LRIG2基因短发夹RNA表达载体的构建、鉴定和稳定株的筛选

目的 构建针对富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白2(LRIG2)基因的短发夹RNA(shRNA)表达载体,建立稳定转染的细胞株,观察其对目的 基因表达的影响.方法 根据GenBank中LRIG2基因序列设计2条RNA干扰序列,命名LRIG2-shRNA1、LRIG2-shRNA2,同时设计1条非特异性序列作为阴性对照.据此设计合成各自的寡核苷酸链,退火后连接入pGenesil 2载体,转化扩增后进行序列测定.用不同浓度的G418作用于GL15细胞,得到G418对于GL15细胞的筛选浓度.3种重组表达载体转染胶质瘤细胞系GL15细胞,用G418筛选后挑单克隆后扩增获得稳定株.逆转录RT-PCR和Western印迹法分别在mRNA和蛋白水平上检测LRIG2的表达.结果 3种重组表达载体(pGenesil 2-LRIG2-shRNA1、pGenesil 2-LRIG2-shRNA2和pGenesil 2-negative shRNA)经限制性酶切及DNA测序分析证明序列插入正确.G418对于GLl5细胞的筛选浓度为600μg/ml,筛选出稳定转染三种质粒的GL15细胞,转染pGenesil 2-LRIG2-shRNA2组细胞LRIG2 mRNA和蛋白表达明显低于转染pGenesil 2-LRIG2-shRNA1、pGenesil 2-negative shRNA组.结论 成功构建了针对LRIG2基因的shRNA表达载体(pGenesil 2-LRIG2-shRNA2),转染细胞后可抑制LRIG2基因表达,为研究LRIG2基因的功能提供了基础.     

Survivin干扰RNA载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的:探索合成survivin siRNA和RNAi载体的构建,及其在HEK293细胞中的表达?方法:分别采用化学合成的针对survivin的siRNA和shRNA载体(pGCsi载体),转染HEK293细胞后观察HEK293细胞中survivin的RNA及蛋白表达?结果:不同序列的siRNA和shRNA转染入HEK293细胞后,survivin的RNA及蛋白表达出现不同程度的下降?结论:化学合成与shRNA载体均可有效抑制HEK293细胞的survivin基因表达,为利用survivin作为靶点治疗胰腺癌等恶性肿瘤提供了技术基础?     

细胞周期相关因子CDCA3基因shRNA表达载体的构建及鉴定

目的设计能转录短发夹状RNA(short hairpin RNAs,shRNA)的DNA序列,构建能有效下调CDCA3蛋白表达的shRNA真核表达载体,研究其对CDCA3表达的影响,以便进一步研究CDCA3的功能。方法根据文献获得CDCA3的siRNA靶序列,依据RNA干扰机制和shRNA靶序列的设计原则,以CDCA3基因为靶基因,合成一对编码shRNA的两条DNA序列,经退火后合成DNA双链,再克隆至shRNA表达载体pSIREN-DNRDsRed质粒中,连接产物转化E.coilJM109感受态细胞,然后挑取克隆提质粒,进行酶切鉴定和DNA序列测定。将构建成功的载体通过脂质体介导转染导入人胚肾HEK293细胞,采用Western blot法和Realtime RT-PCR,检测特异性shRNA对CDCA3蛋白在mRNA及蛋白表达水平的抑制效果。结果成功构建靶向CDCA3蛋白的特异shRNA的真核表达载体;转染HEK293细胞后,可显著下调CDCA3在细胞内的mRNA水平及蛋白表达水平。结论 CDCA3蛋白的特异shRNA的真核表达载体能显著下调HEK293细胞内的CDCA3蛋白表达。成功构建CDCA3 shRNA表达载体,为进一步研究CDCA3基因的功能提供了实验基础。     

含心脏阿霉素反应蛋白基因的重组慢病毒过表达和RNA干扰载体的构建及鉴定

目的：构建心脏阿霉素反应蛋白（CARP）基因重组慢病毒过表达和RNA干扰载体并进一步包装慢病毒,为研究CARP在阿霉素（ADR）心肌病中的作用及机制奠定基础。方法：将PCR扩增的大鼠CARP基因序列和设计合成的短发夹RNA（shRNA）序列分别插入GV-358和GV-248表达载体,行DNA测序鉴定。采用重组CARP过表达和shRNA表达穿梭载体与Helper 1.0和Helper 2.0辅助包装质粒共转染人胚肾细胞HEK293T,进行病毒包装和扩增,采用终点稀释法测定病毒滴度。采用重组慢病毒感染HEK293T细胞,荧光显微镜观察绿色荧光强度。采用重组慢病毒感染H9C2细胞,分为对照组、Scramble RNA组、CARP过表达组和shRNA CARP组,Western blotting法检测各组细胞中CARP蛋白表达水平。结果：基因测序,CARP过表达及shRNA载体序列与原设计序列完全相符。载体转染HEK293T细胞后,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达。包装的CARP过表达及shRNA病毒感染H9C2细胞后,与对照组比较,CARP过表达组细胞中CARP蛋白表达水平升高5.3倍（P=0.01）,shRNA CARP组细胞中CARP蛋白表达水平降低53%（P=0.02）。结论：成功构建了CARP过表达和特异性shRNA慢病毒表达载体并获得高感染效率的过表达和RNA干扰慢病毒,后者在H9C2细胞中能够干预CARP表达。     

shRNA表达载体对HSV-2 ICP4基因的干扰效应

目的构建针对Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-2) ICP4基因的短发夹RNA(shRNA)重组表达载体,探究该载体表达的shRNA对HSV-2的抑制作用。方法重组表达载体通过脂质体转染法转染HEK293细胞,并接种HSV-2,48h后,实时荧光定量RT-PCR检测mRNA转录情况,Western blot检测ICP4蛋白的表达情况,终点滴定法测定病毒的滴度。结果与对照组相比,干扰组对mRNA抑制率为71%,使蛋白表达减少71.81%,并且病毒滴度也明显降低(P<0.05)。结论构建的pGPU6/Neo-shRNA ICP4重组质粒表达载体能在体外细胞水平上干扰HSV-2 ICP4的基因表达,抑制HSV-2在细胞中复制。     

GPC3基因重组慢病毒载体的构建及其在肝癌细胞中的表达

目的 构建含有GPC3的shRNA序列慢病毒表达载体并转染肝癌细胞,观察其转染效率及在肝癌细胞中的表达.方法 应用重组DNA技术,将设计好的GPC3基因特异性siRNA序列构建至慢病毒表达载体pGLV3-GFP上,并应用脂质体法转染293T细胞,进行病毒包装及滴度测定.采用RT-PCR及Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测转染HepG2细胞后GPC3基因的表达情况.结果 慢病毒载体构建成功,并测定滴度为1×108TU/mL,转染后,GPC3基因表达明显降低.结论 成功构建GPC3基因的shRNA慢病毒载体,所介导的RNAi能有效抑制靶细胞中GPC3基因的表达.     

AnnexinⅡ基因反义表达载体对肺癌细胞生长的影响

目的研究annexinⅡ基因反义表达载体(annexin Ⅱ-pLXSN)对人肺腺癌细胞株SPC-A-1生长的影响.方法①提取SPC-A-1细胞总RNA,应用RT-PCR法扩增目的片断,通过双酶切定向克隆的方法构建annexinⅡ基因反义表达载体.②应用脂质体将annexin Ⅱ-pLXSN导入SPC-A-1细胞(SPC-A-1-annexinⅡ).半定量RT-PCR法分析转染细胞中annexin ⅡmRNA的表达.③观察反义RNA对SPC-A-1细胞生物学行为的影响.结果①反义表达载体成功导入SPC-A-1细胞;半定量RT-PCR证实SPC-A-1-annexinⅡ细胞中annexinⅡmRNA表达量较亲代细胞下降约2/3.②对转染前后的细胞观察表明,SPC-A-1-annexinⅡ细胞生长减慢,克隆形成率降低, 3H-TdR掺入率下降,细胞增殖被阻滞于G0～G1期.结论 annexinⅡ具有促进肺癌细胞增殖的作用,此功能将有助于肺癌的发生发展.     

RNAi沉默Fas受体表达的腺病毒载体构建

目的：利用pEGFP6-1和pGenesil—1质粒构建针对小鼠Fas的2个短发卡状RNA（shorthairpinRNA,shRNA）串联表达的载体pEGFP6-1—siFasl＋siFas2,进一步通过BDAdeno—X系统构建腺病毒表达Fas—shRNA载体。方法：设计表达2个短发卡状RNA结构的互补DNA序列分别克隆至质粒载体pEGFP6-1和pGenesil—1中,酶切pEGFP6-1—siFasl大片段和酶切pGenesil—1—siFas2小片段,经T4DNAI,igase连接得到pEGFP6-1—siFasl＋siFas2重组质粒。双酶切重组质粒和pshuttle2穿梭质粒。经T4DNA连接酶连接得到pShuttle2-siFasl＋siFas2质粒。双酶切重组穿梭质粒,连接酶切产物和腺病毒转化感受态E.coil DH5a,PCR筛选鉴定阳性克隆,进一步线性化重组腺病毒pAdeno—siFasl＋siFas2质粒,经脂质体转染HEK293A细胞;收细胞进行裂解收病毒。结果：构建的重组质粒载体经酶切鉴定和测序分析,shRNA编码序列与设计的片段完全一致;重组腺病毒载体经酶切鉴定和PCR分析正确：经HEK293A细胞包装成功,能够表达绿色荧光蛋白。结论：成功构建Fas—shRNA腺病毒串联表达载体。     

shRNA介导的RNAi载体构建及对肝癌耐药细胞MDR1基因表达的抑制

目的:重组构建抑制多药耐药MDR1基因表达的shRNA真核表达载体,研究其对肝癌耐药细胞MDR1基因表达的抑制作用,以及对P-糖蛋白(P-gp)表达和功能的抑制作用.方法:根据MDR1基因序列,设计两段21个碱基的MDR1特异性靶序列作为shRNA目标序列(sh-MDR1-1,sh-MDR1-2),重组构建psh-MDR1表达质粒.采用脂质体介导转染肝癌耐药细胞SMMC-7721/R,用MTT法测定细胞对化疗药物阿霉素(ADM)的敏感性,流式细胞仪检测细胞膜表面P-糖蛋白(P-gp)表达和细胞内Rhdaming123(Rh123)的潴留.结果:PCR和DNA测序证实了psh-MDR1-1和psh-MDR1-2重组质粒的成功构建,均能有效地抑制细胞P-gp表达;转染细胞后均能够一定程度地恢复耐药细胞对化疗药物ADM敏感性,P-gp表达水平明显降低,细胞内的Rh123稳态积累量均明显增高;第1条序列更能有效的抑制MDR1基因表达.结论:体外完成shRNA RNAi载体的构建,能有效地逆转肝癌耐药细胞MDR1基因过度表达,抑制P-gp介导的多药耐药.从DNA载体产生的shRNA在肝癌耐药细胞内能诱导RNAi,能够序列特异性地抑制MDR1基因表达.     

钠通道SCN1A基因短发夹RNA表达质粒的构建及其在HEK293细胞中的沉默效果

目的采用人SCN1A基因非保守区DNA构建短发夹RNA（shRNA）稳定表达的重组质粒,在HEK293细胞中抑制SCN1A基因表达。方法PCR分别正反向扩增SCN1A基因特异序列,构建成一个绿色光蛋白（GFP）与发夹结构RNA（shRNA）融合表达的重组质粒pEGFP-SCN1A-shRNA;该质粒和对照质粒（pCMV-EGFP）分别与SCN1A基因表达质粒（pCMV-SCN1A）共转染HEK293细胞株,采用半定量RT-PCR及双荧光共定位法鉴定SCN1A基因的表达情况。结果与对照相比较,shRNA表达质粒转染的培养细胞中SCN1A基因mR-NA表达量下调90%;双荧光共定位显示实验组阳性细胞中只检测到GFP蛋白,未能检测到Nav1.1,而对照组阳性细胞中能同时检测到GFP蛋白和Nav1.1。结论shRNA表达质粒在培养细胞中能有效地抑制SCN1A基因的表达。该质粒可进一步改造成腺病毒表达载体,在动物脑组织中进行永久性表达,建立癫痫等神经系统疾病的动物模型,可望成为致病机理研究和开发新治疗途径的工具。     

人类pEGFP/H2B真核表达质粒的构建及表达

目的:构建人H2B基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒,并在HEK293细胞中表达.方法:通过RT-PCR从HEK293细胞总RNA中扩增获得H2B基因的部分cDNA序列,与载体pEGFP-C1连接构建H2B基因与GFP融合表达的真核表达质粒pEGFP/H2B,经酶切和测序鉴定;应用脂质体转染技术将重组质粒转染HEK293细胞观察融合蛋白的表达.结果:成功构建H2B基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达载体,与对照组中转染空载体pEGFP-C1的HEK293细胞中的弥漫荧光相比,转染重组质粒的细胞中可观察到绿色荧光蛋白集中表达在细胞核内,分裂期细胞中可见与染色体形态一致的绿色荧光.结论:该载体的成功构建为研究染色体的分离机制建立了有效的观察体系.     

膜联蛋白A7表达稳定下调的小鼠肝癌Hca-F细胞株的建立

目的:建立针对膜联蛋白A7(annexin A7)的shRNA(small hairpin RNA)稳定转染的小鼠肝癌细胞株Hca-F,为后续研究奠定基础.方法:构建3条针对annexin A7的shRNA(shRNA1、2、3),分别与pSilencer连接,构建表达载体并分别转染Hca-F细胞,在mRNA和蛋白质水平比较3条shRNA对annexin A7表达的抑制作用,筛选抑制效果最好的shRNA转染Hca-F.稳转后用含400 μg/ml G418的完全培养基筛选,获得annexin A7表达稳定下调的Hca-F细胞株后传代扩增,应用Western印迹法检测Hca-F细胞annexin A7蛋白的表达,并与空载体转染组及正常对照组进行比较.结果:经DNA测序鉴定,所得到干扰序列与GenBank中序列一致;筛选出其中shRNA1对annexin A7的表达抑制效果最好.pSilencer-shRNA1转染Hca-F细胞株后,annexin A7蛋白的表达远低于空载体转染组和正常对照组(0.318 6 vs 0.798 7,0.824 3,P<0.05),而后二者间无统计学差异.结论:成功建立了annexin A7表达稳定下调的小鼠肝癌Hca-F细胞株,为后续研究奠定了基础.     

靶向Mcl-1的shRNA重组质粒的构建及其对HepG2细胞增殖和凋亡的影响

目的 设计以髓细胞白血病基因-1(Mcl-1)为靶点的短发夹状RNA(shRNA).构建携带此shRNA的重组质粒,探讨脂质体转染该重组质粒对肝癌细胞HepG2增殖及凋亡的影响.方法 设计3对针对Mcl-1基因不同位点的shRNA片段的真核表达载体psiRNA-hHlneo-Mcl,用阳离子脂质体法将重组质粒转染至人肝癌细胞株HepG2中,通过RT-PeR及Western blot方法检测转染前后Mcl-1 mRNA及蛋白表达情况,筛选能高效抑制Mcl-1基因表达的shRNA重组质粒并应用MTT和流式细胞仪分析转染后细胞增殖和凋亡变化的情况.结果 成功构建含shRNA片段的重组质粒,依次命名为pMclsi-1、pMclsi-2、pMclsi-3.经测序证实.插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致.重组质粒转染HepG2细胞后,Mcl-1基因的mRNA水平及蛋白水平明显下调,其中以pMclsi-1重组质粒下调效应最强.MTT检测显示pMclsi-1可明显抑制HepG2细胞增殖,流式细胞仪测定转染后24 h细胞凋亡率为6.5%,48 h细胞凋亡率为15.6%,显著高于对照组(3.9%,P<0.05).结论 采用RNAi技术可特异阻断Mcl-1基因的表达,Mcl-1基因有促进细胞增生及抑制凋亡的作用.     

对人结肠癌细胞株HT-29转染shRNA重组质粒后Survivin基因变化的研究

目的通过对人结肠癌细胞株HT-29转染shRNA重组质粒后观察Survivin基因的变化。方法设计两条针对Survivin基因CDS区不同位点的siRNA片段并构建shRNA表达载体,重组质粒使用阳离子脂质体法转染结肠癌细胞株HT-29。RT-PCR,Western-blot检测转染后mRNA及蛋白表达。结果转染shRNA重组质粒可有效抑制HT-29细胞Survivin的表达,Survivin mRNA和蛋白表达下调,表明Survivin基因沉默效果较高;两个转染组之间相比pshRNA1组Survivin基因的表达量低于pshRNA2组。结论人结肠癌细胞株中的Survivin基因表达率可通过shRNA重组质粒转染而发生变化;siRNA1和siRNA2序列中Survivin基因表达量存在统计学意义,提示我们在今后有关Survivin基因靶向治疗研究中是否需要考虑到序列的选择以提高作用效果。     

人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

目的:构建人MCHR2真核表达载体,转染HEK293细胞,建立稳定转染细胞系. 方法:采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和PCR鉴定后,脂质体转染法转染HEK293细胞,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞系,RT-PCR,Western Blot及免疫荧光法检测MCHR2的表达. 结果:成功构建了pcDNA3.1-MCHR2真核表达载体并已稳定转入HEK293细胞,建立了稳定转染细胞系,成功地表达目的基因. 结论:稳定转染细胞系的建立和基因表达为进一步研究MCHR2的功能提供了良好的实验基础.     

多药耐药基因RNAi重组腺病毒构建

目的 构建抑制多药耐药基因(MDR1)表达的RNAi腺病毒载体,探讨基因治疗改善癫痫多重耐药现象的可行性.方法 根据大鼠MDR1基因序列,选择3个19nt的靶序列,设计并合成3对66nt含编码短发夹RNA(shRNA)序列的寡核苷酸,构建pSIREN-shuttle-MDR1重组质粒,测序分析正确后转染通过马桑内酯诱导的已表达多重耐药蛋白的大鼠星形胶质细胞,通过RT-PCR法测定多药耐药蛋白(P-gp)表达量,判断所设计的3条DNA序列对于P-gp表达的抑制作用.选择抑制效率最高的1个重组质粒,将其中的MDR1 shRNA表达结构酶切后插入腺病毒载体pAdeno-X,构建的pAdeno-MDR1经Pac1酶切后与脂质体共转染HEK293细胞进行病毒包装扩增纯化,所得病毒液作酶切电泳及测序分析正确后再转染大鼠星形胶质细胞模型.RT-PCR及免疫组织化学法分别测转染前后星形胶质细胞模型的MDR1及P-gp表达量.结果 重组质粒及pAdeno-MDR1病毒经PCR、酶切、测序分析证实构建正确.病毒滴度为6×109 pfu/mL.重组腺病毒转染星形胶质细胞后MDR1及P-gp表达量减少,干扰效率接近100%.结论 成功构建针对大鼠MDR1基因的RNAi腺病毒载体,并通过体外实验证实其对大鼠MDR1基因的高效抑制作用.为进一步探索难治性癫痫的多药耐药机制和基因治疗奠定了基础.     

共济失调-毛细血管扩张症致病基因RNA干扰对胶质瘤细胞放射敏感性的影响

目的:观察共济失调-毛细血管扩张症致病基因(ATM基因)的RNA干扰对胶质瘤细胞放射敏感性的影响.方法:选择ATM基因不同区域的DNA序列合成并纯化寡核苷酸后转染人胚胎肾脏细胞HEK293,根据对ATM蛋白不同的阻断效应,筛选用于制备ATM发夹结构short hairpin structure(shRNA)基因的最佳序列.将有效序列克隆入pSilencer 1.0-U6载体中,构建出shRNA的表达质粒并转染恶性胶质瘤细胞系U87细胞.以U87细胞为对照,应用Western blot检测细胞中ATM基因的表达;以细胞存活分数(SF)来评估放射敏感性.结果:Western blot显示shRNA介导的ATM基因沉默能明显阻断U87细胞中的ATM蛋白;与U87细胞相比,U87 shRNA细胞SF明显降低,P＜0.05.结论:由ATM shRNA构建的表达质粒能明显抑制ATM表达,增加胶质瘤细胞的放射敏感性.     

hVEGFA基因重组腺病毒载体的构建及其转染效率的研究

目的:应用AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统构建携带hVEGFA基因的重组腺病毒载体.方法:采用分子克隆技术,从PCR2.1-hVEGFA质粒中克隆出hVEGFA基因的编码序列,酶切、连接后,插入腺病毒系统中的穿梭载体pAdTrack-CMV,获得重组质粒pAdTrack-CMV-hVEGFA,将其转化含有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠埃希菌BJ5183,进行同源重组,获得重组子pAdeasy-1-hVEGFA.鉴定后,将pAdeasy-1-hVEGFA转染人胚肾细胞(HEK293A细胞),获得含hVEGFA基因的重组腺病毒(rAd-hVEGFA).反复感染HEK293A细胞扩增腺病毒,50%组织培养感染量法(TCID50)检测病毒滴度,荧光显微镜观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达.结果:成功构建出含有hVEGFA基因的腺病毒载体rAd-hVEGFA,转染HEK293A细胞后出现绿色荧光蛋白表达,证明腺病毒载体rAd-hVEGFA 转染成功,通过反复感染HEK293A细胞获得大量病毒.结论:成功构建含有hVEGFA基因的腺病毒载体rAd-hVEGFA,可为缺血性脑血管疾病的基因治疗提供基因载体.     

慢病毒载体介导RNA干扰体外抑制人胰腺癌细胞增殖诱导配体的表达

目的:观察慢病毒表达载体介导的RNA干扰(RNAi)对人胰腺癌细胞株CFPAC-1增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand,APRIL)表达的影响,为后续的以APRIL基因为靶点的胰腺癌基因治疗研究奠定基础.方法:应用基因工程技术,筛选出3条针对APRIL基因的RNAi靶序列,分别与pGCL-GFP载体连接,构建3个重组慢病毒表达载体LV-APRIL shRNA1、LV-APRIL shRNA2、LV-APRIL shRNA3;将连接产物转化到DH5 α感受态细胞,经PCR筛选阳性克隆、测序鉴定.将LV-APRIL shRNA、pHelper 1.0、pHelper 2.0共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度.将包装产生的3种重组慢病毒分别感染CFPAC-1细胞,实时定量PCR和Western印迹检测CFPAC-1细胞APRIL mRNA和蛋白的表达,并与未转染及空转染细胞进行比较.结果:3个慢病毒载体PCR和测序结果与预期结果一致,经包装产生的病毒滴度分别为5×107、6×107、4×107 TU/ml.感染CFPAC-1细胞后,APRIL基因mRNA和蛋白的表达量与未感染慢病毒的细胞组及空载体感染组相比均明显下降(P＜0.05),其中LV-APRIL shRNA1、LV-APRIL shRNA2作用较明显,使mRNA表达分别下降73%和68%,蛋白表达分别下降66%和59%(P＜0.05);而未感染慢病毒的细胞组与空载体组相比无统计学差异.结论:成功构建针对APRIL基因的3个慢病毒载体LV-APRILshRNA,体外感染CFPAC-1细胞后可有效抑制APRIL基因和蛋白的表达.     

Skp2 shRNA表达质粒的构建及其对肺癌细胞生长的影响

目的 构建Skp2基因的RNAi真核表达质粒,观察其对SIC-A-1肺癌细胞内Skp2基因表达及细胞生长的影响.方法 根据GenBank中Skp2cDNA序列设计针对Skp2基因的shRNA序列,合成序列并克隆人pGenSil-1质粒中,构建skp2 pshRNA重组质粒.脂质体介导重组质粒转染SPC-A-1肺癌细胞.RT-PCR检测肺癌细胞Skp2 mRNA的表达,Western blot检测Skp2蛋白表达.MTT检测各纽细胞生长情况,流式细胞仪检测细胞周期改变.结果 重组质粒经酶切鉴定和测序,证实表达干扰质粒构建成功.转染重组质粒的肺癌细胞Skp2 mRNA和蛋白的表达明显下降(P<0.05),细胞生长增殖受到抑制,阻滞在G0/G1期的细胞比例增加,而进入S期的细胞比例明显下降(P<0.05).结论 构建的Skp2 shRNA表达质粒能有效下调Skp2基因的mRNA及蛋白的表达、抑制细胞的生长增殖.