人参皂苷Re对防龋疫苗rPAc免疫效应的影响

目的 研究人参皂苷Re作为防龋亚单位疫苗rPAc佐剂的免疫保护效应.方法 40只BALB/c小鼠随机分为4组:防龋疫苗(rPAc)组,人参皂苷Re( Re)组,Re+rPAc组和生理盐水( NS)组,分别用rPAc、Re、Re+rPAc、生理盐水经鼻黏膜免疫.2 周后加强免疫1 次.用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清和唾液中特异性抗体的水平.脾细胞刺激实验检测细胞因子分泌水平.将24只定植了变形链球菌的Wistar大鼠随机分为4组:rPAc组,Re组,Re+rPAc组和NS组,分别用rPAc、Re、Re+rPAc、生理盐水经鼻黏膜免疫.2周后加强免疫1 次.龋齿记分评价防龋保护效能.结果 Re+rPAc组血清特异性抗PAc IgG、IgG1、IgG2a水平及唾液中特异性抗PAc IgA抗体水平均明显高于其他组( P＜0. 01). Re+rPAc组较其他组脾淋巴细胞白细胞介素4和γ干扰素表达增强(P＜0. 05).大鼠龋齿保护实验显示Re+rPAc组定菌鼠釉质龋(E)、牙本质浅龋(Ds)和牙本质中龋(Dm)均显著低于其他组( P＜0. 05).结论 Re作为防龋亚单位疫苗rPAc的佐剂可提高防龋疫苗的血清和唾液中特异性抗体的水平及防龋保护效能,具有作为防龋疫苗rPAc免疫佐剂的可行性.     

人用靶向防龋DNA疫苗防龋效果及交叉免疫保护的实验研究

变形链球菌（Streptococcus mutans，S．mtttans）是主要致龋菌，细胞表面蛋白抗原PAc和葡糖基转移酶（glucosyltransferas，GTFs）是其主要毒力因子。郭继华等构建了以细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4为引导，针对变形链球菌PAc和GTF的靶向防龋DNA疫苗pGJA—P，大大提高了防龋效果。在此基础上，以符合美国食品和药品管理局要求的pVAX1为载体，又构建了人用新型靶向防龋DNA疫苗pGJA-P／VAX。     

变形链球菌重组质粒pcDNA3-pacA/pcDNA3-pacP免疫定菌鼠的龋齿记分研究

目的　观察已构建的基因重组质粒 pc DNA3- pac A和 pc DNA3- pac P作为防龋疫苗的防龋效果。方法　分别将基因重组质粒 pc DNA3- pac A、pc DNA 3- pac P和 pc DNA3- pac A+pc DNA3- pac P联合使用作为基因疫苗注入免疫定菌鼠颌下腺区皮下 ,以 Keyes龋齿计分法评估免疫后定菌鼠磨牙的患龋情况。结果　重组质粒单独免疫组和联合免疫组大鼠的龋齿计分均明显低于阴性对照组和空白对照组 (P<0 .0 5 ) ;联合免疫组和 pc DNA3-pac A组的龋齿记分均明显低于 pc DNA3- pac P组 (P<0 .0 5 )。结论　重组基因质粒 pc DNA3- pac A和 pc DNA3- pac P均可有效的控制龋损的发生 ,降低龋坏程度 ,有望成为防龋基因疫苗。     

DNA防龋疫苗诱导长期免疫反应及机制初探

目的：观察编码pac结构基因A-P片段的重组质粒pCIA-P以经肌肉和颌下腺周围区域皮下注射（TSG）两种途径免疫BALB/c小鼠后的特异性免疫反应,并观察表面蛋白抗原PAc在小鼠颌下腺中的表达。方法：将20只BALB/c小鼠随机分为4组,分别以重组质粒pCIA-P经肌肉、颌下腺区周围区域皮下注射两种途径免疫小鼠及pCI质粒和生理盐水肌肉免疫小鼠,ELISA法检测血清和唾液中特异性抗体水平动态变化。将pCIA-P经颌下腺区周围区域皮下注射以免疫组化技术观察表面蛋白抗原PAc的表达。结果：颌下腺区皮下注射法免疫后唾液IgA型特异性抗体和血清IgG型特异性抗体均明显升高,并持续24周以上。肌肉注射法后血清IgG型特异性抗体明显升高,但未有效诱导产生唾液IgA型特异性抗体。在小鼠颌下腺中检测到PAc蛋白的表达。结论：DNA防龋疫苗经颌下腺周围区域皮下注射免疫是可诱导长期黏膜免疫的有效途径。     

DNA防龋疫苗诱导长期免疫反应及机制初探

目的:观察编码pac结构基因A-P片段的重组质粒pCIA-P以经肌肉和颌下腺周围区域皮下注射(TSG)两种途径免疫BALB/c小鼠后的特异性免疫反应,并观察表面蛋白抗原PAc在小鼠颌下腺中的表达。方法:将20只BALB/c小鼠随机分为4组,分别以重组质粒pCIA-P经肌肉、颌下腺区周围区域皮下注射两种途径免疫小鼠及pCI质粒和生理盐水肌肉免疫小鼠,ELISA法检测血清和唾液中特异性抗体水平动态变化。将pCIA-P经颌下腺区周围区域皮下注射以免疫组化技术观察表面蛋白抗原PAc的表达。结果:颌下腺区皮下注射法免疫后唾液IgA型特异性抗体和血清IgG型特异性抗体均明显升高,并持续24周以上。肌肉注射法后血清IgG型特异性抗体明显升高,但未有效诱导产生唾液IgA型特异性抗体。在小鼠颌下腺中检测到PAc蛋白的表达。结论:DNA防龋疫苗经颌下腺周围区域皮下注射免疫是可诱导长期黏膜免疫的有效途径。     

DNA防龋疫苗经TSG途径免疫BALB/c小鼠实验研究

目的观察编码PAc结构基因A-P片段的重组质粒pCIA-P以经肌肉和颌下腺周围区域皮下注射(TSG)两种途径免疫BALB/c小鼠后的特异性免疫反应,并观察表面蛋白抗原PAc在小鼠颌下腺中的表达。方法将25只BALB/c小鼠随机分为4组,分别以重组质粒pCIA-P经肌肉、颌下腺区周围区域皮下注射两种途径免疫小鼠及pCI质粒和生理盐水肌肉免疫小鼠,ELISA法检测血清和唾液中特异性抗体水平动态变化。将pCIA-P经颌下腺区周围区域皮下注射以免疫组化技术观察表面蛋白抗原PAc。结果颌下腺区皮下注射法免疫后唾液IgA型特异性抗体和血清IgG型特异性抗体均明显升高,并持续数周。肌肉注射法后血清IgG型特异性抗体明显升高,但未有效诱导产生唾液IgA型特异性抗体。在小鼠颌下腺中检测到PAc蛋白的表达。结论重组质粒pCIA-P是一种有效的免疫原,该DNA防龋疫苗经颌下腺周围区域皮下注射免疫是可诱导长期粘膜免疫的有效途径。     

靶向融合防龋DNA疫苗经肌肉免疫动物的实验研究

目的　观察靶向融合防龋DNA疫苗pGJA P在大鼠肌肉组织中的原位表达。检测靶向融合防龋DNA疫苗pGJA P经股四头肌注射途径免疫大鼠后体内抗体水平和防龋效果 ,并与融合防龋DNA疫苗pGLUA P进行比较。在小鼠体内长期观察抗体动态变化。方法　质粒pGJA P经股四头肌注射途径免疫大鼠 ,免疫组织化学方法检测重组蛋白的原位表达。质粒pGJA P和pGLUA P经股四头肌注射途径免疫定菌鼠 ,ELISA法检测血清IgG和唾液IgA抗体水平 ,Keyes记分法评估定菌鼠磨牙患龋情况。质粒pGJA P和pGLUA P经股四头肌注射途径免疫BALB/c小鼠 ,ELISA法检测血清IgG和唾液IgA动态变化。结果　大鼠股四头肌组织检测到表达的重组蛋白。大鼠pGJA P免疫组血清抗PAcIgG水平 (1∶2 0 0 0 0 0 )和抗GTFIgG水平 (1∶5 80 0 0 )均显著高于pGLUA P免疫组 (1∶2 30 0 0和 1∶110 0 0 )(均P <0 0 1)。大鼠pGJA P免疫组唾液抗PAcIgA水平 (1∶8)和抗GTFIgA水平 (1∶6 )均显著高于pGLUA P免疫组 (1∶2和 1∶2 ) (均P <0 0 1)。pGLUA P免疫组未能引起有效的唾液IgA反应。pGJA P免疫组龋齿记分显著低于pGLUA P免疫组和空白组 (P <0 0 1)。小鼠pGJA P免疫组有效血清IgG、唾液IgA和pGLUA P免疫组有效血清IgG均持续至本实验结束 ,pGJA P免疫组血清IgG和唾液Ig     

可生物降解聚合物载体微球口服防龋疫苗免疫效果

 【目的】以PAc多肽(301～319)作为抗原,PBLG-PEG-PBLG做载体制备防龋微球疫苗,口服免疫SD大鼠,观察其对变链菌在大鼠牙面的黏附及对龋病发生的影响效果。【方法】28只出生30d的雄性SD大鼠随机分成4组建立龋模型,对各组大鼠口腔中变链菌的黏附菌落计数,根据Keyes评分标准做龋齿记分。【结果】PAc多肽抗原微球疫苗口服组的变形链球菌数为(13.2±8.16)×104CFU/ml;磨牙龋齿Keyes计分为31.8±6.77,均显著低于对照组(P<0.01)。【结论】口服PAc多肽抗原微球防龋疫苗均能减少龋模型大鼠龋齿的发生,以光滑面龋的减少更显著。     

水凝胶型防龋基因疫苗pVAX1-gtfB/CAT经黏膜途径免疫兔的实验研究

目的观察水凝胶型防龋基因疫苗pVAX1-gtfB/CAT经黏膜途径免疫兔的免疫效果及其目的蛋白在免疫部位的表达。方法 20只新西兰大白兔随机分为5组,每组4只。A组：pVAX1-gtfB/CAT口服组,B组：pVAX1-gtfB/CAT鼻腔黏膜滴注组,C组：空载体pVAX1质粒口服组,D组：空载体pVAX1＋水凝胶口服组,E组：生理盐水鼻腔黏膜滴注组。每间隔1周免疫1次,共免疫3次。每次免疫剂量为200μg/只。于免疫前和免疫后第1、2、3、4、6、8、10、12、14、16周采集血液及唾液标本,ELISA法检测血清及唾液中特异性抗体水平。第3次免疫后每组处死1只动物,取免疫部位组织,免疫组织化学检测目的蛋白表达。结果 1水凝胶型防龋基因疫苗pVAX1-gtfB/CAT免疫兔后,诱导了特异性IgG和SIgA抗体产生,在第6和第8周口服免疫诱导的特异性IgG抗体水平高于鼻腔黏膜滴注,其余时间点两种黏膜途径诱导的SIgA和IgG抗体水平差异无统计学意义;2在小肠黏膜和鼻黏膜均检查到了目的蛋白的表达。结论水凝胶型防龋基因疫苗pVAX1-gtfB/CAT经黏膜途径免疫后,目的蛋白能够在免疫部位表达,均能有效诱导兔的系统免疫和黏膜免疫应答。     

新型防龋疫苗——变形链球菌基因疫苗防龋应用基础研究

1．主要研究内容：（1）基因疫苗的构建;通过基因重组技术成功地构建了含主要致龋菌变形链球菌毒力因子基因的重组质粒pcDNA3-pac、pcDNA3-gtf B、pcDNA3-pac A和pcDNA3-pac P。（2）基因疫苗的鉴定：经双酶切、测序等分析证实目的基因片段插入相位正确,未改变其阅读框架。（3）基因疫苗在真核细胞中均能正确转录和表达。（4）将构建的基因疫苗经不同途径免疫定菌鼠,进行了以下几方面的研究：①筛选出颌下腺周注射是最有效的免疫防龋途径;②通过血清和唾液中特异性抗体的动态变化过程的监测,表明所构建的基因疫苗能诱导高效价的特异性血清和唾液抗体;③以龋齿计分、牙面菌斑指数及唾液中变形链球菌计数多方面的观察,表明所构建的基因疫苗具有显著防龋作用。（5）基因疫苗的生物安全性研究：通过基因疫苗整合入宿主细胞基因组可能性的研究,表明基因疫苗是安全的。     

仙台病毒Tianjin株及其HN／F基因真核表达质粒对人副流感病毒I型的血清中和实验研究

目的：探讨仙台病毒Tianjin株（SeV）及其核酸制备预防人副流感病毒I型（hPIV—1）疫苗的可行性。方法：（1）用sev免疫小鼠3次后取血清,间接ELISA法检测免疫血清抗体效价。（2）将倍比稀释的免疫血清与100TCID~0．1ml的hPIV一1进行中和实验,观察细胞病变（CPE）并计算50％血清中和终点。（3）构建SeV真核表达质粒pVAX1-F、DVAX1-HN,分别单独或联合免疫小鼠,取免疫血清检测对hPIV一1的中和终点。结果：SeV免疫血清抗体的50％中和终点分别为39．8、12．6、16．0、44．7、25．1;质粒免疫血清抗体的中和作用按pVAX1-HN＋pVAX1-F组〉pVAX1-HN组〉DVAX1-F组依次递减。结论：仙台病毒Tianjin株及其HN基因、F基因真核表达质粒能诱导机体产生抗hPIV-1抗体,有可能成为制备预防hPIV-1疫苗的有效毒株。     

Chitosan-DNA microparticles as mucosal delivery system: synthesis, characterization and release in vitro

Background Mucosal immunity is important to defense against dental caries. To enhance mucosal immunity,a DNA vaccine mucosal delivery system was prepared by encapsulating anticaries DNA vaccine (plasmid pGJA-P/VAX) in chitosan under optimal conditions and the characteristics of the microparticles was investigated.Furthermore, the release properties and protective action of microparticles for plasmid were studied in vitro.Methods Plasmid loaded chitosanmicroparticles were prepared byconcentration of DNA, sodium sulfate, and the chitosan/DNA ratios incomplex coacervation. Three factors,complexes [ better expressed as N/P ratio: the number of poly nitrogen (N) per DNA phosphate (P) ] influencing preparation were optimized by orthogonal test. The characteristics of microparticles were evaluated by scanning electron microscopy (SEM) and confocal laser scanning microscopy (CLSM). DNA release rate of microparticles in similar gastro fluid (SGF) or similar intestinal fluid (SIF) at 37~C was determined by ultraviolet spectrophotometry.Results High encapsulation efficiency (96.8%) was obtained with chitosan microparticles made under optimal conditions of 50 mmol/L Na2SO4,200μg/ml DNA and N/P ratio of 4. The size of particles was about 4 to 6μm. The encapsulation process did not destroy the integrity of DNA. When incubated with SIL, after a release of about 10% in the first 60 minutes, no further DNA was released during the following 180 minutes.When incubated with SGL, the microparticles released a small burst (about 11% ) in the first 60 minutes, and then slowly released at a constant, but different rate.Conclusions These chitosan microparticles showed suitable characteristics in vitro for mucosal vaccination and are therefore a promising cartier system for DNA vaccine mucosal delivery.     

乙肝表面抗原核酸疫苗的构建及其与宿主染色体整合的可能性分析

目的：构建乙肝表面抗原DNA疫苗，并探讨其在实验动物体内整合到宿主细胞基因组上的可能性。方法：采用PCR法扩增乙肝病毒的S基因片段后装入pVAX载体，并以此为修选疫苗免疫（BALB/c）小鼠，在不同时间、不同部位取其组织抽提基因组DNA，用PCR检测DNA整合情况。结果：构建了乙肝核酸疫苗pVAX-HBsAg。免疫接种该疫苗第3周时在小鼠肌肉、肝脏、脾脏、胸腺均有不同量的游离质粒存在；第6周除在股四头肌可检测到外，其余组织中均为阴性；第12、18周时检测所有组织中均为阴性。结论：构建的pVAX-HBsAg DNA疫苗在小鼠体内无染色体整合。     

SARS相关冠状病毒M基因片段的克隆及其DNA疫苗诱导的体液免疫

目的：构建含有SARS相关冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS—CoV)M基因片段的核酸疫苗，观察其免疫小鼠后病毒特异性抗体产生情况。方法：将合成的M基因片段克隆到核酸疫苗真核表达载体pVAX1中，免疫小鼠后，用SARS—CoV抗体ELISA检测试剂盒定期检测免疫小鼠血清中抗SARS—CoV的病毒特异性抗体水平。结果：构建了重组核酸疫苗质粒pVCo—M，免疫小鼠后可诱导产生出病毒特异性抗体。结论：以M为抗原基因的DNA疫苗能诱导SARS病毒特异性抗体，为进一步改进或探索同类DNA疫苗提供有益启示。     

SARS相关冠状病毒S2基因的克隆及其DNA疫苗的免疫效果

目的：构建抗原基因为SARS相关冠状病毒(severe acute resplratory syndrome coronavtrus，SARS—CoV)S2基因的DNA疫苗，将其接种小鼠后观察病毒特异性抗体产生情况。方法：将合成的S2基因片段克隆至真核表达载体，随之将质粒进行小鼠肌内接种免疫，定期检测血清中抗SARS—CoV的病毒特异性抗体水平。结果：疫苗接种后第2周就能检测出病毒特异性抗体，随着时间的延续，抗体水平逐步升高，而空质粒对照组未检测出明显的特异性抗体。结论：以S2为抗原基因的DNA疫苗能诱导SARS病毒特异性抗体。     

新型基因佐剂SPreS2真核表达载体的构建及其瞬时表达

目的 构建重组真核表达载体pVAX1-SPreS2作为基因佐剂,用以增强或调节弓形虫DNA疫苗的体液及细胞免疫效果。方法 采用重叠延伸PCR技术,扩增乙肝病毒表面抗原S和PreS2基因,引入编码GSGSGS柔性多肽序列作为接头拼接S和PreS2基因,构建重组克隆载体pMD18T-SPreS2和重组真核表达载体pVAX1-SPreS2,分别进行PCR、酶切和测序鉴定;脂质体法将重组载体pVAX1 SPreS2转染人成纤维细胞,建立体外真核细胞瞬时表达系统,SDS-PAGE和Western blot检测重组载体转染HFF细胞瞬时表达状况及其表达产物的免疫活性。结果 PCR、酶切、测序结果表明,重组克隆载体pMD18T SPreS2和重组真核表达载体pVAX1 SPreS2正确构建,融合基因SPreS2在真核细胞中可以瞬时表达,其表达产物具有一定的免疫活性。结论 成功构建重组真核表达载体pVAX1-SPreS2,为增强或调节弓形虫DNA疫苗免疫效果提供一种新型基因佐剂。     

优化人alpha-syn基因疫苗免疫MPTP慢性PD小鼠的神经保护作用

目的：探讨优化高分泌型人α-突触核蛋白（human alpha—synuclein,ha—syn）基因疫苗免疫MPTP慢性帕金森病小鼠的治疗效果和神经免疫保护作用．方法：建立慢性PD小鼠模型,采用神经毒素MPTP25mg／（kg·d）,2次／wk,累计共10次．建模后随机分为3组：优化基因疫苗组、疫苗组、PBS对照组;每次治疗前,每只动物分别在双侧后肢胫骨前肌部位注射5g／L布比卡因50μL,注射72h后,3组动物分别于同部位同深度注射优化基因疫苗、基因疫苗或PBS各50μL,1次／3wk,共3次．末次免疫后2wk观察行为学改变后,处死取脑．运用免疫荧光、免疫组化等方法观察酪氨酸羟化酶阳性细胞数,以及α-syn表达变化．结果：优化基因疫苗组、疫苗组小鼠爬杆能力与PBS对照组比较都得到明显改善,有统计学差异（P〈0．05）;但优化基因疫苗组与疫苗组行为学评分间差异无统计学意义．优化基因疫苗组酪氨酸羟化酶阳性细胞数与其它两组相比增多约20％-68％（P〈0．05）,α-syn表达减少约15％～45％（P〈0．05）．结论：优化基因疫苗具有较强改善帕金森小鼠行为学的作用,能增强疫苗的免疫原性,促进受损黑质细胞修复,对帕金森病小鼠有更好的免疫治疗作用．