超声微泡介导EGFP质粒转染视网膜母细胞瘤细胞与传统转染方法效率对比

目的探讨超声微泡造影剂在一定能量的超声波辐照下，介导EGFP质粒转染视网膜母细胞瘤（RB）细胞的效率及可行性。 方法将RB细胞分为6组，1组以一定能量的超声波辐照，2组加适当剂量的微泡造影剂，3组加入质粒，4组加入质粒与微泡，5组加入质粒、微泡，并用一定能量的超声辐照，6组予脂质体与质粒。转染24-48h后观察EGFP表达，并用RT—PCR进行检测。同时对1、2组予以染色。 结果超声微泡介导的DNA质粒对RB细胞的转染效率，与脂质体介导的质粒转染效率相似，明显高于其他实验组。一定能量和时间的超声波辐照，及适当浓度的微泡，对RB细胞的活性无明显抑制。 结论利用低频率和一定能量的超声击碎携带EGFP质粒的超声微泡造影剂，能够有效地提高DNA质粒在RB细胞中的转染效率。     

超声微泡造影剂介导EGFP质粒转染大鼠视网膜的实验研究

目的探讨超声破坏微泡介导EGFP质粒转染大鼠视网膜的效率及可行性，为实现外源基因高效、定向的转移目的奠定基础。方法将30只Long-evans大鼠分为6组，第1组仅以0．5w／cm。的超声波辐照大鼠眼球，第2组于尾静脉输入适当剂量的微泡造影剂，并立即以相同能量的超声波辐照大鼠眼球，第3组于尾静脉输入质粒，第4组于尾静脉输入质粒，并以超声辐照大鼠眼球，第5组于尾静脉输入质粒与微泡，第6组尾静脉输入质粒、微泡，并用超声辐照眼球。转染2周后，在激光共聚焦显微镜下观察EGFP表达情况。结果超声微泡介导的EGFP质粒对大鼠视网膜的转染效率，明显高于其他实验组。一定能量和时间的超声波辐照，及适当浓度的微泡，对大鼠视网膜脉络膜无明显损伤。结论利用低频率和一定能量的超声击碎携带EGFP质粒的超声微泡造影剂，能够有效地提高EGFP质粒在大鼠视网膜的转染效率。     

超声微泡造影剂介导EGFP对兔视网膜的转染效率

目的 探讨在不同能量超声和一定剂量微泡作用下,超声微泡造影剂介导下增强型绿色荧光蛋白(EGFP)质粒对兔视网膜转染的效率、安全性以及可行性.方法 将30只新西兰大白兔随机分为6组:质粒组(A组)、质粒+微泡组(B组)、质粒+超声照射组①(C组)、质粒+超声照射组②(D组)、质粒+微泡+超声照射组①(E组)、质粒+微泡+超声照射组②(F组).将1 ml pEGFP-C1质粒与1 ml SonoVue微泡造影剂混合,由耳缘静脉注入,分别用0.5、1.0 W/cm2超声波辐照眼球.转染7天后行视网膜光镜及透射电镜检查,观察质粒、微泡及超声照射对视网膜有无损害,并在荧光显微镜下观察pEGFP-C1质粒表达情况.结果 光镜及透射电镜结果显示质粒、微泡及超声照射对视网膜无损害.A～D组均可见少量绿色荧光表达(P均＞0.05),E、F组的荧光表达较强,明显高于其他4组(P均＜0.05),E、F组荧光强度差异无统计学意义(P均＞0.05).结论 在一定能量的超声照射下,超声微泡造影剂能够提高携带EGFP质粒在兔视网膜的转染效率.     

超声微泡介导野生型p53基因转染Y79细胞的实验研究

目的研究超声微泡介导wtp53（wild type p53）基因转染视网膜母细胞瘤（Y79）细胞的效率及作用效果。方法以一定能量的超声介导wtp53转染Y79细胞,分为（1）质粒＋微泡＋超声照射组;（2）质粒＋脂质体组;（3）质粒＋超声照射组;（4）空白对照组。RT-PCR检测wtp53mRNA,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果超声微泡介导的wtp53基因对Y79细胞的转染效率明显高于其他实验组,检测到的细胞凋亡率也明显高于其他组。结论超声微泡可达到高效的基因转染目的,wtp53对Y79细胞有明显抑制生长的作用。     

超声微泡造影剂介导PEDF质粒转染大鼠视网膜的实验研究

目的 探讨超声微泡造影剂介导色素上皮源性因子(PEDF)质粒转染大鼠视网膜、脉络膜的效率及治疗脉络膜新生血管(CNV)效果.方法 氩绿激光对Long-Evans大鼠视网膜进行光凝建造CNV模型.将24只造模成功的CNV大鼠分为2组:①空白组,②超声辐照微泡转染组.于转染后14 d,分别进行眼底荧光血管造影(FFA),RT-PCR和免疫荧光检查.结果 转染后14天超声微泡能介导PEDF质粒对大鼠视网膜、脉络膜的转染,并且对CNV有抑制作用.结论 利用一定能量的超声击碎携带PEDF质粒的超声微泡造影剂,能够有效地提高PEDF质粒在大鼠视网膜、脉络膜的转染效率,对大鼠脉络膜新生血管有一定抑制作用.     

超声微泡造影剂介导EGFP质粒转染大鼠骨骼肌

目的 探讨增强型绿色荧光蛋白质粒(EGFP)在大鼠骨骼肌微血管通透性增加的条件下表达的可行性.方法 20只清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠,随机均分为裸质粒组(P)、质粒 超声组(P U)、质粒 微泡组(P M)和质粒 超声 微泡组(P U M)共4组进行实验.选择增强绿色荧光蛋白质粒与白蛋白微泡相混合,以超声介导白蛋白微泡破裂的方法 对大鼠骨骼肌行基因转染,转染7 d后,荧光显微镜下观察质粒在大鼠脊斜肌组织中的表达情况.结果 P、P M组大鼠脊斜肌组织中均未见增强型绿色荧光蛋白表达;P U组可见少量微弱绿色荧光,荧光强度较P和P M组明显增强(P<0.05),P U M组可见明显特异性增强型绿色荧光蛋白表达,荧光强度约为P、P M组的10倍,P U组的3倍(P<0.05);P U M组转染率为(42.72±10.07)%较之P U组(13.62±6.17)%明显增高(P<0.05).结论 超声介导微泡造影剂破裂造成的脊斜肌组织毛细血管通透性的增加,是血管内基因成功跨越内膜屏障的主要途径之一.     

超声微泡造影剂介导PEDF基因转染大鼠视网膜与传统转染比较的实验研究

目的探讨超声微泡造影剂与脂质体介导色素上皮源性因子（pigment epithelium derived factor,PEDF）质粒转染大鼠视网膜、脉络膜的效率及治疗脉络膜新生血管（choroidal neovascu larization,CNV）效果。方法氩绿激光对Long-Evans大鼠视网膜进行光凝建造CNV模型。将36只CNV大鼠分为3组：（1）空白组,（2）超声辐照微泡转染组,（3）脂质体转染组。于转染后7、14、28d,分别进行荧光眼底血管造影（fundus flourascent angiography,FFA）,RT-PCR检测。结果转染后7、14d超声微泡介导PEDF质粒对大鼠视网膜的转染效率与脂质体介导的转染效率相似,但转染后28d两者转染效率差异有显著性。超声微泡与脂质体介导PEDF质粒转染对CNV有抑制作用。结论利用一定能量的超声击碎携带PEDF质粒的超声微泡造影剂,能够有效地提高PEDF质粒在大鼠视网膜脉络膜的转染效率,对大鼠脉络膜新生血管有一定抑制作用。     

超声介导微泡造影剂促进HSV-TK基因转染抑制小鼠肝癌移植瘤的实验研究

目的 探讨超声辐照微泡造影剂介导的单纯疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-TK)自杀基因系统转染小鼠肝癌组织的有效性.方法 小鼠肝癌皮下移植瘤,尾静脉注入HSV-TK,添加或不添加Sono Vue,脉冲多普勒超声(1MHz、2W/cm2 、5min)辐照,第2天重复治疗1次.24h后荷瘤鼠腹腔注射更昔洛韦(GCV),连续10d,绘制肿瘤生长曲线,观测荷瘤鼠生存时间,半定量RT-PCR分析肿瘤内TK mRNA的表达,TUNEL染色检测肿瘤细胞凋亡.结果 与单纯超声辐照组比较,超声(US)和Sono Vue组肿瘤生长受到明显抑制(P<0.05),小鼠的平均生存时间延长(P<0.05),肿瘤内TK mRNA的表达增多(P<0.05),肿瘤细胞凋亡指数增高(P<0.05).结论 超声辐照Sono Vue可有效介导HSV-TK基因发挥抗瘤效应.     

载自杀基因的靶向微泡联合超声抑制视网膜母细胞瘤的实验研究

目的 探讨载自杀基因的靶向微泡联合超声对视网膜母细胞瘤（RB）的抑制作用。方法 制备携带单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶（HSV1-tk）质粒和VEGFR2抗体的靶向微泡,分为空白对照组、细胞+质粒组、细胞+质粒+SonoVue组、细胞+靶向微泡组、细胞+质粒+超声辐照组、细胞+质粒+SonoVue+超声辐照组和细胞+靶向微泡+超声辐照组进行实验。荧光显微镜观察基因转染情况,流式细胞仪检测转染率,加入丙氧鸟苷（GCV）后,检测细胞的抑制率。结果 细胞+靶向微泡+超声辐照组的转染率为（24.78±1.04）%,较细胞+质粒+SonoVue+超声辐照组（14.31±0.69）%高。随着GCV浓度的增加,培养时间的延长,各组的抑制率逐渐升高。当GCV浓度在100 mg/l,培养96h后,细胞+靶向微泡+超声辐照组对RB细胞的抑制率达（92.91±1.71）%。结论 在加入GCV后,携带HSV1–tk的靶向微泡联合超声能有效的抑制RB细胞。     

超声靶向微泡介导PEDF质粒转染小鼠肝癌的实验研究

目的探讨超声靶向微泡介导色素上皮源性因子(PEDF)质粒转染HepG2荷瘤裸鼠的治疗价值。方法建立裸鼠HepG2肝细胞肝癌模型,随机分为5组。Ⅰ组:对照组;Ⅱ:PEDF质粒组;Ⅲ组:PEDF质粒+微泡组;Ⅳ组:微泡+超声辐照组;Ⅴ组:PEDF质粒-微泡+超声辐照组。疗程结束后观察瘤结节的超声造影特征,计算抑瘤率,并检测瘤组织PEDF蛋白表达。应用SPSS软件分析各组间各参数的差异。结果疗程结束后,Ⅴ组瘤结节超声造影增强明显弱于Ⅰ组;Ⅳ组及Ⅴ组抑瘤率明显高于Ⅱ、Ⅲ组;Ⅴ组瘤组织PEDF蛋白表达高于其他各组。结论超声靶向微泡介导PEDF质粒有助于提高质粒转染率,抑制肿瘤血管生成及肿瘤生长,为肝细胞肝癌的治疗提供了一个新的途径。     

低频超声照射SonoVue对绿色荧光蛋白质粒在小鼠肝癌移植瘤中表达的作用

目的 研究物理参数对体内基因转染率的影响,确定最佳剂量-效应关系.方法 建立小鼠(C57BL/6J)肝癌皮下移植瘤模型,经尾静脉注入绿色荧光蛋白质粒(pEGFP)和SonoVue混合物,给予不同辐照声强(1 W/cm2、2 W/cm2、3 W/cm2)、辐照时间(1 min、5 min、10 min)以及不同剂量SonoVue(30μl、60μl、90μl).流式细胞仪和荧光显微镜检测肿瘤细胞内绿色荧光蛋白表达.结果 pEGFP在肿瘤组织内的表达随辐照时间、辐照声强、造影剂剂量的增加而增多,持续增加辐照时间、声强和造影剂剂量并不能有效增加其转染率,2 W/cm2[(21.02±1.45)%]、5 min(23.22±1.91)%]、60μl SonoVue[(21.02±1.45)%]时,pEGFP在肿瘤组织内的表达达到最大.结论 不同物理参数对体内基因转染率有明显影响,2 W/cm2、5 min、60μl SonoVue的参数条件下,可达到最佳剂量-效应关系.     

超声微泡造影剂声诺维与基因转染的研究

超声微泡是一种新型基因转染的载体,超声辐照微泡（SonoVue）可增加基因在体内及体外的转染效率。若在不损伤基因和组织的前提下促进基因的转染,合适的辐照条件是非常重要的。     

诊断超声照射下微泡造影剂对绿荧光蛋白质粒在肌肉细胞内表达的作用

目的评价诊断超声照射下微泡造影剂对绿荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)质粒在Wistar大鼠胫前肌中表达的作用。方法选用200 g左右成年Wistar大鼠40只,随机分为4组,每组10只,第1组只对大鼠胫前肌注射GFP质粒;第2组对大鼠胫前肌注射GFP质粒和造影剂的混合物;第3组对大鼠胫前肌注射GFP质粒和造影剂的混合物并加超声照射;第4组为阴性对照。12 d后处死动物,取胫前肌标本,制作冰冻切片后立即在荧光显微镜下观察。计数GFP阳性表达细胞数。部分组织经甲醛固定、石蜡包埋,光镜下观察病理改变。结果第3组GFP阳性表达细胞数最多[(345±19)个],与第1组[(109±15)个]、第2组[(111±14)个]差异有统计学意义(P<0.01)。第1组、第2组间差异无统计学意义(P=0.784)。所有受检组织光镜下检查未发现出血、坏死、炎症等病理改变。结论微泡造影剂在诊断超声照射下可以促进局部注射GFP质粒在大鼠胫前肌的转染。     

微泡造影剂联合超声介导KDR启动子-胸苷激酶基因靶向血管治疗小鼠肝癌

目的评估微泡造影剂SonoVue联合超声辐照介导KDR启动子-单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)系统(KDR-TK)结合更昔洛韦(GCV)靶向血管治疗小鼠肝癌的有效性。方法建立小鼠(C57BL/6J)肝癌皮下移植瘤模型40只,随机分为4组,分别经尾静脉团注磷酸缓冲盐溶液(PBS)、KDR-TK、KDR-TK、KDR-TK+SonoVue,后两组分别给予1MHz、2W/cm2、5min的超声辐照,24h后治疗组分别腹腔注射GCV0.1ml(100mg·kg-1·d-1),连续10d,检测肿瘤大小,计算抑瘤率,28d后处死小鼠行肿瘤微血管密度及组织病理学检查。结果抑瘤率在PBS组(A组)、KDR-TK/GCV组(B组)、KDR-TK+超声/GCV组(C组)、KDR-TK+超声+SonoVue/GCV组(D组)分别为0%、3.6%±2.7%、21.4%±2.9%和40.7%±4.5%(D组与B组,P<0.01;D组与C组,P<0.05;C组与B组,P<0.05);肿瘤微血管密度分别为48.8±5.1、44.2±6.4、27.4±3.2和12.3±1.4(B组与A组,P>0.05;C组与A组,P<0.05;D组与A组,P<0.01;D组与C组,P<0.05);HE染色C组、D组坏死病变明显。结论微泡造影剂增强超声辐照介导的KDR-TK基因靶向破坏小鼠肝癌微血管的效应,为肝癌的基因治疗提供一种可行、有效的方法。     

超声辐照联合微泡造影剂介导人血管生成素-1基因体外转染293T细胞的研究

目的 探讨超声辐照联合微泡造影剂的基因转染系统介导人血管生成素-1(hAng-1)基因转染人胚肾293T细胞的转染效率.方法 将六孔板中的293T细胞悬液分为4组:A组,超声+质粒组,每孔加入10 μg目的 基因质粒;B组,超声+微泡+质粒组,每孔加入微泡和质粒混合液,终浓度分别为质粒10 μg/孔,微泡200 μl/孔;C组,脂质体+质粒组,每孔加入4 μl脂质体和5 μg质粒;D组,对照组,每孔仅加入10 μg目的 基因质粒.A组和B组均接受超声辐照,照射条件为连续波,声强1.5 W/cm2,作用时间为30 s.转染后48 h用荧光显微镜和流式细胞仪分别定性、定量观察基因的转染效率.结果 48 h后,荧光显微镜下观察到转染成功的细胞胞浆内发出绿色荧光,流式细胞仪检测A组、B组、C组、D组的基因转染效率分别为(3.5±0.4)%、(20.8±1.2)%、(18.0±0.9)%和(0.2±0.1)%.结论 超声本身即有促进基因转染的作用,超声辐照联合微泡造影剂后则增强了这种作用,明显增加了基因的转染效率.     

超声微泡造影剂介导小鼠骨骼肌基因转染实验研究

目的探讨微泡造影剂在超声作用下是否可增加小鼠骨骼肌基因转染效率.方法 40只昆明小鼠随机分为4组,每组10只,第一组:在胫前肌注射造影剂与绿色荧光蛋白(GFP)质粒的混合溶液;第二组:注射与第一组相同的混合溶液后立即加超声辐照;第三组:注射GFP;第四组:在注射GFP后立即用超声辐照.7天后取小鼠胫前肌观察绿色荧光蛋白的表达情况.结果第一组与第二组有较多GFP表达,部分肌纤维绿色荧光较明亮,部分较暗淡;第三组和第四组GFP表达量较少.第一组与其余各组间的差异有显著性意义,P＜0.05;第二组与其余各组间的差异有显著性意义,P＜0.05;第三组与第四组间的差异无显著性意义,P＞0.05.结论超声微泡造影剂在超声作用下可明显增强小鼠骨骼肌的基因转染效率;未加超声波作用时,直接肌注携基因的超声微泡造影剂亦可增加小鼠骨骼肌的基因转染效率.     

超声介导SonoVue增效Survivin基因转染脐血来源树突状细胞的实验研究

目的探讨超声联合微泡造影剂Sono Vue增效脂质体介导的Survivin基因体外转染脐血来源树突状细胞的方法。方法体外培养扩增脐血来源的树突状细胞,在不同强度超声波和不同剂量造影剂Sono Vue作用下,观察脂质体介导的凋亡抑制因子Survivin基因与绿色荧光蛋白(GFP)共表达的融合重组质粒pEGFP-C1-Survivin在树突状细胞的定向转染。激光共聚焦显微镜定性观察细胞转化情况,流式细胞仪观察树突状细胞的表型变化及定量观察细胞转化效率,台盼蓝染色检测超声作用于细胞的安全性。结果脐血来源的树突状细胞以超声机械指数1.0、作用时间60s基因转染时对细胞比较安全,Sono Vue浓度为10%时达到最佳的基因转染效率。流式细胞仪检测转染前后树突状细胞的表型无明显变化,平均转化阳性率可达(51.4±2.5)%,高于单纯脂质体转染的效率(P<0.05)。结论超声联合微泡造影剂Sono Vue可提高脂质体介导的Survivin基因体外转染树突状细胞的效率,为肿瘤的基因及免疫治疗研究提供了新的思路。     

超声联合微泡造影剂介导FD500转入两种人前列腺癌细胞

目的 初步探索超声联合造影剂SonoVue辐照PC3和LNcap细胞的适宜条件,并比较超声辐照对两种细胞膜通透性和存活率的影响。方法 设不同的声强、辐照时间和造影剂浓度,采用1 MHz、连续声波于37℃水浴中分别辐照PC3和LNcap细胞。以流式细胞仪测量细胞发光率,以台盼蓝拒染法测算细胞存活率。结果 两种细胞的适宜辐照条件均为声强0.9 W/cm²、辐照时间40 s、造影剂浓度20%。辐照声强为1.5 W/cm²、辐照时间20 s、SonoVue浓度为20%时,PC3细胞的发光率高于LNcap细胞;在其余辐照条件下,PC3细胞的发光率小于或者等于LNcap细胞。PC3细胞的存活率在所有的辐照条件下均高于LNcap细胞(P＜0.05)。结论 优化各项辐照参数可以安全有效地增加细胞膜的通透性。     

超声介导声诺维提高人血管内皮细胞基因转染效率的体外实验研究

目的探讨使用超声破坏微泡造影剂-声诺维的方法对脂质体介导的增强型绿色荧光蛋白(EPGFP)基因转染人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的作用。方法在单孔培养皿中加入HUVEC细胞悬液,每孔加入脂质体介导EPGFP4μg,加或不加微泡造影剂或不同条件的超声辐照。24h后,用荧光显微镜及流式细胞仪测量EPGFP在细胞内的表达及基因的转染效率。结果超声组转染率提高,超声 微泡组转染率明显提高。超声 微泡组,超声辐照时间60s机械指数(MI)1.4组转染效率最高;超声机械指数1.0辐照时间90s组转染率最高。结论声诺维在超声作用下能明显提高脂质体介导的基因对细胞转染的效率,可能作为基因治疗的载体。