组织工程化皮瓣构建的初步研究

应用脂肪组织来源干细胞（ASCs）在体外构建组织工程脂肪并与已构建的复合皮组装培育,试构建出含脂肪层的组织工程化皮瓣。方法（1）构建组织工程脂肪从脂肪组织中分离培养ASCs并进行三系分化诱导鉴定。ASCs与胶原凝胶混合并进行体外成脂诱导,诱导15 d后分别进行倒置显微镜、油红O染色及HE染色观察。（2）构建复合皮从包皮组织中分离培养表皮细胞（Kc）和成纤维细胞（Fb）。Fb与胶原凝胶混合后培养5 d,将Kc接种到含有Fb的凝胶表面,在液面下培养4 d后移至气-液界面继续培养10 d形成复合皮。（3）构建含皮下脂肪组织的3层结构的皮肤复合组织将培养的复合皮与脂肪组织按正常皮肤结构顺序组装后继续培养3 d并行HE染色观察。结果（1）ASCs具有成脂、成软骨和成骨分化能力。ASCs凝胶复合物体外成脂诱导15 d后,可见细胞内充满圆形脂滴,呈单房或多房形,油红O染色及HE染色均显示为成熟脂滴。（2）经过气-液界面培养后,Kc成层分化,形成基底上层。（3）组装培育后的皮肤复合组织分3层,表层Kc成层分化并形成基底上层;中层和底层连接处细胞聚集;成脂分化的ASCs位于底层。结论 分别应用Kc、Fb和ASCs三种细胞,在体外构建出组织工程化脂肪和复合皮,且按序组装培育,可构建出组织工程化皮瓣。     

组织工程化皮瓣的构建

摘要：目的应用脂肪组织来源干细胞（ASCs）在体外构建组织工程脂肪并与已构建的复合皮组装培育,试构建出含脂肪层的组
织工程化皮瓣。方法（1）构建组织工程脂肪从脂肪组织中分离培养ASCs并进行三系分化诱导鉴定。ASCs与胶原凝胶混合并
进行体外成脂诱导,诱导15 d后分别进行倒置显微镜、油红O染色及HE染色观察。（2）构建复合皮从包皮组织中分离培养表皮
细胞（Kc）和成纤维细胞（Fb）。Fb与胶原凝胶混合后培养5 d,将Kc接种到含有Fb的凝胶表面,在液面下培养4 d后移至气-液
界面继续培养10 d形成复合皮。（3）构建含皮下脂肪组织的3层结构的皮肤复合组织将培养的复合皮与脂肪组织按正常皮肤结
构顺序组装后继续培养3 d并行HE染色观察。结果（1）ASCs具有成脂、成软骨和成骨分化能力。ASCs凝胶复合物体外成脂
诱导15 d后,可见细胞内充满圆形脂滴,呈单房或多房形,油红O染色及HE染色均显示为成熟脂滴。（2）经过气-液界面培养后,
Kc成层分化,形成基底上层。（3）组装培育后的皮肤复合组织分3层,表层Kc成层分化并形成基底上层;中层和底层连接处细胞
聚集;成脂分化的ASCs位于底层。结论分别应用Kc、Fb和ASCs三种细胞,在体外构建出组织工程化脂肪和复合皮,且按序组
装培育,可构建出组织工程化皮瓣。
     

原代人脂肪基质细胞体内成骨能力的检测

目的:检测原代人脂肪基质细胞(human adipose-derived stromal sells,hASCs)的体内成骨能力,为应用其构建组织工程化骨奠定基础。方法:酶消化法分离原代hASCs,细胞经成骨向和成脂肪向诱导后,碱性磷酸酶(al-kaline phosphatase,ALP)染色和茜素红矿化染色检测其成骨向分化的能力,油红O染色检测其成脂肪向分化的能力。体内实验使用12只裸鼠,于其背部一侧皮下植入原代hASCs+支架材料作为实验组,同一裸鼠的另一侧植入单纯支架材料作为对照组。植入4周和8周后取材,制成组织切片,进行HE染色和免疫组织化学染色观察。结果:300 mL脂肪组织中可以获得约6×107个原代hASCs。体外实验证实原代hASCs具有成骨向和成脂肪向分化的潜能。HE染色可见,植入4周和8周后植入物中有类骨组织形成,免疫组织化学染色显示骨钙素、ALP和抗人核抗体呈阳性表达。结论:原代人脂肪基质细胞与支架材料构建的复合物可以在裸鼠体内成骨。     

人脂肪来源干细胞复合纤维蛋白胶构建可注射型工程化脂肪组织的实验研究

目的 探讨构建可注射型组织工程化脂肪组织的可行性,为临床修复软组织缺损寻求简便、微创的方法 .方法 采用酶消化法从人脂肪抽吸术的抽吸物中脂质部分获取人脂肪来源干细胞(ASC),以经成脂诱导和未经成脂诱导的ASC作为种子细胞,行DiI体外荧光标记后,分别以1×107个/ml细胞密度与纤维蛋白胶可注射支架复合.取6只裸鼠,将成脂诱导ASC-支架复合物注射于其背部左下方皮下(诱导组),未诱导ASC-支架复合物注射于背部右下方皮下(未诱导组),不加细胞的纤维蛋白胶注射于颈部正中皮下(空白支架组),每点注射0.2 ml.第12周末处死裸鼠取出移植物,通过大体观察、湿重测定、常规组织病理学检测、油红O染色和DiI荧光标记检测判断体内成脂能力.结果 诱导组和未诱导组均获得了外观类似脂肪组织的新生物,新生物湿重分别为(28±15)、(22±t6)mg(t=23.238,P<0.01).诱导组新生物常规组织病理学检查及油红O染色均证实为成熟脂肪组织,DiI荧光标记呈阳性,证实为外源性ASC;未诱导组新生物中见少量成熟脂肪组织,大部分为纤维样结构;空白对照组未见新生组织形成.结论 从人吸脂术抽吸物脂质部分提取的ASC能作为种子细胞,经成脂诱导后与纤维蛋白胶可注射支架复合,可在体内成功构建成熟脂肪组织.     

原代人脂肪基质细胞体内成骨能力的检测

目的：检测原代人脂肪基质细胞（human adipose-derived stromal sells,hASCs）的体内成骨能力,为应用其构建组织工程化骨奠定基础。方法：酶消化法分离原代hASCs,细胞经成骨向和成脂肪向诱导后,碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色和茜素红矿化染色检测其成骨向分化的能力,油红O染色检测其成脂肪向分化的能力。体内实验使用12只裸鼠,于其背部一侧皮下植入原代hASCs + 支架材料作为实验组,同一裸鼠的另一侧植入单纯支架材料作为对照组。植入4周和8周后取材,制成组织切片,进行HE染色和免疫组织化学染色观察。结果：300 mL脂肪组织中可以获得约6×10⁷个原代hASCs。体外实验证实原代hASCs具有成骨向和成脂肪向分化的潜能。HE染色可见,植入4周和8周后植入物中有类骨组织形成,免疫组织化学染色显示骨钙素、ALP和抗人核抗体呈阳性表达。结论：原代人脂肪基质细胞与支架材料构建的复合物可以在裸鼠体内成骨。     

脂肪组织来源干细胞的细胞生物学研究

目的 探索从脂肪抽吸物中脂质部分分离、培养脂肪组织来源干细胞(ASCs)的方法,并通过其生长动力学、形态学、分化能力、细胞衰老和表面标记物轮廓5个方面的特征进行鉴定.方法 酶消化法处理脂类抽吸物,分离培养ASCs,观察细胞形态;MTT比色法测细胞活性并绘制细胞生长曲线,流式细胞仪测定细胞周期,丫啶橙染色检测细胞的衰老;流式细胞仪、免疫组织化学染色法鉴定其表面分子表达;成脂定向诱导分化后油红"O"染色定性.结果 原代培养的ASCs呈成纤维细胞样贴壁生长,具有很强的增殖能力;MTT比色法活性测定均证实ASCs具有很强的增殖活性,细胞周期研究发现ASCs具有干细胞的特性.丫啶橙染色3、4、6、8代无明显衰老.流式细胞仪检测显示干细胞标志的CD29、CD44、CD34的表达均成阳性;HLA-DR、CD133表达为阴性;免疫化学染色发现Ⅷ因子、CD31、CD34、CD105、SMA表达阳性;成脂诱导分化2周后,细胞内可见有大量脂滴,油红"0"染色可见胞浆内有大量红染颗粒.结论 自人体脂类抽吸物中通过酶消化法能分离和培养出具有干细胞特性的成纤维细胞样细胞群,该细胞具有很强的增殖活性且不易衰老,能稳定表达干细胞表面标志并能实现定向成脂分化.     

脂肪细胞去分化及构建组织工程化脂肪的实验研究

目的 探讨成熟脂肪细胞去分化及去分化脂肪细胞作为种子细胞构建组织工程化脂肪组织的可行性.方法 取健康女性脂肪抽吸术的抽吸物,使用酶消化法获取成熟脂肪细胞.采用天花板贴壁法培养.取第3代细胞进行实验.体外实验:成脂、成软骨和成骨诱导培养,并分别采用油红"O"染色、阿尔辛蓝染色和茜素红染色法鉴定.体内实验:实验组(n=6):取第3代细胞使用荧光染料Dil标记,与纤维蛋白胶混合后注射于裸鼠背部一侧皮下,8周后,从大体观察、组织学、油红"O"染色及荧光显微镜观察新生物形成情况;对照组(n=6):以空白的纤维蛋白胶注射于同一裸鼠背部另一侧皮下,于同一时间点进行检测.结果 成熟脂肪细胞呈单房圆形,经天花板贴壁法培养后变为长梭形成纤维细胞状,即去分化脂肪细胞.去分化脂肪细胞在定向诱导培养下能够分别成脂、成软骨及成骨分化.体内实验中实验组8周后在裸鼠背部皮下有新生组织块形成,经检测后证实其为成熟脂肪块井来源于植入的去分化脂肪细胞,对照组无新生组织形成,纤维蛋白胶被降解吸收.结论 成熟脂肪细胞可通过体外培养实现去分化,去分化脂肪细胞具有成脂、成软骨和成骨等多向分化能力,以去分化脂肪细胞为种子细胞可在裸鼠皮下构建出脂肪组织.     

绿色荧光蛋白转基因小鼠脂肪间充质干细胞的多向分化潜能

目的:研究绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠脂肪间充质干细胞(ADSC)体外定向诱导下的多向分化潜能.方法:取出生后4 d的GFP转基因小鼠腹股沟的皮下脂肪组织,经过胶原酶消化,加入脂肪组织来源干细胞条件培养基中培养.将生长状态良好的第5代GFP-ADSCs分别加入成骨及成脂条件培养液进行体外多向分化诱导研究.并分别采用茜素红钙盐染色和油红O染色进行鉴定.结果:成功获得了稳定表达GFP的ADSCs,GFP-ADSC经成骨诱导20 d后茜素红染色可见有橘红色钙盐沉积;经成脂诱导10 d后油红O染色阳性.结论:GFP作为报告基因在ADSCs分化过程中没有被关闭,亦未影响到ASCs的多向分化潜能,是ADSC在体多向分化研究的一个有效示踪工具.     

人脂肪干细胞体外培养及向软骨细胞诱导分化的实验研究

目的:观察人脂肪基质干细胞(ADSCs)体外分离培养及成脂、成软骨诱导分化的生物学性状,探讨其作为软骨组织工程种子细胞的可行性.方法:(1)人脂肪组织来源于健康成年女性腹部吸脂术,酶消化法分离出ADSCs,体外培养扩增.(2)取第3代ADSCs,测细胞生长曲线,流式细胞仪测原代细胞表面标记;成脂和成软骨诱导分化.(3)倒置显微镜观察油红O、阿尔辛蓝(AB-PSA)染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色检测分化情况;RT-PCR检测相关标志基因表达.结果:(1)体外培养的ADSCs细胞形态均一,传代稳定.(2)经成脂诱导,细胞内出现空泡,油红O染色呈红色,RT-PCR检测到有Leptin、PPAR-γ表达;经成软骨诱导,AB-PSA染色呈紫红色,Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色胞浆呈棕黄色,RT-PCR检测COLLⅡ、SOX9和aggrecan表达.结论:脂肪干细胞能向软骨细胞方向诱导分化,可作为软骨组织工程种子细胞.     

炎症因子预处理的脂肪干细胞可明显抑制外周血单个核细胞增殖

目的：观察炎症因子预处理脂肪干细胞（adipose derived stem cells,ASCs）模拟异常炎症环境能否增强ASCs抑制外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）体外增殖的能力。方法：先用酶消化法对ASCs进行分离及体外培养,流式细胞仪检测其表面CD分子表达情况,用特定培养基诱导分化并鉴定其向脂肪组织和骨组织分化的能力。将PBMCs用CFSE标记后,与炎症因子预处理后的ASCs共培养,对照组无ASCs或使用未经炎症因子处理的ASCs,同时用CD3/CD28刺激PBMCs增殖,最后用流式细胞仪检测PBMC的母代细胞比例,从而判断其增殖情况。结果：ASCs形态为梭形,密集时可成鱼群状生长,可在诱导培养基培养下向脂肪组织和骨组织分化,表面CD分子表达情况与国际脂肪治疗联盟的关于ASCs的说明一致。PBMCs与ASCs体外共培养后,与无ASCs组相比,PBMCs的母代细胞比例有所增加,但效果并不显著,而将PBMCs与用炎症因子预处理后的ASCs共培养,PBMCs的母代细胞比例有明显增加（炎症因子处理后ASCs组 38.7%±10% vs. 无ASCs组28.4%±8.9%, P<0.05）, 说明炎症因子预处理的ASCs可明显抑制PBMCs的增殖。结论：炎症因子可增强ASCs的抗炎能力,该发现有助于ASCs更好地在组织修复领域发挥治疗作用。     

Neurogenic differentiation of murine adipose derived stem cells transfected with EGFP <Emphasis Type="Italic">in vitro</Emphasis>

Some studies indicate that adipose derived stem cells(ADSCs)can differentiate into adipogenic,chondrogenic,myogenic,and osteogenic cells in vitro.However,whether ADSCs can be induced to differentiate into neural cells in vitro has not been clearly demonstrated.In this study,the ADSCs isolated from the murine adipose tissue were cultured and transfected with the EGFP gene,and then the cells were induced for neural differentiation.The morphology of those ADSCs began to change within two days which developed i...     

高成脂能力脂肪干细胞的提纯

目的 提纯具备高成脂能力的脂肪干细胞应用于脂肪组织工程的种子细胞,以提高组织工程化脂肪的构建效率.方法 采用CD54-PE免疫磁珠分选法分别分选脂肪组织新鲜分离的间质血管碎片（SVF）及培养后脂肪干细胞（ASCs）,同时采用流式细胞检测分选前、后细胞CD54阳性表达率 并分别进行成脂、成骨诱导,并对诱导结果 进行比较.结果 细胞CD54的表达率随着传代次数的增加而降低 用CD54-PE免疫磁珠分选新鲜分离的SVF及经过培养后的ASCs,CD54的表达率在两种细胞群体中均达到90%以上.培养数代后,从培养后ASCs分离出的细胞CD54表达率维持高水平,从SVF分离的细胞及ASCs CD54表达为阴性.CD54阳性细胞成脂分化率明显高于其余两种细胞,而ASCs成骨能力则在三种细胞中最佳.结论 CD54是高成脂系干细胞特异表达的表面分子之一,从ASCs分离CD54阳性细胞可作为纯化高成脂干细胞系的方法 之一.     

脂肪干细胞体外培养特性及成脂成软骨分化研究

目的:分析脂肪干细胞体外培养的特性和体外向成脂细胞和成软骨细胞分化的情况.方法:采集成年兔腹部脂肪组织,体外分离培养脂肪干细胞,并进行成脂细胞和成软骨细胞的体外诱导分化,采用油红O染色证明成脂细胞分化,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色和Alcian Blue染色证明成软骨细胞分化.结果:脂肪干细胞形态为菱形,细胞可稳定传代,各代次间无形态上的差异.经油红O染色发现,脂肪干细胞可形成阳性脂滴,表明具有成脂分化能力.经Ⅱ型胶原免疫组织化学染色和Alcian Blue染色后发现,脂肪干细胞可形成Ⅱ型胶原和硫酸蛋白聚糖,表明具有成软骨分化能力.结论:脂肪干细胞具有成脂成软骨分化能力,可成为脂肪和软骨组织工程研究的种子细胞.     

以表皮细胞及脱细胞真皮构建组织工程皮肤

目的 体外扩增培养表皮细胞，复合脱细胞真皮构建组织工程皮肤，以促进其进一步临床应用。方法 将人表皮细胞进行体外培养扩增后，以生长良好的表皮细胞接种于制备好的异种（猪）无细胞真皮支架上，行气液界面联合体外培养，构建组织工程皮肤。观察细胞生长情况及复合皮结构。结果 培养的表皮细胞扩增良好，脱细胞真皮支架去细胞完全，表皮细胞在脱细胞真皮上可以生长，可体外构建复合皮肤。结论 利用体外扩增的表皮细胞及制备的脱细胞真皮可体外联合构建具有复层结构的组织工程皮肤。     

源于人躯干皮肤真皮的成纤维样细胞的间充质干细胞分化潜能

目的: 研究从人皮肤真皮组织中分离培养的成纤维样细胞向中胚层细胞分化的潜能,初步探讨其替代自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)用于组织损伤和缺损修复的可行性。方法: 将一定大小的成人腹部全层皮肤组织分别用分散酶和Ⅰ型胶原酶消化,分离获得真皮来源总细胞。单层培养扩增的细胞在含有一定浓度N2、B27、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮细胞生长因子(EGF)的无血清培养液中进行悬浮培养,并收集培养液中悬浮存在的球状细胞聚集体(SDDSs),用含胎牛血清的培养液进一步单层扩增细胞。以免疫细胞荧光法分析细胞和鉴定细胞的分化特性。结果: 真皮中分离的一些单个细胞在无血清培养液中分裂增殖形成SDDSs;在含血清的单层培养条件下,从SDDSs分离培养的细胞增殖活跃,细胞表达间充质干细胞标志物CD90、CD105和波形蛋白;分别向骨细胞、软骨细胞以及脂肪细胞诱导分化后,呈现类似于BMSCs分化特点,分化的细胞呈茜素红、番红O和油红O特殊染色阳性反应,但真皮细胞分化形成的软骨细胞番红O染色弱于骨髓干细胞来源的软骨细胞。结论: 结合无血清培养和有血清培养法,可从人真皮组织中分离培养具有向软骨细胞、骨细胞和脂肪细胞分化潜能的细胞,此细胞将有望替代BMSCs用于临床组织损伤修复的再生治疗。     

组织工程皮肤修复动物皮肤缺损的实验研究

目的利用表皮细胞复合脱细胞真皮构建组织工程皮肤，探讨其用于修复动物皮肤缺损的可行性。方法将扩增的人表皮细胞复合异种（猪）脱细胞真皮支架构建组织工程皮肤，将制备的人工皮肤移植于裸鼠全层皮肤缺损，观察创面愈合情况并进行直接免疫荧光鉴定。结果构建的组织工程皮肤可用于修复裸鼠全层皮肤缺损，创面愈合良好，新生的表皮由移植的人表皮细胞增殖形成。结论利用表皮细胞复合脱细胞真皮构建的组织工程皮肤可用于修复动物全层皮肤缺损。     

人皮下和髌下脂肪垫干细胞治疗大鼠骨关节炎的疗效比较

 目的 比较人皮下和髌下脂肪垫干细胞体外增殖、成软骨分化潜能以及体内治疗大鼠骨关节炎的疗效差异。方法 获取上海市东方医院未患代谢性相关疾病患者的皮下和髌下脂肪垫组织,从髌下脂肪垫中分离原代脂肪干细胞（adipose-derived stem cells,ASCs）,体外诱导成脂、成骨、成软骨方向分化。EdU检测人皮下脂肪干细胞（subcutaneous ASCs,Sc-ASCs）和髌下脂肪垫干细胞（infrapatellar fat pad derived stem cells,IPFP-ASCs）体外增殖能力,流式细胞术检测干细胞表面标记蛋白CD34、血管相关标记蛋白CD31的表达。阿尔新蓝染色及Western blot检测Sc-ASCs和IPFP-ASCs体外成软骨潜能。体内实验采用8周SD大鼠随机分为对照（control,CON）组、内侧半月板不稳术（destabilisation of the medial meniscus,DMM）组和DMM手术后Sc-ASCs治疗组,DMM手术后IPFP-ASCs治疗组,通过大体观察、番红固绿染色及OARSI评分比较体内治疗效果。结果 人髌下脂肪垫组织中分离获得ASCs,形态呈长梭形,在体外具有成脂、成骨、成软骨分化潜能。Sc-ASCs和IPFP-ASCs表面标记蛋白CD34和血管相关标记蛋白CD31表达无显著性差异,但人IPFP-ASCs体外增殖能力较强。阿尔新蓝染色及Western blot显示IPFP-ASCs体外成软骨能力较强。体内大鼠实验大体形态学观察显示DMM组骨赘增多,软骨表面缺损,Sc-ASCs治疗组骨赘减少,IPFP-ASCs治疗组表面较光滑,无明显骨赘生成;番红固绿染色显示DMM组软骨层出现垂直裂缝且到达钙化软骨,Sc-ASCs治疗组关节面纤维化且软骨浅表层存在垂直裂隙,IPFP-ASCs治疗组软骨层较为连续,仅存在轻微纤维化;OARSI评分显示IPFP-ASCs治疗骨关节炎疗效更好。结论 人IPFP-ASCs体外增殖能力、成软骨分化潜能以及体内治疗大鼠骨关节炎的效果优于Sc-ASCs。