人斯钙素1在大肠杆菌中的重组表达与活性鉴定

目的：通过原核表达的方法得到有活性的斯钙素1（ STC1）重组蛋白。方法将优化合成的STC1 DNA片段克隆到表达载体pET-32 b（＋）上,重组质粒转入大肠杆菌诱导表达,在变性条件下纯化包涵体,经透析复性得到可溶的斯钙素1融合蛋白,凝血酶酶切后用高亲和镍离子树脂吸附多余多肽获得目的蛋白。 Western印迹分析验证目的蛋白免疫活性。动物实验检测目的蛋白的生物学活性。结果构建了pET-32b（＋）-STC1表达载体,表达并纯化了STC1融合蛋白包涵体,经复性、凝血酶切和纯化后获得可溶的目的蛋白。 Western印迹分析验证正确。生物学活性检测表明重组STC1能增加大鼠排泄系统对磷酸盐的重吸收。结论获得了具有生物学活性的斯钙素1重组蛋白,为制备STC1单克隆抗体和进一步研究STC1与肿瘤治疗的关系奠定了基础。     

PTD-NGF融合蛋白的制备、活性分析及其跨膜功能研究

目的:构建PTD-NGF融合基因,检测表达的重组蛋白生物学活性和跨膜转运功能.方法:提取小鼠大脑组织RNA逆转录后,钓取β-NGF基因.PCR技术构建PTD-NGF融合基因,插入表达质粒pBV220后,转化大肠杆菌DH5α进行表达与纯化.稀释法复性后,SDS-PAGE及Western印迹鉴定表达重组蛋白.PC12细胞分化培养检测融合蛋白的生物学活性.重组蛋白与HepG2细胞共孵育,免疫组化检测其跨膜功能.结果:PTD-NGF融合基因测序正确,表达产物与目的蛋白大小相符,能与NGF抗体发生结合反应.纯化后蛋白纯度可约达90%以上,重组蛋白经复性可诱导PC12细胞出现明显分化,并能跨膜进入HepG2细胞内部.结论:成功构建了融合基因,表达的重组蛋白具有显著的生物学活性及跨膜转运功能.     

铜绿假单胞菌凝集素PA-ⅠL的纯化表达及活性评价

目的 构建铜绿假单胞菌凝集素PA-ⅠL基因的重组表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达并评价其生物学活性.方法 以铜绿假单胞菌PAO1基因组为模板设计引物,构建pET-28a (+)-PA-ⅠL重组表达质粒,转化至大肠杆菌中诱导表达,用Ni 亲和层析法对目的蛋白进行纯化.流式细胞术评价重组表达的PA-ⅠL蛋白对细胞表面Gb3/CD77的结合活性,菌落平板计数法评价重组蛋白在细菌黏附宿主细胞过程中的功能.结果与结论 SDS-PAGE电泳显示,纯化后的PA-ⅠL蛋白具有较高的纯度,重组表达的PA-ⅠL蛋白能与细胞表面的糖鞘脂Gb3/CD77结合,且呈浓度依赖性抑制PA的PAO1对宿主细胞的黏附.     

血管生成素基因在大肠杆菌中的表达、纯化及活性研究

目的：利用原核表达系统获得重组血管生成素(Ang)并研究其生物学活性。方法：构建高效融合表达载体pGEx4T—Ang，诱导表达后利用亲和层析的方法纯化目的蛋白，经切割后获得非融合的重组人Ang，利用Westem印迹检测表达产物的特异性，通过鸡胚尿囊膜血管增生实验检测重组蛋白的生物学功能。结果：表达的目的蛋白约占菌体总蛋白的20％，亲和层析纯化蛋白的纯度在90％，能够与Ang抗体产生特异性反应，并具有明显的促进血管新生的活性。结论：原核表达的重组Ang具有良好的生物学活性。     

基于沙堡蠕虫和贻贝黏蛋白的融合基因构建及其在昆虫细胞中的表达

目的 构建基于贻贝足蛋白（Mfp）和沙堡蠕虫分泌蛋白（Pcs）的融合基因,并实现其在昆虫细胞中的表达,为新型黏附材料研制奠定基础。方法 理性设计基于Mfp和Pcs的融合分子,通过PCR扩增得到目的基因,再通过pFastBacHBM载体所介导的平末端克隆以及DH10Bac所介导的转座合成带有目的基因的重组杆状病毒质粒（Bacmid DNA）,利用昆虫表达系统生成携带目的基因的杆状病毒,并通过病毒感染细胞实现融合蛋白Pc1-Mfp5的可溶性表达。结果 测序结果显示,重组载体构建成功。病毒滴度测试显示,收获高滴度的杆状病毒。SDS-PAGE以及Western印迹分析表明,Pc1-Mfp5融合蛋白在昆虫细胞中实现了可溶性表达。结论 成功构建pc1-mfp5融合基因,并实现了其在昆虫系统中的可溶性表达,为新型仿生黏附材料的研制奠定了基础。     

登革1型病毒NS1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的重组表达登革1型病毒NS1蛋白并制备多克隆抗体。方法通过RT-PCR扩增编码登革1型病毒NS1蛋白的基因序列,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)后经酶切测序鉴定,获得重组质粒pET-NS1。进一步使用IPTG诱导表达,经免疫印迹鉴定后,采用蛋白浸提方法从SDS-PAGE胶中纯化回收融合蛋白,并通过透析对目的蛋白进行复性;纯化复性后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接免疫荧光法测定抗体效价。结果成功构建了高效表达登革1型病毒NS1蛋白的原核表达载体,表达的重组NS1蛋白占菌体蛋白总量的50%以上,以包涵体形式存在;免疫印迹表明表达的重组NS1蛋白能够为登革病毒兔抗血清识别,纯化后纯度可达95%以上;免疫小鼠后获得了效价1∶1000的抗登革病毒NS1蛋白的鼠多克隆抗体。结论原核表达的重组NS1蛋白具有良好的免疫原性,诱导产生的多克隆抗体能够有效识别天然NS1蛋白,为进一步研究登革病毒NS1蛋白及其抗体的生物学功能奠定了基础。     

重组人瘦素融合蛋白在大肠杆菌中的低温自诱导表达、纯化和活性鉴定

目的:建立低温自诱导表达重组人瘦素(leptin)融合蛋白的系统方法,经体外纯化获得大量具有生物活性的瘦素蛋白.方法:从cDNA文库中扩增瘦素编码区,克隆到pGEM-T easy载体,测序正确后亚克隆到A1.3表达载体,转入BL21(DE3),低温自诱导表达.用SDS-PAGE及Western印迹分析鉴定表达产物.对低温自诱导表达产物rMBP-10His-Leptin进行纯化和酶切,获得可与瘦素单抗发生特异性反应的瘦素蛋白.用Km小鼠减肥实验检验其生物学活性.结果:在22×103处有明显的新增蛋白带,含量超过总蛋白的40%,Western印迹证实为瘦素蛋白.Km小鼠减肥实验证实其具有生物学活性.结论:成功建立了低温诱导表达rMBP-10His-Leptin的系统方法,获得大量瘦素蛋白,经验证表达产物具有免疫活性和生物学活性,可供进一步基础及临床研究应用.     

炭疽毒素PA在E.coli中的表达、纯化及其生物活性分析

目的:构建pET-32a( )-PA重组质粒,实现融合蛋白Trx-PA在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中的表达,并获得有生物学活性的PA.方法:采用PCR的方法扩增PA的编码序列,并且与pET-32a( )载体的Trx编码区融合产生pET-32a( )-PA重组质粒,将重组质粒转化至感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达pET-32a( )-PA,通过SDS-PAGE和Western印迹进行分析.利用Ni2 金属亲和层析纯化表达产物,通过梯度透析进行复性.通过蛋白酶降解和细胞毒性实验分析Trx-PA的生物学活性.结果:成功构建pET-32a( )-PA重组质粒,并纯化了Trx-PA融合蛋白.SDS-PAGE分析表明融合蛋白相对分子质量大小正确,经纯化复性后,蛋白纯度达到76%.Trx-PA在体内和体外均能被弗林蛋白酶(furin酶)降解.Trx-PA的正确降解是致死因子(lethal factor,LF)进入小鼠巨噬细胞Raw264.7内并产生细胞毒性的基础.结论:重组Trx-PA融合蛋白能在E.coli BL21(DE3)中有效表达,并表现出生物学活性.     

SNAP-25基因克隆及其在大肠杆菌中的表达与鉴定

目的：构建SNAP-25基因的原核表达载体pET22b—SNAP-25,对表达产物活性进行初步鉴定。方法：根据GenBank中已报道的SNAP-25基因序列,设计特异引物,通过RT—PCR从小鼠全脑组织总RNA中得到基因。将全长基因克隆至原核表达载体pET22b中,重组质粒转化大肠杆菌E.coli如BL21感受态细胞,IPTG诱导表达,表达产物经Ni—NTA亲和层析进行纯化。通过SDS-PAGE和免疫印迹对其进行鉴定,并对该蛋白进行活性的初步分析。结果与结论：成功构建了原核表达载体pET22b—SNAP-25,Western印迹证实重组蛋白获得表达。表达的重组蛋白与A型肉毒毒素混合反应,经SDS—PAGE验证,重组蛋白具有被毒素特异性切割的活性。     

人oGPCRs与Gi1α的基因融合及其在昆虫细胞Sf9的表达

目的获得人孤儿G蛋白偶联受体（oGPCR）与G蛋白α亚基（Gi1α）的融合基因及其表达蛋白。方法采用RT-PCR法,从人HepG2细胞扩增oGPCR成员GPR45,GPR85,GPR174和Gi1α的完整表达序列,运用重叠延伸PCR法扩增得到人oGPCR成员GPR45,GPR85,GPR174分别与Gi1α的融合基因,将各融合基因与供体质粒pFASTBac1重组,而后分别转化DH10Bac菌株获得杆状病毒穿梭杆粒,制备重组杆状病毒并感染Sf9细胞,收获融合蛋白,经Western印迹鉴定。结果得到了上述oGPCR成员的融合基因oGPCRs-Gi1α,并使之在昆虫细胞成功表达,制备了足量的oGPCRs-Gi1α融合蛋白。结论oGPCR可与Gi1α成功融合,昆虫细胞表达体系是制备融合蛋白的理想手段,为今后深入开展oGPCRs的相关研究提供了保障。