实时荧光定量PCR检测淋巴细胞中NKG2D、穿孔素和颗粒酶B基因的表达

目的:建立可用于测定淋巴细胞免疫功能的SYBRGreen I实时荧光定量PCR技术。方法:根据NCBI基因库中4种基因(NKG2D、穿孔素、颗粒酶B和内参照GAPDH)的序列,设计合成相应的引物,扩增上述基因。建立SYBRGreen I实时荧光定量PCR方法,检测肿瘤患者外周血淋巴细胞和诱导培养的患者CIK细胞(cytokine induced killer,CIK)中NKG2D、穿孔素和颗粒酶B mRNA的含量。结果:应用设计的引物扩增NKG2D、穿孔素和颗粒酶B基因后,经琼脂糖凝胶电泳和溶解曲线分析表明具有特异性。SYBR Green I实时荧光定量PCR检测结果表明,肿瘤患者的淋巴细胞中颗粒酶B基因的表达降低,而经细胞因子和单克隆抗体诱导培养的肿瘤患者CIK细胞与其淋巴细胞相比,细胞中穿孔素和颗粒酶B基因的表达明显增加(P0.01)。结论:该SYBRGreen I实时荧光定量PCR方法可用于检测淋巴细胞中NKG2D、穿孔素和颗粒酶B的mRNA的表达、作为研究淋巴细胞免疫功能的有力手段。     

喉癌组织中环氧化酶-2(COX-2)基因表达的实时定量PCR研究(英)

目的：测定环氧化酶-2(COX-2)mRNA在喉鳞癌组织中的含量，并分析环氧化酶-2(COX-2)mRNA与喉鳞癌临床分期及组织分化程度的关系。 方法： 用序列特异性引物和荧光染料SYBR green Ⅰ聚合酶链式反应(PCR)方法，检测30例原发性喉鳞癌和癌旁组织中COX-2 mRNA表达，采用GAPDH作对照。 结果： 30份标本的扩增产物经熔解曲线分析及DNA琼脂糖凝胶电泳，证实均为COX-2和GAPDH。COX-2 mRNA在喉鳞癌中的阳性率是100%，而在癌旁级织为40%(30例中12例阳性)，NCOX分别为16.54±13.27、9.24±6.91，两者之间差异显著(P＜0.05)，且喉癌组织中的COX-2 mRNA表达水平与喉癌组织分化程度及临床分期密切相关。 结论： 应用荧光染料SYBR green Ⅰ的实时定量PCR技术能够对COX-2基因表达水平进行定量分析，COX-2基因表达的上调与喉癌的发生有关，且可以作为一种有效的喉癌分子标志。     

多发性骨髓瘤患者外周血CD3ε基因的表达特点

目的:建立荧光定量PCR法检测CD3ε链表达水平的方法,了解多发性骨髓瘤(MM)T细胞信号传导分子CD3ε基因的表达特点。方法:采用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR和相对定量分析法检测22例MM患者及22例正常人外周血单个核细胞CD3ε基因的表达情况,以β2微球蛋白基因(β2M)作为内参,22例健康人作为对照,采用相对定量公式:2-△Ct×100%,计算MM患者CD3ε基因相对mRNA表达量。结果:MM患者和正常人外周血单个核细胞均表达CD3ε基因,具体表达量呈现很大的个体差异性。MM患者CD3ε基因mRNA相对表达量最高为39.78%,最低为0.48%,正常人CD3ε基因mRNA相对表达量最高为5.15%,最低为0.01%。MM患者CD3ε基因表达量明显高于正常人(P0.05)。结论:成功建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR法检测CD3ε链表达水平的方法,率先报道了多发性骨髓瘤中CD3ε基因高表达的特点,为了解多发性骨髓瘤T细胞免疫学特点提供新的资料。     

慢性粒细胞白血病病人TCRζ链表达特点

目的:建立实时定量PCR方法检测TCRζ链表达水平的方法,了解慢性粒细胞白血病(CML)外周血TCRζ链表达水平.方法:采用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR,相对定量检测30例CML患者和30例正常人外周血的单个核细胞的TCRζ链表达情况,以β2微球蛋白基因(β2M)作为内参,根据相对定量公式:2-ΔΔCt计算CML病人与正常人TCRζ链表达差异倍数.结果:成功建立SYBR Green荧光实时定量PCR检测TCRζ链表达检测技术.18例CML患者TCRζ链出现表达低于正常人,而12例CML患者TCRζ链出现表达高于正常人.结论:CML病人中TCRζ链表达水平可分为表达下调(60%)和表达上调(40%)2组,提示部分CML病人的细胞免疫缺陷可能与其TCRζ链表达下调有关.     

实时定量PCR检测自身免疫中APRIL mRNA表达

建立检测增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand,APRIL)mRNA的SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法,了解自身免疫性疾病[系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)]患者外周血单个核细胞(PBMC)中APRIL的表达水平,研究APRIL mRNA的表达与自身免疫性疾病发病机制、预后之间的关系。方法构建克隆载体pGEM-T Easy-APRIL作为定量模板,Line Gene FQD-33A荧光定量PCR仪定量检测58例自身免疫性疾病(SLE、RA)确诊病人和20例正常健康献血者的外周血APRIL mRNA表达含量,以APRIL mRNA和内参GAPDH mRNA含量比值作为APRIL表达水平的指标。结果58例自身免疫病患者的APRIL mRNA表达范围3.95～192,均值为29.68±4.5。20例正常对照标本PBMC APRIL mRNA的表达范围3.1～18.7,均值为10.56±2.0。自身免疫病患者外周血中APRIL mRNA的表达水平高于正常对照组,其中久治不愈或疗效差者APRIL mRNA表达水平明显高于初发患者及治疗后缓解患者,但后两组差异无显著性意义。结论成功建立了人APRIL基因表达含量的SYBR GreenⅠ实时定量检测方法。自身免疫性疾病(SLE、RA)患者的APRIL mRNA的表达含量升高,其中疗效差久治不愈患者有更高表达水平。研究APRIL表达和自身免疫病发展、早期诊断、预后等相关性,为寻找自身免疫病治疗新靶点打下基础。     

实时定量RT-PCR检测TCRVγ亚家族基因表达水平

目的:建立SYBR Green Ⅰ实时定鼍检测TCR Vγ亚家族T细胞表达水平的比较Ct法.方法:利用倍比稀释的成人正常胸腺组织cDNA建立TCR VγⅠ-VγⅢ和B2微球蛋白基因(β2M)基因的相对标准曲线,实验证实靶基因(VγⅠ-VγⅢ)分别和看家基因(B2M)的扩增效率一致,可采用比较Ct法对TCR Vγy Ⅰ～VγⅢ的表达进行相对定量,并运用该方法检测20例健康成人外周血TCR VγⅠ～VγⅢ的表达水平.结果:成人外周血 TCR VγⅡ的表达茸最高,TCR VγⅠ次之,TCRVγⅢ的表达量最低,三者比较有统计学意义(P<0.05).结论:本研究率先建立了利用sYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测人TCR Vγ基因mRNA表达水平比较Ct法,并在国内首先提供了健康成人外周血TCR Vγ基因各亚家族mRNA表达水平的资料.     

职业性三氯乙烯药疹样皮炎CXCR2和CXCR3基因的表达

目的: 建立荧光定量PCR检测三氯乙烯药疹样皮炎(DMLT)患者外周血淋巴细胞CXCR2和CXCR3 mRNA表达的方法.方法: 利用SYBR Green荧光定量PCR分别检测24例DMLT患者、 26例正常人外周血淋巴细胞CXCR2和CXCR3基因mRNA表达情况,以β2微球蛋白基因作为内参,根据相对定量公式 (2-△△CT)计算DMLT患者与正常人CXCR2和CXCR3基因表达差异倍数.结果: 24例患者外周血淋巴细胞荧光定量PCR均检出CXCR2和CXCR3 mRNA表达,其中CXCR2表达情况有两种: 表达上升14例(58.3%)和表达下降10例(41.7%),与正常人CXCR2 mRNA相比表达倍数分别为16.76±7.01、 0.54±0.30;CXCR3表达显著升高(△CT=6.3±2.8,11.4±1.9;P<0.01),与正常人CXCR3 mRNA相比表达倍数为33.37±31.61.结论: 成功建立了DMLT患者外周血淋巴细胞CXCR2和CXCR3mRNA表达的荧光定量PCR方法.     

实时荧光定量反转录聚合酶链反应检测HLA-DRα基因mRNA表达

目的 建立实时荧光定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测HLA-DRα基因mRNA表达。方法应用T-A克隆技术构建含HLA-DRα基因的载体作为标准模板,采用荧光Taqman方法及探针标记技术,建立实时荧光定量RT-PCR方法,制备标准曲线,检测牛膝多糖（ABPS）诱导人外周血单核细胞的HLA-DRα mRNA表达水平变化,并与半定量RT-PCR检测结果进行比较。结果实时荧光定量RT-PCR检测ABPS诱导人外周血单核细胞实验组HLA-DRα mRNA表达明显升高,而无ABPS诱导人外周血单核细胞对照组HLA-DRα mRNA表达没有改变,且半定量RT-PCR结果显示HLA-DRα出现类似的变化趋势。结论所建立的实时荧光定量RT-PCR用于检测HLA-DRα mRNA表达,结果用拷贝数表示,比半定量RT-PCR更灵敏、准确。     

实时定量PCR分析小鼠树突状细胞TLR4 mRNA表达及地塞米松的调节

目的: 建立检测小鼠Toll样受体4(TLR4)mRNA表达水平的SYBR GreenⅠ实时定量PCR实验; 观察小鼠骨髓源树突状细胞(DC)发育成熟过程中TLR4 mRNA表达水平的动态变化以及地塞米松(DEX)对DC TLR4 mRNA表达的影响.方法: (1)用细胞因子定向诱导的方法将小鼠骨髓细胞培养为DC; (2)构建pUCm-T/TLR4和pUCm-T/β-actin重组质粒, 建立检测小鼠TLR4 mRNA水平的实时定量PCR实验; (3)用实时定量PCR技术对体外培养4、 6、 8、 10、 12 d的DC TLR4 mRNA表达水平进行动态观察; (4)在DC培养体系中加入DEX, 与常规培养DC TLR4 mRNA表达水平进行比较.结果: (1)从小鼠骨髓细胞中成功诱导培养了DC, 经免疫磁珠纯化后其纯度可达90%以上; (2)建立了能精确分析小鼠TLR4 mRNA表达水平的SYBR GreenⅠ实时定量PCR实验; (3)在DC培养前期TLR4 mRNA表达水平变化不大, 后期则明显升高; (4)DEX可使DC TLR4 mRNA表达增强.结论: 小鼠骨髓源DC TLR4 mRNA表达水平与其发育成熟阶段密切相关; DEX促进DC TLR4 mRNA表达.     

转移消失基因在乳腺癌中的表达及其临床意义

目的:探讨转移消失(missing in metastasis,MIM)基因在乳腺癌及癌旁组织中的表达及其与乳腺癌临床病理特征的关系.方法:采用SYBR Green实时定量PCR技术检测60例乳腺癌及癌旁组织MIM mRNA的表达,并分析其在不同临床参数间的表达差异.结果:MIM mRNA在乳腺癌中的表达高于癌旁组织(...