MEKK3稳定表达细胞株的建立及其对A549细胞增殖的影响

目的 构建人MEKK3基因编码区序列(cDNA)的真核表达载体、建立其稳定表达细胞株并观察其对肺腺癌细胞增殖的影响.方法 从A549细胞中提取总RNA,应用RT-PCR扩增MEKK3 cDNA的全长序列后克隆入pcDNA3.1/hygro(+)质粒中,构建成MEKK3基因的真核表达载体,然后转染入人肺腺癌A549细胞...     

人sTRAIL基因载体构建及其在真皮干细胞的表达

背景:基于肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor,TNF)可溶性相关凋亡诱导配体(soluble related apoptosis inducing ligand,sTRAIL)抗瘤的生物特性,克隆sTRAIL基因,构建其真核表达载体,为肿瘤细胞凋亡的实验研究奠定基础。目的:构建真核表达载体pEGFP-N1/sTRAIL,并转染真皮干细胞,以探究sTRAIL基因导入真皮干细胞的表达情况。方法:采用RT-PCR二步法,以人胎盘组织总RNA为模板,扩增sTRAIL的cDNA序列,将其克隆入pMD18-T载体,随后亚克隆入载体pEGFP-N1中,构建其真核瞬时表达载体pEGFP-N1/sTRAIL,以Fugene6转染技术,将sTRAIL基因导入真皮干细胞。倒置显微镜下观测转染后真皮干细胞生长变化及sTRAIL在其中的表达等情况。RT-PCR法对目的基因转染的真皮干细胞进行鉴定。结果与结论:克隆到sTRAIL基因的cDNA序列,成功构建了其真核表达载体,该真核表达载体能携带sTRAIL基因在真皮干细胞中正常表达。倒置显微镜下观测到转染后真皮干细胞生长状态与未转染的真皮干细胞无差异。以经sTRAIL基因转染的真皮干细胞该基因组DNA为模板,用RT-PCR法能扩增到sTRAIL基因cDNA序列。     

小鼠B7-H4基因克隆及真核表达载体的构建

目的:克隆小鼠B7-H4(mB7-H4)基因cDNA全长,构建表达跨膜型mB7-H4-GFP融合蛋白的真核表达载体pmB7-H4-GFP和表达可溶性mB7-H4-Fc融合蛋白的真核表达载体pmB7-H4-Fc。方法:采用RT-PCR技术从小鼠脾细胞总RNA中逆转录mB7-H4cDNA,将其全长cDNA去掉中止密码克隆入真核表达载体pEGFP-N1中,并转染293T细胞使其表达跨膜型mB7-H4-GFP融合蛋白;将其胞外功能区cDNA克隆入pcDNA3·1-hFc真核表达载体中,并转染COS-7细胞使其表达可溶性mB7-H4-Fc融合蛋白。结果:序列测定证实克隆的mB7-H4全长cDNA阅读框正确完整,酶切和序列测定证实mB7-H4分别正确插入pEGFP-N1和pcDNA3·1-hFc载体中,两种表达载体分别转染293T细胞和COS-7细胞后可分别表达跨膜型mB7-H4-GFP和可溶性mB7-H4-Fc。结论:成功地克隆mB7-H4基因并构建了两个真核表达载体,它们可分别表达跨膜型和可溶性融合蛋白。     

小鼠催产素受体基因编码区全长的克隆和真核表达

目的 :为了获得小鼠催产素受体 (mouseoxytocinreceptor,mOTR)基因的全长编码区和构建mOTR的真核表达载体 ,以及在哺乳动物细胞中真核表达mOTR。方法 :采用RT PCR方法 ,获得有相互重叠序列的mOTR的羧基端和氨基端的cDNA片段并分别将其亚克隆入PMD 18 T载体。通过对这 2个片段加入酶切位点、双酶切和相互连接 ,获得全长的编码序列。然后将mOTR的全长的编码序列克隆入真核表达载体pEGFP N3,再用脂质体转染法将pEGFP N3 mOTR质粒转染到COS 7细胞中并进行了瞬时真核表达。结果 :将mOTR的羧基端和氨基端的cDNA片段亚克隆入了PMD 18 T载体。连接并最终获得了mOTR编码区的全长序列 ,构建了pEGFP N3 mOTR真核表达载体。将pEGFP N3 mOTR载体转染入COS 7细胞 ,并成功地进行了瞬时真核表达。结论 :成功构建了包含mOTR全长编码区序列的pEGFP N3 mOTR真核表达载体 ,并在COS 7细胞中进行了瞬时表达 ,为今后研究mOTR的功能打下了基础。     

大鼠Akt1基因真核表达载体的构建及其在293细胞中的表达

目的构建Akt1基因真核表达载体pDC316-Akt1，观察其在293细胞（人胚肾母细胞）中的表达。方法采用RT-PCR方法自大鼠肝组织总RNA中克隆Akt1 DNA片段，测序鉴定正确后，插入真核表达载体pDC316的EcoRⅠ、HindⅢ的酶切位点，构建Akt1真核表达载体Akt—pDC316，脂质体介导法转染293细胞，36h后Western blot检测转染293细胞中Akt1的含量。结果经测序鉴定，构建的Akt1氨基酸序列与野生型Akt1序列完全相符。将Akt-pDC316转入293细胞，可见55000位置有Akt1的表达。经Western blot检测，具有良好的表达浓度。结论构建Akt1基因真核表达载体在293细胞中可以充分表达。     

小鼠端粒酶蛋白亚单位真核表达载体的构建和序列测定

目的： 克隆小鼠端粒酶蛋白亚单位(mTERT)的cDNA，构建真核表达载体并进行序列测定。 方法: 从肝癌细胞中提取总RNA，采用RT-PCR 技术扩增mTERT的基因编码区序列，将序列定向克隆至真核表达载体pAC，并进行序列测定。 结果： 获得mTERT编码区 3 369 bp的cDNA片段，用PCR和限制性内切酶分析鉴定，表明获得重组质粒pAC-mTERT。通过对mTERT编码区cDNA序列测序证实其与GenBank中的已知序列一致。 结论： 成功克隆了mTERT编码区序列，并构建了其真核表达载体，为以TERT为基础的肿瘤生物治疗奠定基础。     

谷胱甘肽转硫酶-血小板因子4融合蛋白表达载体的构建、鉴定与表达

目的 构建谷胱甘肽转硫酶－血小板因子4（GST－PF4）融合蛋白表达载体，并研究其编码的蛋白质在大肠杆菌中的表达。方法 通过RT－PCR方法，从HL－60细胞中克隆PF4cDNA，然后克隆至载体pUC19中，序列测定后把PF4基因重组入谷胱甘肽转硫酶融合基因表达载体pGEC-4T-3中，并用IPTG诱导其在大肠杆菌中表达。结果 获得了PF4 cDNA。序列分析表明，该序列与GenBank数据库中的序列一致。重组质粒酶切鉴定表明，PF4基因已正确插入到pGEX-4T-3中。重组融合蛋白表达载体GST－PF4经IPTG诱导表达，在SDS－PAGE后得到1条蛋白表达带，相对分子质量（Mr)约为36000。结论 成功地构融合蛋白表达载体GST－PF4，并大肠杆菌中获得有效表达，为进一步研究打下良好的基础。     

人PD-L1 cDNA的克隆及其胞外区蛋白在大肠杆菌中的表达

目的：克隆人PD-L1基因的cDNA并构建PD-L1胞外区基因的原核表达载体，在大肠杆菌中进行表达。方法：以RT-PCR法从活化的人淋巴细胞总RNA中，扩增并克隆PD-L1的cDNA，构建PD-L1胞外区基因的原核表达载体，在大肠杆菌BL21(ED3)中进行表达并鉴定。结果：克隆到PD-L1 cDNA编码区的全长序列，经DNA测序证明其与已报道的序列一致。同时构建了在羧基端带有His6标签的PD-LI胞外区基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中表达。免疫印迹分析表明，在IPTG诱导后表达的PD-L1胞外区蛋白，相对分子质量(Mr)为25000，与理论值的大小相符。该重组蛋白能与抗His6标签的单抗(mAb)特异性反应。结论：成功地克隆PD-L1基因，其胞外区蛋白在大肠杆菌中获得表达，为利用PD-L1转基因修饰移植物或以PD-L1重组蛋白抑制移植排斥反应等研究提供了条件。     

人PD-L2基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 克隆人PD-L2基因并构建PD-L2胞外区的原核表达载体，在大肠杆菌中进行表达。方法 以RT-PCR方法从活化的人外周血单个核细胞总RNA中克隆PD-L2基因的cDNA，构建PD-L2胞外区的原核表达载体，在大肠杆菌BL21(ED3)中进行表达并鉴定。结果 克隆到PD-L2基因cDNA编码区全长序列，经DNA测序证明其与已报道的序列一致。进而构建了PD-L2胞外区的原核表达载体，并在大肠杆菌表达，免疫印迹分析表明在IPTG诱导后表达PD-L2胞外区蛋白，相对分子质量Mr为22000，与理论值大小相符。结论 成功克隆PD-L2基因，其胞外区蛋白在大肠杆菌中获得表达，为进一步研究PD-L2功能提供了条件。     

人白细胞介素-3基因cDNA的克隆及其真核表达质粒的构建

目的:克隆人白细胞介素-3(hIL-3)基因cDNA,构建其真核表达质粒pcDNA3/hIL-3。方法:从人外周血单个核细胞中提取IL-3mRNA,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增IL-3基因cDNA,通过T/A克隆法,首先构建pUCm-T/hIL-3,然后构建其真核表达型载体pcDNA3/IL-3。结果:pUCm-T/hIL-3内插入片段序列与hIL-3基因序列一致;pcDNA3/IL-3经酶切鉴定与预期结果一致。结论:成功完成了hIL-3基因克隆和pcDNA3/IL-3真核表达质粒的构建。     

Level of functioning of siblings and parents of probands of varying degrees of retardation

A further analysis of already published data supports the position that retardates of low ability level less frequently have retarded siblings, retarded parents, and parents low in occupational level than do retardates higher in ability level. The analysis supports the position that there are two types of retarded individuals, persons retarded as a result of gene or chromosomal anomalies, brain injury, etc., who more frequently occur in the lower-level retardate group, and persons whose retardation represents polygenic segregation, who more frequently occur in the higher-level group.     

Modes of Inheritance of Errors of Refraction

Eighteen families in which both parents had refractions within the range of +4·0 D to −4·0 D and axial lengths seen in emmetropia (22·3-26·0 mm) showed coefficients of correlation of the order 0·5 indicative of polygenic inheritance. Such coefficients were seen for axial length (0·407) and for the cornea (0·487), but not for the lens (which is known to be yoked to the axial length). No such coefficients were seen in 19 families in which one of the parents had axial length outside the emmetropic range (nine families with long axes and 10 with short axes).

The pattern of polygenic inheritance for emmetropia (completely correlated optical components) and errors of refraction up to 4·0 D (inadequately correlated components: correlation ametropia) follows that seen in stature and other measurable characters. In contrast the high refractive errors with their abnormal axial lengths (component ametropia) are—like the extremes in stature—pathological anomalies with monofactorial inheritance.