.39%±0.68%;与对照MsC相比,EGFP慢病毒感染MSC时,对细胞活力、增殖、凋亡和周期均没有影响(P＞0.05);EGFP-MSC在体外持续培养2,4、8、16周,EGFP阳性率分别为97.50%±0.54%、97.32%±0.51%、97.39%±0.11%、97.48%±0.13%,荧光强度(A值)分别为440 ±13、445±12、458±13、456±16,均能够保持稳定水平.结论 EGFP慢病毒能够高效标记MSC,并且不影响其生物学特性,EGFP基因在MSC能够持久稳定表达,可以用于下一步的细胞示踪研究.     

慢病毒载体介导的增强型绿色荧光蛋白转基因小鼠的建立

目的 以慢病毒作为载体,制作增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转基因小鼠,建立慢病毒介导的转基因动物制备技术平台.方法 慢病毒包装采用三质粒系统.3个质粒分别为转基因质粒FUGW、病毒结构蛋白表达质粒psPAX2以及病毒包膜蛋白表达质粒pMD2.G.病毒包装时,用磷酸钙沉淀法将三质粒共转染来源于人胚肾细胞系的293FT细胞,培养48 h后,收取含病毒的上清,并通过高速离心浓缩病毒.将含浓缩病毒液作梯度稀释后感染293FT细胞,通过流式细胞计数仪测定病毒滴度.用显微注射法将浓缩的病毒液注射至FVB/N小鼠1-细胞期胚胎透明带下.在荧光显微镜下观察胚胎EGFP的表达.将注射后发育至2-细胞期的胚胎移植至假孕受体母鼠,得F0代小鼠.通过紫外光照射观测EGFP在小鼠活体内的表达水平.结果 病毒液浓缩前的滴度≥106 TU/ml(transducing unit,TU),经过高速离心对病毒进行浓缩和纯化,其滴度达到109 TU/ml以上.将浓缩病毒液注射至小鼠1-细胞期胚胎透明带下,注射后胚胎的2-细胞期卵裂率为81.8%(1 189/1 453),利用荧光显微镜分别在注射后60、84、132 h观察胚胎,均发现有较强荧光.在2-细胞期,每一视野下胚胎阳性率＞90%,说明包装的病毒成功并高效地转染小鼠胚胎.胚胎移植后假孕母鼠妊娠率为42.9%(12/28),首建鼠阳性率为60.8%(73/120),转基因小鼠的总体研制效率(转基因小鼠数/注射胚胎数)为5.0%(73/1 453).将F0代EGFP转基因小鼠分别与野生型小鼠交配,在其F1、F2、F3代小鼠中均获得了EGFP阳性小鼠,阳性率分别为91.4%(32/35)、93.8%(30/32)、93.1%(27/29).结论 通过慢病毒载体感染小鼠1-细胞期胚胎可有效地制备转基因小鼠.我们已初步建立了慢病毒介导的转基因小鼠制备技术体系.     

增强型绿色荧光蛋白基因在永生化大鼠神经前体细胞株的表达

目的:研究重组腺相关病毒载体介导的增强型绿色荧光蛋白基因在永生化大鼠神经前体细胞的转染效率及其表达情况. 方法:携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组腺相关病毒转染永生化大鼠神经前体细胞,持续观察转基因神经前体细胞绿色荧光蛋白的表达情况,并计算转染效率. 应用巢蛋白抗体和抗猿肾病毒40大T抗原抗体进行细胞鉴定,50 mL/L胎牛血清诱导细胞分化后,应用神经元和星形胶质细胞特异性标志物抗体检测其分化能力. 结果:荧光显微镜观察显示转染后24 h神经前体细胞即有绿色荧光蛋白表达,转染后72 h,大部分细胞表达绿色荧光蛋白,转染效率可达90%. 经传代培养8 wk后,表达绿色荧光蛋白的阳性细胞仍可高达70%～75%. 免疫细胞化学结果显示转绿色荧光蛋白神经前体细胞巢蛋白和抗猿肾病毒40大T抗原抗体染色均为阳性,50 mL/L胎牛血清可诱导其分化为神经元和星形胶质细胞. 结论:携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组腺相关病毒可高效转染永生化大鼠神经前体细胞,并可在细胞中长期稳定地表达,绿色荧光蛋白作为良好的示踪剂可应用于神经前体细胞的体内移植.     

带绿色荧光蛋白的米非司酮诱导表达腺病毒载体的构建及表达

目的在基因表达和基因治疗研究中,目的基因过度表达或不适当的表达将影响实验结果,实现对目的基因表达时间和表达水平的精确调控是关键问题。文中旨在构建带绿色荧光蛋白（enhanced green fluorecene eprotein,EGFP）并可经米非司酮诱导表达的重组腺病毒载体,以期用于基因治疗研究。方法酶切含有EGFP基因和启动子以及含有米非司酮调控系统的质粒pRS-17,亚克隆到穿梭质粒PDC313上,筛选阳性克隆,测序鉴定正确,将其与Admax腺病毒包装系统的辅助质粒共转染293细胞后,构建出可调控的重组腺病毒载体,利用报告基因引物对病毒进行鉴定,扩增后用氯化铯密度梯度离心纯化病毒,用最终稀释法测定其滴度,并在SW620细胞中检测其基因调控效果。结果成功地构建了携带有米非司酮调控系统的可调控腺病毒载体Ad-RUEGFP,病毒滴度达到6．6×10^10pfu／ml。当给予诱导剂米非司酮后,腺病毒载体可以诱导表达EGFP,两者在一定范围内呈正比,而没有米非司酮时,几乎无报告基因的表达。结论腺病毒Ad—RUEGFP能调控外源基冈的表达,为下一步体内基因治疗实验奠定了实验基础。     

增强型绿色荧光蛋白原核表达纯化与多克隆抗体的制备

目的：进行增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的克隆、原核表达和纯化以及多克隆抗体的制备，为以后纯化EGFP融合蛋白奠定基础。方法：构建pGEX-4T3—EGFP重组质粒，在大肠杆菌BL21中进行原核表达，用亲和层析法纯化GST—EGFP，免疫BAB／c小鼠制备EGFP多克隆抗体。结果：①目的蛋白GST—EGFP表达量为8g／L。②获得纯抗体溶液5m1。浓度为0．4g／L。③EGFP抗体在1：100000稀释度时，Western blot检测条带清晰，背景干净。结论：通过优化诱导条件，利用大肠杆菌可低成本获得大量GST—EGFP。直接使用GST—EGFP融合蛋白免疫BAB／c小鼠，可在较短时间内大量制备EGFP多克隆抗体。     

增强型绿色荧光蛋白与肝细胞生长因子共表达载体的构建及表达

目的:构建增强型绿色荧光蛋白与人肝细胞生长因子基因的真核共表达载体并鉴定其在真核细胞中的表达.方法:在HGF两端设计并合成分别带有Sac I和BamH I两酶切位点的一对引物,对pcDNA3.0-HGF载体进行PCR扩增,将扩增出的目的基因与pMD18-T载体相连,并转化大肠肝菌,进行菌落PCR、酶切分析和DNA测序鉴定重组克隆.用Sac I和BamH I将目的片段用双酶切切下后,纯化提取凝胶中的目的DNA片断,然后插入pIRES-EGFP相应的酶切位点,构建pIRES-EGFP/HGF真核表达载体并再进行酶切鉴定.将重组质粒用脂质体法转染至人脐带血管内皮细胞(HUVEC)中,荧光显微镜下观察EGFP在细胞内的表达及Western blotting检测HGF的表达情况.结果:重组克隆载体内的目的片段序列与GENE BANK上报道的HGF基因序列完全一致.pIRES-EGFP/HGF酶切鉴定结果与预期结果一致.荧光显微镜下观察可见转染后的细胞有荧光出现.Western blotting结果表明HGF基因得到了有效表达.结论:本实验成功构建EGFP和HGF真核共表达载体并可在真核细胞中有效表达.     

pQE-EGFP原核表达载体的构建及其表达和鉴定

目的:利用分子克隆技术构建原核表达载体pQE-EGFP,在大肠埃希菌中高效表达与鉴定。方法:以质粒pEGFP-N2为模板,采用PCR方法特异性扩增增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因序列,将其克隆于原核表达载体pQE-31,所构建的重组质粒经测序鉴定后转化大肠埃希菌JM109,用异丙基巯基半乳糖(IPTG)诱导表达;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting鉴定表达蛋白质。结果:PCR扩增得到了EGFP全长结构基因。所构建的pQE-EGFP重组质粒经酶切及测序鉴定结果与设计序列一致;转化大肠埃希菌JM109,经IPTG诱导后,目的蛋白表达率约为25%;SDS-PAGE、Western blotting初步测定目的蛋白的相对分子质量约为28 500,与理论预期值一致。结论:pQE-EGFP重组质粒的成功构建、表达和鉴定为TAT-EGFP融合蛋白穿透细胞能力的研究奠定了基础。     

增强型绿色荧光蛋白与Rb94基因共表达载体的构建和表达

目的 构建增强型绿色荧光蛋白与Rb94基因的真核共表达载体并鉴定其在真核细胞中的表达.方法 用PCR技术对cDNA-Rb质粒中的目的基因片段进行扩增,使用BamHⅠ和SalⅠ进行双酶切,切胶回收DNA片段.将其连接入pEGFP-C1,构建pEGFP-C1/Rb94真核表达载体并再进行酶切鉴定.将重组质粒用脂质体转染法转染至人视网膜母细胞瘤细胞(HXO-Rb44)中,荧光显微镜下观察EGFP在细胞内的表达,Western blot检测Rb蛋白的表达情况,流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果 重组克隆载体内的目的片段序列与Rb94基因序列完全一致.pEGFP-C1/Rb94酶切鉴定结果与预期结果一致.荧光显微镜下观察可见转染后的细胞有荧光出现.Western blot检测结果表明Rb94基因得到了有效表达.流式细胞仪检测结果显示,含Rb94基因的细胞凋亡率为(21.17±0.45)%,明显高于其他组(P<0.05).结论 成功构建EGFP和Rb94真核共表达载体,并可在真核细胞中有效表达,Rb94对视网膜母细胞瘤细胞有明显抑制生长作用.     

携EGFP的人低氧诱导因子-1α真核表达载体的构建及表达

目的 构建携EGFP的人低氧诱导因子（HIF-1α）真核表达载体，为研究人HIF-1α基因对冠心病的血管新生作用奠定基础。方法 采用分子克隆技术，KpnⅠ、XbaⅠ双酶切pcDNA3．1／V5-Hin—HIF-1仅获得HIF-1仅cDNA，克隆到质粒pcDNA3．1（＋），得到质粒pcDNA3．1（＋）-HIF-1α，以KpnⅠ，ApaⅠ双酶切质粒pcDNA3．1（＋）-HIF-1仅获得HIF-1α cDNA，克隆到质粒pEGFP—c1得到pEGFP-HIF-1α-c1质粒。脂质体法转染HEK293细胞，用荧光显微镜和Western blotting检测EGFP和HIF-1α 在HEK293细胞的表达。均显示融合蛋白在细胞中表达。结果经酶切鉴定及PCR证实重组pEGFP-HIF-1α-c1质粒构建成功。荧光显微镜和Westom blotting显示EGFP和HIF-1α融合蛋白在HEK293细胞中表达。结论 成功构建重组真核表达载体pEGFP—HIF-1α—c1并在HEK293细胞表达，为冠心病的HIF-1基因治疗研究奠定更直观的基础。     

幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A绿色荧光蛋白真核表达载体的构建

目的构建含幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A（CagA）基因片段的绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-CagA。方法从幽门螺杆菌细胞株中扩增出CagA基因片段,经回收、纯化,连接到质粒pGEM-T上,测序、酶切后与质粒pEGFP-C3连接,脂质体法将pEGFP-C3-CagA转染入胃癌细胞株BGC823,用荧光显微镜观察转染的细胞。结果通过测序、酶切证明CagA插入质粒正确,构建出载体pEGFP-C3-CagA,转染后经荧光显微镜观察到胃癌细胞株BGC823中有绿色荧光。结论成功构建表达CagA的真核绿色荧光载体。     

绿色荧光蛋白与鼠盘状结构域受体2融合基因的构建与表达

目的: 构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组表达质粒DDR2/pEGFP-N3 并分析该融合基因在活细胞中的表达.方法: 利用反转录PCR扩增鼠盘状结构域受体2(DDR2)cDNA,并重组于pEGFP-N3载体.脂质体体外瞬时转染培养的COS-7细胞,RT-PCR和Western Blot分析该融合基因的表达.结果: 从NIH3T3细胞中克隆到DDR2基因的cDNA,并成功构建DDR2-EGFP融合表达载体.以该质粒转染细胞48 h后,RT-PCR和Western Blot分析表明该融合基因能够在COS-7细胞中正确表达.结论: DDR2/pEGFP-N3融合基因真核表达载体构建成功.该融合蛋白具有DDR2和EGFP双重特性,为进一步研究DDR2的功能提供了工具.     

GFP在绿色荧光裸鼠不同组织中的表达及分析

摘要：目的：研究外源绿色荧光蛋白（Green Fluorescence Protein,简称GFP）基因在BALB/c绿色荧光裸鼠主要器官组织中的表达及其差异。方法：小动物成像系统以及RT-PCR方法检测GFP的组织分布以及荧光表达水平情况。结果：经活体荧光影像系统观察及PCR方法检测发现GFP可以在裸鼠多个器官组织中表达,其中在胰腺、心脏、全脑、皮肤、睾丸中表达量较高。结论：外源绿色荧光蛋白可以在模型动物体内成功表达且稳定遗传,其中在胰腺组织中高表达。