Tauroursodeoxycholic acid blocks lipolysis induced by TNF-α in 3T3-L1 adipocytes

目的 探讨牛黄熊脱氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)对TNF-α刺激3T3 -L1细胞脂肪分解及其可能的机制.方法 以3T3-L1前脂肪细胞经1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤、地塞米松、胰岛素诱导分化成3T3-L1脂肪细胞,设:①对照组;②TNF-α(50 ng/ml)组;③TUDCA(1 mmol/L) +TNF-α(50 ng/ml)组;④TUDCA组(1mmol/L).通过油红O染色观察脂滴形态变化并测定培养基中甘油含量作为评价脂肪分解的指标,同时用Western blot检测脂滴包被蛋白perilipin A蛋白表达.结果 TNF-α可以显著刺激3T3-L1细胞脂肪分解,包括功能学显示甘油释放量显著增加[(2.784±0.104) mmol/L,P＜0.01],形态学显示脂滴碎裂;TUDCA可以明显抑制TNF-α刺激的3T3-LI细胞脂肪分解,包括阻止脂滴形态的改变,逆转甘油的释放[(1.718±0.085)mmol/L,P＜0.01].通过Western blot检测结果显示TNF-α可以下调perilipin A蛋白表达[(0.227±0.004),P＜0.01],而TUDCA可以阻断TNF-α对perilipin A蛋白表达的下调作用[(0.705±0.066),P＜0.01].结论 TUDCA可能通过阻止perilipin A蛋白下调而抑制TNF-α诱发脂肪分解,通过减少游离脂肪酸FFA,从而对胰岛素抵抗、糖尿病等具有一定的改善作用.     

牛黄熊脱氧胆酸抑制TNF-α刺激3T3-L1细胞脂肪分解

目的探讨牛黄熊脱氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)对TNF-α刺激3T3-L1细胞脂肪分解及其可能的机制。方法以3T3-L1前脂肪细胞经1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤、地塞米松、胰岛素诱导分化成3T3-L1脂肪细胞,设:①对照组;②TNF-α(50 ng/ml)组;③TUDCA(1 mmol/L)+TNF-α(50 ng/ml)组;④TUDCA组(1 mmol/L)。通过油红O染色观察脂滴形态变化并测定培养基中甘油含量作为评价脂肪分解的指标,同时用Western blot检测脂滴包被蛋白perilipinA蛋白表达。结果 TNF-α可以显著刺激3T3-L1细胞脂肪分解,包括功能学显示甘油释放量显著增加[(2.784±0.104)mmol/L,P<0.01],形态学显示脂滴碎裂;TUDCA可以明显抑制TNF-α刺激的3T3-L1细胞脂肪分解,包括阻止脂滴形态的改变,逆转甘油的释放[(1.718±0.085)mmol/L,P<0.01]。通过Western blot检测结果显示TNF-α可以下调perilipin A蛋白表达[(0.227±0.004),P<0.01],而TUDCA可以阻断TNF-α对perilipin A蛋白表达的下调作用[(0.705±0.066),P<0.01]。结论 TUDCA可能通过阻止perilipin A蛋白下调而抑制TNF-α诱发脂肪分解,通过减少游离脂肪酸FFA,从而对胰岛素抵抗、糖尿病等具有一定的改善作用。     

高浓度葡萄糖刺激脂肪细胞脂肪分解的效应及其机制

目的:研究高浓度葡萄糖刺激脂肪细胞脂肪分解升高血浆游离脂肪酸(free fatty acid, FFA)水平的效应及其机制,进一步阐明高糖导致胰岛素抵抗的作用机制.方法:以Sprague-Dawley(SD)大鼠附睾原代脂肪细胞为研究对象,设为正常葡萄糖(5mmol/L)对照组和高浓度葡萄糖(25mmol/L)干预组.将细胞孵育一定时间直接或加入异丙基肾上腺素刺激后测定培养基中甘油含量作为评价脂肪分解的指标.脂肪分解数据表示为每升脂肪细胞压积的毫摩尔甘油释放量(mmol/L packed cell volume, mmol/L PCV).用Western blot方法分别检测总的及磷酸化的脂滴包被蛋白(perilipin)含量以及激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive lipase, HSL)和脂肪组织甘油三酯水解酶(adipose triglyceride lipase, ATGL)的含量.用酶化学法测定胞浆脂肪分解酶活性.结果:高浓度葡萄糖明显刺激大鼠原代脂肪细胞脂肪分解.将细胞在高糖中孵育24h,甘油累积量从4.4mmol/L PCV增加至6.4mmol/L PCV,即增加1.5倍(P<0.01);30min甘油释放量从0.11mmol/L PCV增加至0.24 mmol/L PCV,即增加2.1倍(P<0.01).高糖刺激脂肪分解的作用从细胞孵育16h开始持续到24h,且25mmol/L葡萄糖的效应较10mmol/L葡萄糖强.高糖明显增加perilipin磷酸化,但不影响该蛋白表达.高糖使胞内脂肪分解酶活性升高1.74倍并显著上调HSL蛋白表达,但不影响ATGL蛋白含量.异丙基肾上腺素刺激的脂肪分解在高糖环境下进一步增强.结论:高浓度葡萄糖通过增加perilipin磷酸化、上调HSL蛋白表达和升高脂肪分解酶活性从而直接刺激脂肪细胞脂肪分解.这提示高浓度葡萄糖单独即可以使FFA从脂肪组织向血浆中释放增加,循环FFA水平升高从而导致胰岛素抵抗.     

PPARγ基因修饰对兔骨髓间充质干细胞成脂分化及ADRP、LPL表达的影响

目的观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）基因转染对免骨髓间充质干细胞（MSCs）向脂肪细胞分化的影响,探讨PPARγ在脂肪细胞早期分化中可能的调控机制。方法原代培养新西兰大白兔MSCs,应用脂质体介导法将pEGFP-N1-PPARγ表达载体转入MSCs中,G418筛选。分成不诱导组、空转染诱导组及转染诱导组以成脂诱导剂诱导分化,每日观察细胞形态学变化,镜下计数并计算脂肪细胞分化率,采用RT-PCR方法检测脂肪分化相关蛋白（ADRP）、脂蛋白脂酶（LPL）mRNA表达,Western blot检测ADRP、LPL蛋白表达。结果不诱导组细胞内没有脂滴出现,空转染诱导组和转染诱导组部分细胞成功分化为脂肪细胞,转染诱导组分化率明显高于空转染诱导组（P〈0.05）;不诱导组ADRP、LPLmRNA及蛋白均不表达,转染诱导组ADRP、LPLmR-NA及蛋白表达水平显著高于空转染诱导组（P〈0.05）。结论PPAR-γ基因转染MSCs可促进其向脂肪细胞分化,增强其分化能力,可能与促进ADRP、LPL基因和蛋白的表达有关。     

PPARγ基因转染对兔骨髓间充质干细胞向脂肪细胞早期分化的影响

目的:探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)基因表达在骨髓间充质干细胞(MSC)向脂肪细胞早期分化中的调控作用及对脂肪分化相关蛋白(ADRP)表达的影响.方法:原代培养新西兰大白兔MSC,应用脂质体转染法将pEGFP-N1-PPARγ表达载体转入MSC中,G418筛选.成脂诱导剂诱导向脂肪细胞分化,RT-PCR检测PPARγ,ADRPmR-NA表达,Western Blot检测ADRP蛋白表达,细胞形态学、油红O染色法行脂肪细胞计数和定量.结果:未分化的MSC中PPARγ,ADRPmRNA不表达,经pEGFP-N1-PPARγ转染后,调控成脂肪细胞方向分化的转录因子和早期标志PPARγmRNA(0.87±0.08 vs 0.28±0.01,P<0.01),ADRPmRNA(0.52±0.03 vs 0.21±0.02,P<0.01)表达增强;MSC向成脂肪细胞方向分化,成脂率及脂质量提高,分别为(78.5±4.2)% vs (51.4±3.0)%和(0.46±0.05) vs (0.21±0.02),P<0.05;分化成脂的细胞ADRP蛋白表达呈阳性,转染组较空转染组表达增强.结论:PPARγ在MSC向脂肪细胞分化的早期中起重要的正向调节作用,并促进ADRP基因和蛋白的表达;PPARγ基因过表达可增强MSC向脂肪细胞分化的能力,缩短分化进程,提高分化效率,可能与增强ADRP的表达有关.     

Perilipin对脂肪细胞内三酰甘油的代谢调控作用

三酰甘油贮存在哺乳动物细胞内脂滴中,脂滴表面镶嵌着多种蛋白,对脂滴功能具有重要调节作用,因此脂滴也越来越多地被认为是一种代谢活跃的细胞器。新近的研究表明脂滴表面PAT家族蛋白perilipin对脂肪细胞内三酰甘油的代谢起全局性调控作用,本文就脂肪细胞内perilipin的功能予以综述。     

白细胞介素6对人原代脂肪细胞增殖分化的影响

目的:近来研究显示,肥胖是一种慢性低度炎症,脂肪组织能够分泌众多炎性因子,其中,白细胞介素6(IL-6)是最重要的介质之一.文中观察IL-6对人原代脂肪细胞的增殖和分化的影响.方法:用酶消化法获得人原代脂肪细胞,MTT法检测人原代脂肪细胞生长增殖的状况.分化液诱导脂肪细胞分化至产生脂滴,同时用不同浓度IL-6(0、1、5、10、50、100、1000pg/ml)干预脂肪细胞分化,油红O染色测定脂肪细胞脂滴合成状况.结果:IL-6能抑制脂肪细胞的增殖,其中5pg/ml组细胞增殖被抑制14.1%(P＜0.05),10 pg/ml组被抑制18.7%(P＜0.05).IL-6能够抑制细胞分化,减少脂肪的合成,其中1pg/ml组最为明显(P＜0.05).结论:IL-6能有效抑制人原代脂肪细胞的增殖,并且抑制人原代脂肪细胞从前脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化.     

G_0S_2基因参与调节鼠骨髓基质细胞向脂肪细胞分化

目的:探讨G_0S_2在调节鼠骨髓基质细胞向脂肪细胞分化过程中的作用.方法:利用原代培养小鼠骨髓基质细胞(Marrowstrom cell,MSC),脂质体转染法将表达质粒pCAG-PPARγ2及含报告基因的pGL_2-COL_1A质粒共转染至MSC,G418筛选,RT-PCR检测PPARγ及G0S2mRNA表达,免疫组化检测PPARγ的表达,westen blot检测G_0S_2的表达,油红O染色检测细胞内脂滴.结果:MSC在未分化状态下不表达G_0S_2,经PPARγ基因转染后,G_0S_2开始表达,转染细胞最终分化为脂肪细胞.结论:PPARγ通过调节G_0S_2启动子调节后者表达,进而调节MSC向脂肪细胞分化,G_0S_2基因参与调节MSC向脂肪细胞分化.     

胰岛素的长期作用对人脂肪细胞代谢的影响

目的探讨胰岛素的长期作用对人脂肪细胞脂代谢的影响.方法检测不同浓度胰岛素作用24h后脂肪细胞甘油释放率的基础值和刺激值，并使用RT-PCR检测脂肪分解的关键酶激素敏感性脂酶(HSL)和肿瘤坏死因子-α的表达.结果胰岛素的长期作用可增加脂肪细胞的甘油释放率,并呈剂量效应和时间效应,100、500、1 000 nmol/L的胰岛素可使甘油释放率的基础值和刺激值分别增加17%-47%和28%-241%(P<0.01).胰岛素的长期作用对脂肪细胞的HSL mRNA表达无影响,TNF-αmRNA的表达明显增加.结论在体外胰岛素的长期作用与其短期作用有所不同,可增加脂肪细胞的脂肪分解,具脂肪分解作用的TNF-α表达增加可能发挥了一定的作用.     

内脂素基因在3T3-L1前脂肪细胞诱导分化过程中表达水平的变化

目的观察3T3-L1前脂肪细胞诱导分化过程的不同时段内脂素基因表达水平的变化,探讨内脂素基因与脂肪细胞分化、脂质积聚之间的关系。方法体外培养3T3-L1前脂肪细胞,在该细胞生长至完全汇合（con-fluent）后2d,采用经典的鸡尾酒方法诱导其分化,并于诱导分化过程中用油红O染色鉴定脂肪细胞分化情况,采用RT-PCR和Western blot技术检测内脂素基因表达的变化规律。结果油红O染色显示,细胞内脂滴逐渐增大、增多,至分化末期占视野90%以上。内脂素基因在诱导分化初期不表达,分化第2天开始表达,分化第4~8天表达显著上调,分化至第10~12天,内脂素基因表达保持在较高水平并趋于稳定。其中,诱导分化后第6~12天较分化第0天显著升高（P〈0.05）,诱导分化第10~12天较第2~6天显著升高,诱导分化第12天较第6~8天显著升高（P〈0.05）。Western blot方法检测结果显示,随细胞分化成熟内脂素蛋白表达水平逐渐升高。结论内脂素基因与脂肪细胞分化和脂质积聚有密切的关系。     

蛋白转导域蛋白转运研究进展

蛋白转导域（protein transduction domain,PTD）是一种很有前景的蛋白转运工具,体内和体外实验显示其可以有效的将外源性蛋白转运入细胞内,已有多种方法用于改建PTD,证实PTD变体具有同样的蛋白转导特性。现就PTD的蛋白转运研究进展进行综述。     

BAG5蛋白与帕金森病相关蛋白Parkin的相互作用

目的：探讨BAG5（BCL2-associated athanogene 5）蛋白与帕金森病相关蛋白Parkin之间是否存在相互作用,以及BAG5对Parkin蛋白水平的调控机制。方法：本研究首先运用GST pull-down技术及免疫共沉淀技术验证BAG5蛋白与Parkin蛋白在体内及体外是否存在相互作用;进一步构建BAG5的不同截短型,运用GST pull-down技术验证BAG5与Parkin的相互结合结构域;进而运用chase time技术验证BAG5对Parkin蛋白降解水平的调控;最后运用免疫共沉淀技术验证BAG5对Parkin降解水平的调控是通过何种机制进行的。结果：BAG5蛋白与Parkin蛋白体内及体外均可以相互结合,且BAG5与Parkin的相互结合结构域存在于全长的4段BAG区域内;BAG5可以通过减少Parkin的降解而稳定细胞内Parkin蛋白的水平,且BAG5是通过减少Parkin通过泛素蛋白酶体降解系统(ubiquitin proteasome system, UPS）的降解从而增加Parkin蛋白的稳定性。结论：BAG5蛋白与Parkin蛋白可以相互结合,且BAG5蛋白可以通过UPS对Parkin的水平进行调节。     

对氧磷酶1融合蛋白的表达及其生物活性

目的：利用家蚕表达系统表达含蛋白转导肽P11的人血清对氧磷酶1（paraoxonase 1,PON1）融合蛋白,并对其抗敌敌畏（dichlorvos,DDVP）毒性的生物活性进行初步研究。方法 P11-PON1融合基因构建于家蚕表达载体pFastBac 5B多克隆位点,转化家蚕DH10BmBac 感受态细胞,收集病毒粒子并感染家蚕5龄幼虫,感染96 h 后,收获蛋白;SDS-PAGE 电泳分析P11-PON1融合蛋白占家蚕总蛋白比例,计算蛋白含量;利用小鼠和斑马鱼鉴定P11-PON1融合蛋白抗DDVP毒性的生物活性;每只小鼠灌胃或直肠给P11-PON1融合蛋白1mg,给药后立刻和3 h后,腹腔注射DDVP溶液20 mg/kg,观察小鼠中毒状态,计算存活率;P11-PON1融合蛋白溶于斑马鱼养殖水中,浓度分别为1、2.5、5、10和20 mg/L,给药后立刻和3 h 后加入终浓度为50 mg/L的DDVP溶液染毒,观察斑马鱼的行为变化,计算存活率。结果成功表达了P11-PON1融合蛋白,该蛋白占家蚕5龄虫总蛋白的8%;灌胃给予P11-PON1融合蛋白没有提高染毒小鼠的存活率;直肠给药后立刻染毒也没有显著提高小鼠存活率,而直肠给药3 h后再腹腔注射DDVP染毒,小鼠存活率显著提高（P＆lt;0.01）;斑马鱼给予P11-PON1融合蛋白后立即染毒DDVP,斑马鱼存活率并没有显著性提高,而给予P11-PON1融合蛋白3 h后再染毒DDVP,斑马鱼存活率显著提高,其中融合蛋白20和10 mg/L组24 h存活率均为62.5%,5 mg/L组存活率为50%,与对照组相比,差异显著提高（P ＆lt;0.01）;2.5 mg/L组存活率为41.7%,与对照组相比差异有显著提高（P ＆lt;0.05）。结论家蚕能够表达P11-PON1融合蛋白,该融合蛋白提前给药能降低DDVP对小鼠和斑马鱼的毒性作用。     

p-ERK与Bim蛋白在子宫内膜癌中的表达及意义

目的 探讨不同类型子宫内膜组织中p-ERK与Bim蛋白的表达及意义以及两者的相关性.方法 采用免疫组织化学方法 检测10例正常子宫内膜组织.12例非典型增生子宫内膜组织,51例子宫内膜癌组织中p-EPK和Bim蛋白表达及意义.结果 p-ERK蛋白在正常子宫内膜、非典型增生子宫内膜和子宫内膜癌中的表达逐渐升高,且3者之间的差异具有显著性(P＜0.05).Bim蛋白在3者中的表达逐渐下降,3者之间的表达差异具有显著性(P＜0.05).P-ERK在子宫内膜癌Ⅲ、Ⅳ期的表达水平显著高于Ⅰ期和Ⅱ期(P＜0.05).P-ERK和BIM蛋白在不同子宫内膜组织中的表达阳性率呈明显的相关性(P＜0.05).结论 p-ERK和BIM蛋白在子宫内膜癌的发生发展过程中起到一定的作用,p-ERK通过使Bim蛋白下调抑制其抗凋亡活性,促使子宫内膜逐渐发生癌变.     

p16、DAPK蛋白在宫颈癌中的表达及意义

目的探讨p16、DAPK蛋白在宫颈癌中的表达及意义。方法采用免疫组化的方法分别检测60例宫颈癌和20例对照组宫颈组织中p16、DAPK蛋白的表达,并分析结果。结果 p16蛋白的表达在宫颈癌组和对照组中的阳性率分别为100%、17.65%,统计学差异有显著性（P〈0.05）;DAPK蛋白表达的阳性率分别为8.33%、85.0%,统计学差异有显著性（P〈0.05）。结论 P16基因和DAPK基因作为抑癌基因,可能参与了宫颈癌的发生发展,有可能成为有价值的宫颈癌分子标记物。     

金黄色葡萄球菌IsdB表位蛋白与HBc蛋白融合表达

目的:采用大肠杆菌表达HBc-IsdB_50-285融合蛋白,探讨其在原核表达系统中的表达效果。方法:设计并克隆HBc-IsdB_50-285融合基因片段,构建表达质粒pET-28-HBc-IsdB_50-285,并转化入E.coli BL21,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达。SDS-PAGE分析蛋白可溶性及相对分子质量;BCA法测蛋白浓度;采用免疫接种法检测重组蛋白的免疫活性。40只小鼠随机分为rIsdB+adjuvant组、HBc-IsdB_50-285+adjuvant组、HBc-IsdB_50-285组和PBS组,每组10只,间接ELISA法检测小鼠特异性IgG效价值,采用金黄色葡萄球菌Newman株对免疫后小鼠攻毒,检测各组小鼠重组蛋白免疫保护效果。结果:表达质粒pET-28-HBc-IsdB_50-285经测序及酶切鉴定证明构建正确;SDS-PAGE分析,重组蛋白以部分可溶形式存在于培养上清中,相对分子质量约为44 000,亲和纯化后蛋白质水平为1.0 g·L^-1。ELISA检测,使用rIsdB蛋白包被酶标板,HBc-IsdB_50-285+adjuvan组小鼠血清特异性抗体滴度的效价值低于rIsdB+adjuvant组(P<0.01);使用HBc-IsdB_50-285蛋白包被酶标板,HBc-IsdB_50-285+adjuvant组的小鼠血清特异性抗体滴度的效价值高于rIsdB+adjuvant和HBc-IsdB_50-285组。攻毒实验,HBc-IsdB_50-285+adjuvant组小鼠对金黄色葡萄球菌免疫保护率低于rIsdB+adjuvant组,但差异无统计学意义(P>0.05);且其与HBc-IsdB_50-285未添加佐剂组比较差异也无统计学意义(P>0.05);与PBS组比较,HBc-IsdB_50-285+adjuvant组小鼠对金黄色葡萄球免疫保护率升高(P<0.01),HBc-IsdB_50-285组小鼠对金黄色葡萄球菌攻毒保护率亦升高(P<0.05)。结论:HBc-IsdB_50-285原核表达载体构建成功;在大肠杆菌中成功表达具有较好生物活性的HBc-IsdB_50-285融合蛋白。     

Cationic antimicrobial protein of Mr 37 kDa: a multifunctional inflammatory protein

Purpose　To investigate the role of cationic antimicrobial protein of Mr 37?kDa (CAP37) a neutrophil-derived inflammatory mediator on endothelial cell function. Data sources　Endothelial cells used in this study were obtained from human lung microvessels and rat aorta. The latter was a kind gift of Dr. Paula Grammas. The mono-mac 6 cell line used in this study was the generous gift of Dr. H.W. Loms Ziegler-Heitbrock. Study selection and data extraction　Endothelial cell proteins kinase C activity was determined by measuring calcium- and phospholipid-dependent phosphorylation of histone. Endothelial cell migration was determined using CostarTM Transwell apparatus. Cell surface expression of adhesion molecules, ICAM-1 and PECAM-1 was determined using flow cytometry. RT-PCR was used to amplify the CAP37 from endothelial cells treated with LPS. Results　We demonstrated that CAP37 which was originally identified as having potent antimicrobial activity and chemotactic activity for monocytes was capable of modulating endothelial cell functions. CAP37 activated endothelial cell protein kinase C in a dose- and time-dependent fashion. Importantly CAP37 increased the adhesive properties of the endothelium for monocytes. CAP37 upregulated the well known adhesion molecules, ICAM-1 and PECAM-1 in a dose- and time- dependent manner. In addition, CAP37 promoted endothelial cell migration. Further investigations indicated that CAP37 was induced in endothelial cells in response to pro-inflammatory cytokines such as tumor necrosis factor-α and interleukin-1α as well as inflammatory mediators such as lipopolysaccharide. Unstimulated endothelial cells did not constitutively express CAP37. The cDNA sequence of endothelial CAP37 was determined and found to be highly homologous to the sequence obtained for neutrophil-derived CAP37. Conclusions　Our studies strongly suggest that CAP37 plays a pivotal role in monocyte-endothelial interactions and the transmigration of monocytes from the vasculature into extravascular tissues.     

Bcl-2蛋白和Bax蛋白在上皮性卵巢癌中的表达及临床意义

目的探讨Bcl-2蛋白和Bax蛋白在上皮性卵巢癌中的表达及临床意义。方法应用免疫组织化学S-P法检测30例正常卵巢组织、30例良性上皮性卵巢肿瘤、56例上皮性卵巢癌组织中的Bcl-2蛋白及Bax蛋白的表达情况,分析其表达与不同临床病理特征的关系。结果 Bcl-2蛋白、Bax蛋白在上皮性卵巢癌中的表达率分别为58.93%和33.93%,二者在上皮性卵巢癌中的表达率明显高于在良性上皮性卵巢肿瘤及正常卵巢组织中的表达率（P〈0.05）;上皮性卵巢癌组织中Bcl-2蛋白的表达与年龄、组织学类型无关（P〉0.05）,而与手术-病理分期、有无腹水有关（P〈0.05）;上皮性卵巢癌中Bax蛋白的表达与年龄、组织学类型、手术-病理分期、有无腹水均无关（P〉0.05）。结论 Bcl-2蛋白和Bax蛋白在正常卵巢组织中无表达,而在卵巢癌组织中有较高水平表达,提示Bcl-2蛋白和Bax蛋白可能参与了卵巢癌的发生、发展过程。