三种阳离子脂质体转染效率的测定

目的 测定研制的３种阳离子脂质体（Ａ,Ｂ,Ｃ）的转染效率,并且与ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ的转染效率进行比较。方法 采用分子克隆的方法。将ｌｕｅ基因片段插入ｐｃＤＮＡ３载体。以质粒ｐｃＤＮＡ３－ｌｕｃ与一定量的阳离子脂质体及ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ转染食管癌Ｅａ１０９细胞,一定时间后测定荧光强度以确定ｌｕｃ的表达量。结果 成功地构字质粒ｐｃＤＮＡ３－ｌｕｅ,转染后,。发现阳离子脂质体Ａ的转染效率较高,接近ｌ     

脂质体介导法转染mIMCD-3细胞的可行性及最佳转染条件

背景：近年来阳离子脂质体成为基因转移较为常用的载体,但应用脂质体对mIMCD-3细胞株进行转染的相关报道较少。 目的：探讨脂质体法转染mIMCD-3细胞株的可行性,并通过优化脂质体转染效率的影响因素,获得mIMCD-3的最佳转染条件。 方法：以绿色荧光蛋白作为报告基因,采用脂质体Lipofectamine^TM 2000包裹pIRES2-EGFP质粒转染mIMCD-3细胞,分别按照细胞接种密度、DNA用量、DNA与脂质体的比例、不同的质粒抽提方法、血清有无设定分组,观察以上因素对mIMCD-3细胞转染效率的影响。 结果与结论：采用脂质体Lipofectamine^TM 2000转染mIMCD-3细胞,在2×10⁸ L^-1细胞接种浓度、1 μg DNA用量、1∶3的DNA与脂质体比例时,转染效率最高。采用美国OMEGA公司生产的E.Z.N.A. Endo-Free Plasmid Mini Kit抽提的质粒能获得更高的转染效率。转染前漂洗细胞后换入无血清培养基比有血清组转染效率高(P < 0.01),而转染后6 h加入血清不影响转染效率。结果显示,脂质体法转染mIMCD-3细胞株是可行的,通过优化脂质体转染效率的影响因素,获得了mIMCD-3的最佳转染条件,可作为有关研究或应用的参考。     

L_(IPOFECT)AMINE~(TM)试剂:一种新的高效多聚阳离子脂质体转染试剂

阳离子脂质简化了核酸序列转入真核细胞的过程,最初用于转染的脂质包括L_(IPOFECTIN)及L_(IPOFECT) ACE~(TM)、DOTAP,它们都是单价阳离子。L_(IPOFECT) AMINE,一种新的脂质体配方包含一种带有精胺头部的多聚阳离子脂质,可以在大多数类型的细胞中提高转染效率,比单价阳离子脂质体试剂的活性高出30倍。本报道通过转染和人原代成纤维细胞将L_(IPOFECT) AMINE与其它几种可购买到的单阳离子脂质试剂进行了比较。同时对转染条件的确定和优化进行了阐述。     

脂质体介导转染N2a细胞的优化方法

背景:阳离子脂质体介导的细胞转染具有结果可靠、可重复性强的特点,但面临一个共同的缺点,就是转染效率常较低。目的:探讨阳离子脂质体转染N2a细胞(小鼠神经胶质瘤细胞)的优化方法。方法:采用24孔培养板,1.5μL阳离子脂质体Lipofectamine?LTX介导,通过贴壁法和悬浮法,将500 ng带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组质粒pcDNA3-GFP转入N2a细胞,倒置荧光显微镜观察细胞内绿色荧光蛋白表达情况,并比较二者转染效率。采用悬浮转染法,将500 ng质粒DNA分别用1.0,1.5,2.0,2.5μL Lipofectamine?LTX进行转染,探讨最适脂质体和DNA比例。结果与结论:1.5μL脂质体/500 ng DNA,悬浮法转染效率显著高于贴壁法转染效率(P0.01);1.0,1.5,2.0,2.5μL Lipofectamine?LTX对500 ng质粒DNA的转染效率分别为(76.60±3.85)%,(80.00±4.17)%,(88.00±5.89)%,(54.96±4.23)%,提示脂质体2.0μL与质粒DNA 500 ng的转染效率最高。     

人α-防御素HNP1基因在气管上皮细胞转染的表达研究

目的　探讨人α防御素ＨＮＰ１ 基因在气管上皮细胞转染表达的可行性。方法　采用脂质体转染法将ＨＮＰ１ ｃＤＮＡ 重组真核表达质粒ｐＢａｂｅＮｅｏＨＮＰ１ 导入无血清培养的人、兔气管粘膜上皮细胞,利用逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ） 法及免疫组化法,分别在核酸水平及蛋白质水平检测ＨＮＰ１ 的表达。结果　用ＲＴＰＣＲ 在人和兔的转染上皮细胞总ＲＮＡ 提取物中均扩增出１ 条３１９ｂｐ 的ＤＮＡ 片段,与ＨＮＰ１ ｃＤＮＡ 片段大小一致, 而在未转染的上皮细胞总ＲＮＡ 中没有扩增出相应ＤＮＡ片段。免疫组化法检测到转染细胞呈强阳性反应,未转染细胞呈阴性反应,与ＲＴＰＣＲ 法检测的结果一致。结论　实验在ｍ ＲＮＡ 和蛋白质水平上均提示重组真核表达质粒ｐＢａｂｅＮｅｏＨＮＰ１ 转染气管粘膜上皮细胞后,能有效表达ＨＮＰ１ 分子。     

阳离子脂质体-DNA复合物与脂质-鱼精蛋白-DNA复合物体外细胞转染率比较

采用薄膜-挤压法制备空白阳离子脂质体后,再分别制得阳离子脂质体-DNA复合物和脂质-聚阳离子-DNA复合物(Lipid-polycation-DNA lipopolyplexes,LPD);用凝胶阻滞实验,确定阳离子脂质体与质粒DNA的配比;用透射电镜观察阳离子脂质体-DNA复合物和LPD的形态,用激光粒度仪测定它们的粒径和zeta电位;用酶标仪测定它们对张氏(Chang)肝细胞、HepG2肝癌细胞的转染率。结果表明阳离子脂质体-DNA复合物和LPD的形态均近似于球体,但LPD的粒径明显较小;LPD对张氏(Chang)肝细胞和HepG2肝癌细胞的转染率均高于阳离子脂质体-DNA复合物。LPD是基因治疗的临床应用中一种更具前景的载体系统。     

脂质体介导的p53基因对肝癌细胞生长的抑制作用

目的 观察外源野生型ｐ５３基因在肝癌基因治疗方面的可行性。方法 将载有人野生型ｐ５３－ｃＤＮＡ的真核表达质粒ｐ５３－ｐｃＤＮＡ３,用阳离子脂质体介导转染人肝癌细胞系ＨｅｐＧ２,用流式细胞仪检测ｐ５３－ｐｃＤＮＡ３对ＨｅｐＧ２细胞生长的影响。结果 通过观察细胞生长曲线与流式细胞仪检测细胞周期和细胞的凋亡指数发现,ＨｅｐＧ２细胞生长受到明显的抑制。结论 脂质体介导的ｐ５３基因可在Ｈ细胞中表达,且明显抑     

阳离子脂质体介导增强型绿色荧光蛋白质粒转染骨骼肌卫星细胞

背景：骨骼肌卫星细胞是一种具有多向分化能力的全能干细胞,存在于骨骼肌间质中,对缺血、缺氧有一定的耐受力,是干细胞工程中重要来源细胞。 目的：为联合基因工程细胞心肌成形治疗初步探讨较为简便、经济的骨骼肌卫星细胞体外培养方法,建立一种简单、高效的转染骨骼肌卫星细胞的方法及探讨转染后基因表达的特点。 方法：分离、培养兔大腿骨骼肌卫星细胞,用CKK-8法测定其生长曲线。根据质粒和脂质体不同比例分组,用脂质体介导增强型绿色荧光蛋白质粒(plasmid enhanced green fluorescent protein,pEGFP)转染骨骼肌卫星细胞。测定各组转染效率及目标基因表达特点。 结果与结论：成功分离培养骨骼肌卫星细胞及转染pEFGF。在合适的质粒和脂质体比例下,转染效率可达35%以上。目标蛋白在转染12 h内开始表达,48-72 h表达最强,1周后逐渐减弱,2周后仍可观察到其表达。阳离子脂质体可介导pEGFP高效转染骨骼肌卫星细胞,转染效率与质粒、脂质体比例密切相关,目标基因表达随时间改变。     

阳离子脂质体及其在体内基因转染中的应用

阳离子脂质体已经成为基因转移使用最广泛的载体之一。本文从阳离子脂质体的理化特性、质粒/阳离子脂质复合体与生物大分子的相互作用、质粒/脂质复合体的基因转移机制等方面,对阳离子脂质体及其在体内基因转染中的应用进行了综述。     

DNA－转染体细胞系产生单克隆抗体

本文研究淋巴细胞转染体的产生和转染体单克隆抗体的抗原结合特性。以小鼠宫颈癌细胞系Ｕ１４为抗原免疫小鼠。将制备的Ｕ１４和小鼠骨髓瘤细胞系ＳＰ２／０ＤＮＡ分别转染经免疫的小鼠原代脾细胞。将所形成的转染体细胞进行克隆，建成２株淋巴细胞转染体细胞系ＵＤ和ＳＤ，它们能连续生长于含血清和无血清培养液中，但不能在同基因小鼠体内生长。ＵＤ和ＳＤ细胞系所产生的单克隆抗体不仅能与小鼠宫颈癌细胞表面抗原及其可溶性抗原发生特异反应，且能识别人宫颈癌组织和宫颈癌病人血清中的肿瘤抗原决定簇。本实验结果进一步证明了我们提出的肿瘤“进化抗原”理论，并提示，瘤细胞ＤＮＡ转染造成淋巴细胞永生化，可能是产生人源性单克隆抗体具有前景的途径。     

DNA－转染体细胞系产生单克隆抗体

本文研究淋巴细胞转染体的产生和转染体单克隆抗体的抗原结合特性．以小鼠宫颈癌细胞系Ｕ１４为抗原免疫小鼠。以制备的Ｕ１４和小鼠骨髓瘤细胞系Ｓｐ２／０ＤＮＡ分别转染经Ｕ１４免疫的小鼠原代脾细胞．将所形成的转染体细胞进行克隆，建成２株淋巴细胞转染体细胞系ＵＤ和ＳＤ．它们能连续生长于含血清和无血清培养液中，但不能在同基因小鼠体内生长．ＵＤ和ＳＤ细胞系所产生的单克隆抗体不仅能与小鼠宫颈癌细胞表面抗原及其可溶性抗原发生特异反应，且能识别人宫颈癌组织和宫颈癌病人血清中的肿瘤抗原决定簇．本实验结果进一步证明了我们提出的肿瘤＂进化抗原＂理论，并提示瘤细胞ＤＮＡ转染造成的淋巴细胞永生化，可能是产生人源性单克隆抗体具有前景的途径．     

叶酸聚乙二醇接枝支化聚乙烯亚胺纳米载体转染螺旋神经节细胞

背景:新型阳离子纳米材料叶酸聚乙二醇接枝支化聚乙烯亚胺易于合成和改性,稳定性好,结构及性能容易调控,已被作为基因治疗转染载体应用于多种疾病的研究。目的:观察叶酸聚乙二醇接枝支化聚乙烯亚胺转染体外培养小鼠内耳螺旋神经节细胞的可行性及特点。方法:分别以叶酸聚乙二醇接枝支化聚乙烯亚胺(实验组)、阳离子脂质体Lipofectamine?2000(对照组)作为载体,制备携带增强型绿色荧光蛋白的转染载体系统。将昆明小鼠螺旋神经节细胞分别培养于含实验组和对照组转染载体系统的DMEM/F-12培养基中,培养24 h后,MTT法观察载体系统的细胞毒性,倒置荧光显微镜观察细胞形态及绿色荧光蛋白表达强度,流式细胞仪检测细胞转染率。结果与结论:两种载体分别转染后,螺旋神经节细胞形态均未发生明显改变,但两组载体对螺旋神经节细胞均有一定的毒性,实验组载体毒性较小且转染效率较高(P0.05)。结果说明叶酸聚乙二醇接枝支化聚乙烯亚胺基因转染体外螺旋神经节细胞的转染效率及细胞毒性均优于传统的阳离子脂质体。     

Canstatin RNA转染对兔血管平滑肌细胞体外增殖的抑制作用

目的:探讨canstatin对体外培养的兔血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响。方法:将阳离子脂质体介导的canstatinRNA转染VSMC,应用细胞计数,[³H]-TdR掺入率测定观察canstatin基因对VSMC增殖的作用。结果:阳离子脂质体介导的canstatinRNA可有效地转染VSMC并能显著地抑制VSMC的增殖及其DNA的合成率。结论:Canstatin基因可抑制体外培养的VSMC的增殖.     

脂质体介导RNAi的研究

本文选用阳离子脂质体Lipofectamine 2000为基因载体,使用沉默荧光素酶基因的小干扰RNA(siRNA)进行体外RNA干扰(RNAi),对阳离子脂质体转运siRNA的效率进行研究。首先以阳离子脂质体运载质粒DNA转染细胞,并以延滞实验对阳离子脂质体与siRNA的结合能力进行检测;然后通过基因载体将荧光素酶基因载入细胞,转运不同浓度的siRNA对其进行沉默,应用酶标仪对荧光素酶基因的表达进行分析,并用MTT法对转染后细胞存活率进行检测。结果表明:阳离子脂质体Lipofectamine 2000可以高效转运质粒DNA,并可与siRNA很好地结合。在较低的siRNA浓度下,对荧光素酶基因的沉默率达到较高的水平,转运siRNA转染细胞对细胞活性的影响很小,但细胞存活率随着siRNA浓度的增加而逐渐降低。通过优化实验条件,阳离子脂质体转运较低浓度的siRNA即可高效沉默目的基因。     

DNA—转染体细胞系产生单克隆抗体

本文研究淋巴细胞转染体的产生和转染体单克隆抗体的抗原结合特性。以小鼠宫颈癌细胞系Ｕ１４为抗原免疫小鼠。将制备的Ｕ１４和小鼠骨髓瘤细胞系ＳＰ２／０ＤＮＡ分别转染经免疫的小鼠原代脾细胞。将所形成的转染体细胞进行克隆，建成２株淋巴细胞转染体细胞系ＵＤ和ＳＤ，它们能连续生长于含轿清和无血清培养液中，但不能在同基因小鼠体内生长。ＵＤ和ＳＤ细胞系所产生的单克隆抗体不仅能与小鼠宫颈癌细胞表面抗原及其可溶性抗原发     

β-葡萄糖醛酸苷酶基因转染的人肾癌细胞的生物学特性观察

目的：建立高表达β-葡萄糖醛酸苷酶(以下简称βG)基因的肾癌细胞模型，并观察转染细胞的生物学特性。方法：构建真核表达载体pcDNA3．1—βG，并利用阳离子脂质体介导将其转人人肾癌细胞株GRC—1中。用mRNA打点杂交和Westemblot，鉴定其转录与表达水平，并通过光镜、电镜及细胞增殖周期检测等方法，观察转染细胞的生物学特性。结果：在mRNA与蛋白水平证实，转染细胞内有βG基因的高表达。透射电镜观察，转染细胞中的溶酶体、内质网丰富，细胞微绒毛及突起增多，但转染前后肾癌细胞GRC—1的周期及生长情况无显著性差别。结论：应用脂质体介导法，将βG基因导人人肾癌GRC—1细胞后，获得生物学特性稳定βG基因高表达的肾癌细胞模型，为进一步研究奠定了基础。     

脂质体转染Akt基因对心肌细胞缺血-再灌注的影响

目的 研究转染脂质体介导的Akt基因对心肌细胞缺血-再灌注的影响.方法 采用新生SD大鼠进行心肌细胞培养,建立模拟缺血/再灌注模型,将脂质体介导的人Akt基因转染心肌细胞.实验分5组:对照组(control组)、缺血/再灌注组(I-R组)、转染Akt基因组(Akt组)、转染阳离子脂质体空载体组(Vehicle control组)和Akt抑制剂组(Akt blockade组).各组进行缺血-再灌注后以MTS比色法检测细胞活性,测定乳酸脱氢酶(LDH)活性、丙二醛(MDA)含量.结果 Akt组较I/R组、Vehicle control组和Akt blockade组LDH、MDA 明显降低,细胞活性高(P＜0.05).结论 脂质体介导的Akt基因转染心肌细胞可保护心肌、减轻心肌细胞缺血-再灌注损伤.     

脂质体介导E1A-TK基因转染人肺腺癌细胞A549体外研究

目的用脂质体转染真核表达质粒PcDNA3E1A-TK人人肺腺癌细胞A549,观察丙氧鸟苷（GCV）、X射线及二者联合对转染细胞的体外杀伤作用。方法用阳离子脂质体介导真核表达质粒PcDNA3E1A-TK转染人肺腺癌细胞A549,PCR、RT—PCR方法分别检测转染细胞中E1A—TK基因DNA整合、mRNA表达。MTT法测不同浓度GCV、不同剂量X射线及一定剂量X线照射后再给一定量GCV对转染细胞的生长抑制率。结果PCR、RT-PCR结果表明转染细胞有E1A-TK基因整合、mRNA表达。根据IC50,转染细胞对GCV、X射线的敏感性分别比亲代细胞提高111．3倍和2．9倍,在作用相同时间后,GCV＋X线照射治疗对转染细胞的生长抑制作用比单纯GCV或X线治疗明显增强（P〈0．01）。结论脂质体介导外源基因E1A—TK成功转入人肺腺癌A549细胞并获得表达：转染细胞获得了对GCV和X线的敏感性,GCV和X线对转染细胞有协同杀伤作用。     

阳离子脂质体介导TIMP-3基因对兔血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响

目的：通过阳离子脂质体介导含有TIMP-3基因的质粒转染体外兔平滑肌细胞，观察瞬时表达的TIMP-3对细胞增殖及凋亡的影响。方法：构建兔TIMP-3基因质粒表达载体。按照正常对照组、空质粒组、重组质粒载体组将72孔兔血管平滑肌细胞分为3组，每组又分为24、48、72h 3个亚组。阳离子脂质体介导质粒分别转染相应组细胞，正常对照组无质粒加入。转染后进行细胞计数，描绘生长曲线；将24孔细胞分为3组进行基因转染，转染后48h检测细胞凋亡率。结果：正常对照组细胞数、细胞凋亡率与空质粒组相比均无明显差别；重组质粒组细胞数与前二者相比明显减少（P〈0．05），重组质粒组细胞凋亡率均明显高于前二者（P〈0．05）。结论：TIMP-3对体外血管平滑肌细胞具有明显抑制增值及促进细胞凋亡的作用；阳离子脂质体作为新型、高效转染介质对细胞生长无明显不良反应，使用安全，应用于TIMP-3基因治疗支架后再狭窄前景广阔。     

阳离子脂质体介导的基因转移机制

背景：与病毒载体相比,许多天然与合成的阳离子类脂以脂质体的形式用于基因转移,具有无免疫原性、易生产、质粒免受核酸酶降解和无致瘤性等优点,并且作为病毒载体的有效替代物,阳离子脂质体能用于细胞的体内和体外转染。 目的：介绍阳离子脂质体介导的基因转移机制研究进展。 方法：由第一作者用计算机检索中国期刊全文数据库(CNKI：1987/2010)和PubMed (1987/2010)数据库,检索词分别为“基因治疗、阳离子脂质体、基因转移、机制”和“gene therapy, cationic liposome, gene transfer, mechanism”,语言分别设定为中文和英文。从阳离子脂质体基因转染和基因转移机制进行总结,综述了阳离子脂质体介导的基因转移机制。 结果与结论：共检索到108篇,按纳入和排除标准对文献进行筛选,共纳入20篇文章。综述了阳离子脂质体介导的基因转移机制,包括阳离子脂质体/DNA复合物的形成、细胞吸收、内含体释放和复合物解体以及细胞核摄入等方面的研究内容。结果提示,对类脂构效关系和基因转移机制的研究,是提高阳离子脂质体转染效率和优化基因治疗的关键。